森林是陆地生态系统的主体之一，具有最高生物生产力，维持着地球上的生命活动. 目前，森林健康问题引起了世界各国的广泛关注. 土壤作为森林生长必不可少的介质，其健康一定程度上决定了森林健康^[1]，加之，土壤微生物、 土壤酶是土壤生态系统的重要部分，共同推动着物质转化和养分循环，是土壤健康或土壤质量的评价指标^{[2, 3]}. 然而大部分土壤微生物是进行分离培养，研究其群落结构较困难，近年来磷脂脂肪酸(phospholipid-derived fatty acids，PLFA)作为微生物的生物标记用于鉴定微生物种类和识别微生物类群^{[4, 5]}，被广泛应用于土壤微生物生态学和地理学等研究领域^[6]，PLFA是所有活体细胞膜的主要成分^[7]，占微生物膜的50%~98%，不同的土壤微生物有不同的PLFA特征^{[8, 9, 10]}. 在同一林分中，海拔增加能改变林下植被组成、 结构、 土壤温度、 水分、 养分及微生物活性等众多因素，从而影响土壤微生物PLFA多样性^[11]. 关于土壤微生物PLFA结构及多样性随海拔梯度的变化在其他地区已有较多研究，如张于光等^[12]、 Wang等^[13]、 吴则焰等^[14]、 张地等^[15]分别研究了神农架、 云南老君山、 武夷山及北京东灵山等地不同海拔土壤微生物群落结构变化规律，但不同研究区域差异较大，且涉及耐瘠薄、 涵养水源为主的马尾松林与以采果为主的柑橘林土壤微生物PLFA沿海拔变化的相关研究报道较少，特别是利用生态学分析方法研究两种林分随海拔增加土壤微生物PLFA变化的报道鲜见.

因此，本文以亚热带缙云山为研究基地，选择马尾松林(masson pine)和柑橘林(citrus forest)土壤为研究对象，探讨海拔增加土壤微生物PLFA的变化及其对不同林分的响应，以期为评价森林生态安全、 保护生物多样性和可持续发展林业提供科学依据.

缙云山自然保护区(106°22′E、 29°45′N)位于重庆市北碚区境内. 属典型的亚热带季风性气候，平均气温13.6℃，年平均相对湿度87%，年平均降雨量1161.8 mm，干湿季分明，雨季是4~9月(降雨量1243.8 mm)，7~8月是伏旱期(蒸发量255.4 mm)，土壤为酸性黄壤.

2014年11月，在确定的马尾松林和柑橘林每个海拔上随机选择3块面积为20 m×20 m的标准样地，在标准样地中按照“W”字型各设置5个1 m×1 m的小样地，每个小样地中随机选择1个采样点，采集0~20 cm深度的土样，混匀5个小样地土样. 当天带回实验室，除去动植物残体，过2 mm筛，储存在4℃用于测定PLFA. 两林分基本情况见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 马尾松林、 柑橘林在不同海拔高度的林分特征1) Table 1 Stand characteristics of masson pine and citrus forest under different altitudes 林型 海拔/m 优势种 林龄/a 平均胸径(地径)/cm 平均树高/m 乔木郁闭度/% 草本郁闭度/% Ф表示胸径，D表示地径 马尾松林 432 马尾松 45 Ф19.1 13.8 80 40 467 马尾松 45 Ф18.6 14.5 80 45 491 马尾松 45 Ф18.9 14.1 80 50 柑橘林 315 柑橘 43 D14.2 4.3 65 90 362 柑橘 43 D14.2 4.3 65 96 405 柑橘 43 D14.2 4.3 65 96

表 1 马尾松林、柑橘林在不同海拔高度的林分特征1) Table 1 Stand characteristics of masson pine and citrus forest under different altitudes

磷脂脂肪酸采用修正的Bligh-Dyer方法^[8]，称取相当于8 g干土的新鲜土样，用混合浸提液(氯仿 ∶甲醇 ∶缓冲液=2 ∶1 ∶0.8)提取脂类，用柱层析法分离得到磷酯脂肪酸，然后经甲酯化后用Aligent 6850气相色谱仪分析各种脂肪酸(C5~C20)的含量，以正十九烷脂肪酸甲酯内标物进行定量计算. 各成分脂肪酸通过MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version6.1,MIDI,Inc.,Newark,DE)进行，标准品购于美国MIDI公司的C9~C20的脂肪酸甲酯.

脲酶(Ure)测定用靛酚比色法; 转化酶(Ive)测定用3,5-二硝基水杨酸比色法; H₂O₂酶(CAT)测定用KMnO₄滴定法; 酸性磷酸酶(ACP)测定用磷酸苯二钠法^[16]. 采用紫外可见分光光度计进行测定(仪器型号：UV-5200).

数据分析使用SPSS 18.0、 Origin 9.2、 Microsoft Excel 2003等软件，采用单因素方差分析法(LSD)比较不同数据组间的差异(P＜0.05)，用主成分分析法(PCA)来综合评价两林分土壤PLFA.

磷脂脂肪酸含量计算公式：

式中，A和SA分别为样品和标准物质的峰面积，S₁为标准物质的浓度(ng ·μL^-1)，D为稀释倍数，R为分取倍数，V为样品的测定体积(μL)，W为烘干土壤质量(g).

根据脂肪酸含量和种类计算丰富度指数(R)^{[17, 18]}、 Shannon多样性指数(H′)^{[18, 19]}、 Pielou均匀度(J)^{[17, 18]}来评价微生物多样性，公式如下：

R=S

J=H′/ln S

式中，P_i=N_i/N，N_i为i类脂肪酸个数，N为该实验中总脂肪酸个数，S为微生物群落中总脂肪酸种类，即丰富度.

脂肪酸采用Frostegard^[20]方法命名：分子式用“X：YωZ(c/t)”表示，“X”表示脂肪酸分子的碳原子总数，“Y”表示不饱和烯键的数目，“ω”代表双键的位置(从羧基端算起)，“Z”为烯键或环丙烷链的位置，“c”和“t”分别表示顺式和反式同分异构体. “i”(iso)表示顺式甲基支链，“a”(anteiso)表示反式甲基支链，Me表示甲基位置，cy表示环丙基支链，“OH”前的数字表示羟基位置.

6个海拔土壤共检测出48种磷脂脂肪酸(图 1)，马尾松林和柑橘林土壤PLFA种类差异较大，分别为34种和45种，各海拔均以16:0含量最高，16:0、 i15:0、 i16:0、 18:1ω9c和cy19:0ω8c的总和占总脂肪酸的40%以上. 由表 2可知，两种土壤中直链饱和PLFA占总PLFA的40%~48%，而其余PLFA类型仅占总PLFA的11%左右，其中海拔432m的环丙烷PLFA含量最低，仅占11.38%，且与其他海拔差异显著.

图 1

Fig. 1

图 1 马尾松林、柑橘林在不同海拔上的土壤微生物PLFA的图谱 Fig. 1 Soil microbial PLFA profiles of masson pine and citrus forest under different altitudes

表 2(Table 2)

表 2 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上土壤PLFA类型及其含量(平均值±SD)/nmol ·g-1 Table 2 Types and content of soil microbial PLFA of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD)/nmol ·g-1 PLFA /nmol·g -1 马尾松林 柑橘林 432 467 491 315 362 405 直链饱和PLFA 2.913±0.184 2.968±0.120 3.027±0.153 5.205±0.806 3.950±0.219 4.200±0.544 直链单不饱和PLFA 0.813±0.064 0.900±0.091 0.857±0.090 2.018±0.216 1.503±0.494 1.550±0.353 支链饱和PLFA 0.815±0.071 0.978±0.049 0.853±0.068 1.943±0.081 1.560±0.007 1.550±0.155 多不饱和PLFA 0.813±0.053 0.900±0.082 0.857±0.035 1.990±0.075 1.503±0.494 1.518±0.350 环丙烷PLFA 0.808±0.092 0.900±0.021 0.897±0.012 1.433±0.028 1.273±0.494 1.433±0.190

表 2 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上土壤PLFA类型及其含量(平均值±SD)/nmol ·g-1 Table 2 Types and content of soil microbial PLFA of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD)/nmol ·g-1

不同林分土壤PLFA含量随海拔的增加变化趋势不同，两林分总PLFA含量在不同海拔间差异均显著，马尾松林总PLFA含量随海拔升高而增加，而柑橘林总PLFA随海拔则表现出先减后增的趋势. 由表 3可知，各海拔细菌分布量最大，其次是真菌，放线菌分布量最低. 马尾松林土壤细菌、 真菌、 放线菌、 G^-和G⁺随海拔均表现出先增后减的规律; 柑橘林土壤细菌、 放线菌和G⁺随海拔升高而减小，真菌和G^-随海拔则先减小后增加，且柑橘林各类型土壤微生物PLFA含量均比马尾松林高出2倍以上.

表 3(Table 3)

表 3 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上的土壤特征磷脂脂肪酸含量 (平均值±SD)/nmol ·g-1 Table 3 Soil microbial PLFA of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD)/nmol ·g-1 类型 马尾松林 柑橘林 432 467 491 315 362 405 细菌 3.213±0.014 3.753±0.205 3.560±0.141 7.748±0.197 6.530±0.014 6.503±0.325 真菌 0.730±0.120 0.763±0.014 0.727±0.089 1.355±0.048 0.875±0.066 0.973±0.067 放线菌 0.168±0.035 0.198±0.126 0.130±0.007 0.668±0.021 0.543±0.014 0.540±0.002 G - 2.118±0.311 2.383±0.049 2.360±0.042 4.838±0.071 3.795±0.585 4.160±0.022 G + 1.870±0.120 2.250±0.155 2.113±0.238 4.933±0.077 4.005±0.098 3.823±0.025 总PLFA 8.903±0.453 9.338±0.219 9.427±0.605 18.230±0.537 14.328±0.615 14.800±0.077

表 3 马尾松林、柑橘林在不同海拔上的土壤特征磷脂脂肪酸含量 (平均值±SD)/nmol ·g-1 Table 3 Soil microbial PLFA of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD)/nmol ·g-1

总体上，两林分土壤微生物群落多样性随海拔的增加变化不一(表 4). 马尾松林低海拔丰富度指数(S)显著高于高海拔，多样性指数(H′)、 均匀度指数(J)则随海拔升高先减小后增加; 柑橘林丰富度指数、 多样性指数随海拔升高而先减小后增加，均匀度指数随海拔升高而升高. 柑橘林土壤微生物群落的丰富度、 多样性、 均匀度等指标均显著高于马尾松林.

表 4(Table 4)

表 4 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上的土壤微生物多样性指数比较 1)(平均值±SD) Table 4 Soil microbial diversity indices of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD) 林型 海拔/m 丰富度指数 (S) Shannon多样性指数 (H′) Pielou均匀度 (J) 1)小写字母不同表示差异显著 马尾松林 432 34 3.059±0.012(a) 0.867±0.003(a) 467 31 2.791±0.031(c) 0.813±0.009(c) 491 31 2.803±0.010(b) 0.816±0.003(b) 柑橘林 315 45 3.351±0.019(b) 0.880±0.005(a) 362 38 3.294±0.044(a) 0.906±0.120(b) 405 41 3.378±0.021(c) 0.910±0.006(c)

表 4 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上的土壤微生物多样性指数比较 1)(平均值±SD) Table 4 Soil microbial diversity indices of masson pine and citrus forest under different altitudes(mean±SD)

两林分供试土壤磷脂脂肪酸均仅由PC1和PC2两个类型组成(图 2). 马尾松林中PC1主要由直链饱和脂肪酸、 直链单不饱和脂肪酸、 支链饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸组成，占微生物群落结构变异的53.61%，其中13:0、 i14:0、 14:1ω5c、 i16:0、 10 Me17:0、 10Me18:0 TBSA、 18:1ω9c含量较高，总和占PC1的58.34%; PC2中较高的脂肪酸为18:0、 a17:0、 i17:0等3种，总和占PC2的38.20%. 柑橘林中PC1主要由直链饱和脂肪酸、 支链饱和脂肪酸、 多不饱和脂肪酸以及环丙烷脂肪酸组成，总量占微生物群落结构组成变异的32%，其中16:0、 18:0、 a15:0、 i15:0、 a16:0、 i16:0、 16:12OH、 16:1ω5c、 16:1ω7c/16:1ω6c或16:1ω6c/16:1ω7c、 10Me17:0、 i17:0、 10Me18:0 TBSA、 20:4ω6,9,12,15c、 18:2ω6,9c/18:0ante或18:0ante/18:2ω6,9c含量较高，总和占PC1的69.77%; PC2含量较高的为17:0、 10:0 2OH、 a12:0、 cy19:0ω8c、 17:1ω8c、 11Me18:1ω7c、 i17:1ω9c或10Me16:0，占PC2的51.67%.

图 2

Fig. 2

图 2 马尾松林、柑橘林土壤PLFA的主成分分析 Fig. 2 Principal component analysis of PLFA in the soil of masson pine and citrus forest

柑橘林土壤Ure、 Ive、 CAT及ACP酶活性显著高于马尾松林(图 3). 马尾松林土壤CAT酶活性随海拔升高而降低，土壤Ure和Ive酶活性最高均在海拔467 m，最低则在海拔491 m; 而土壤ACP酶活性随海拔变化依次为467 m[(3.767±0.224)mg ·g^-1]＜432 m[(4.226±0.307)mg ·g^-1]＜491 m[(4.898±0.507)mg ·g^-1]. 柑橘林土壤Ive、 CAT和ACP酶活性均随海拔升高而降低，Ive、 CAT和ACP酶活性在海拔315 m时最高，值分别为(12.364±0.308)、 (41.197±1.308)、 (6.022±0.129)mg ·g^-1，其次是海拔362 m，为(10.824±0.459)、 (38.455±1.459)、 (5.668±0.267)mg ·g^-1，酶活性最低的是海拔405 m，为(9.561±0.708)、 (38.381±0.708)、(5.151±0.112)mg ·g^-1. Ure酶活性在海拔315 m和海拔362 m均为1.685 mg ·g^-1，在海拔405为(1.629±0.070)mg ·g^-1.

图 3

Fig. 3

不同小写字母表示同一种酶在不同海拔间在0.05水平上差异性; 脲酶(Ure)以24 h后1 g土壤中生成NH3-N的毫克数表示; 转化酶(Ive)以24 h后1 g土壤生成葡萄糖的毫克数表示; H2O2酶(CAT)以20 min后1 g土壤消耗的0.2 mol ·L-1 KMnO4的毫升数表示; 酸性磷酸酶(ACP)以24 h后1 g土壤中释放出的酚的毫克数表示图 3 马尾松林、 柑橘林在不同海拔上的土壤Ure、Ive、CAT 及ACP酶活性Fig. 3 Comparisons of Ure、Ive、CAT and ACP of masson pine and citrus forest under different altitudes

由表 5可知，细菌、 放线菌、 G^-及G⁺与Ure、 Ive、 CAT、 林分均呈极显著正相关，真菌与Ure、 Ive、 CAT呈显著正相关; 而海拔与放线菌呈极显著负相关，与细菌、 真菌、 G^-及G⁺呈显著负相关; CAP与土壤微生物PLFA无显著性相关关系.

表 5(Table 5)

表 5 马尾松林、 柑橘林土壤微生物PLFA特性与土壤酶活性、 环境因子的相关系数 Table 5 Correlation coefficients among soil microbial,soil enzyme activity and environment factors of masson pine and citrus forest Ure Ive CAT ACP 海拔 林分 1)显著性水平：*表示P＜0.05,**表示P＜0.01(Person); Ure: urease，脲酶; Ive:invertase，转化酶(蔗糖酶); CAT: catalase activity，过氧化氢酶; ACP: acid phosphatase，酸性磷酸酶 细菌 0.975 ** 0.958 ** 0.991 ** 0.522 -0.899 * 0.968 ** 真菌 0.857 * 0.813 * 0.835 * 0.505 -0.858 * 0.745 放线菌 0.985 ** 0.967 ** 0.997 ** 0.551 -0.923 ** 0.976 ** G - 0.956 ** 0.936 ** 0.977 ** 0.548 -0.880 * 0.955 ** G + 0.978 ** 0.960 ** 0.985 ** 0.524 -0.914 * 0.949 **

表 5 马尾松林、 柑橘林土壤微生物PLFA特性与土壤酶活性、 环境因子的相关系数 Table 5 Correlation coefficients among soil microbial,soil enzyme activity and environment factors of masson pine and citrus forest

土壤微生物在土壤中所占比例小却十分活跃，它在土壤生态系统碳氮循环、 养分循环及调节植物生产力和多样性中起重要作用^{[21, 22]}. 而土壤微生物种类、 数量及群落结构易受土壤成分、 土壤质地、 水分和气候等^{[23, 24]}诸多环境因素影响. 植被类型显著影响微生物生长和功能^{[25, 26]}，植被不同其根际分泌物不同亦可造成土壤微生物PLFA含量和多样性的差异^[14]. 本实验中柑橘林土壤各类型微生物PLFA含量均高于马尾松林，多样性亦优于马尾松林. 由于植物群落的种类和结构不同，改变了有机质输入量，明显影响了土壤质量^[6]. 在柑橘林地中，柑橘树普遍低矮，树种间良好的光、 水、 热、 风等环境条件促进了土壤微生物生长，加快了表层土有机质分解速度，因此使柑橘林土壤PLFA含量及多样性优于马尾松林. 王卫霞等^[27]在研究南亚热带格木、 红椎和马尾松人工林时也得出了相似的结论. 由此可见，植物组成显著影响土壤微生物群落和结构.

此外，海拔梯度改变了土壤理化性质、 植被组成及结构和环境条件等诸多自然因子，这些因子显著影响土壤微生物群落结构^[28]. 随海拔高度的升高，土壤微生物PLFA表现出不同的分布格局，有的随海拔增加呈“单峰”现象^[12]，有的单调递增^[13]或递减^[14]，有的则无明显规律^[15]. 研究区域不同得到的结果不一致. 本实验马尾松林真菌、 细菌、 放线菌、 G^-及G⁺随海拔先升高后降低呈“单峰”现象，最大值均出现在海拔467 m，而微生物多样性指数则在海拔432 m时种类最多分布最均匀，这可能与采样点的空间异质性较大有关，高海拔与低海拔间土壤PLFA差异显著，本研究结果与Wang等^[13]的研究结果相一致，但与张于光等^[12]、 吴则焰等^[14]的研究结果相异，可能与地理位置有关; 柑橘林土壤中总PLFA、 真菌及G^-随海拔先下降后上升呈“单峰”模式，而细菌、 放线菌、 G⁺随海拔单调递减，前一点与张于光等^[12]的研究结果一致而后一点与其相悖，这可能与研究区域有关，研究对象不同，有机质输入量、 环境温度等不同导致研究结果不一致. 柑橘树较矮，较大的林下空隙利于雨水和风等自然力的流动，这使低海拔聚集较多的枯落物，同时光、 热、 水、 通气条件较好，促进了微生物生长与代谢，增加了微生物活性与数量. 由此可见，缙云山土壤微生物群落含量及功能多样性在一定程度上受海拔梯度的影响.

土壤酶参与并影响土壤中一系列生化反应，且在物质循环和能量流动等过程中最为活跃，其活性高低反映了土壤生物活性和土壤生化反应强度，因此常被用作土壤质量的评价指标^[29]. 总体上，两林分随海拔增加变化明显，柑橘林土壤酶活性随海拔升高而降低，与陈双林等^[30]在研究毛竹林土壤中的研究结论不一致，可能与植被类型有关，柑橘林较毛竹林郁闭度低，光照和空气等更充足，优良的环境条件使微生物大量繁殖，代谢旺盛，分解速度和呼吸速度加快而聚集了较高的土壤酶活性，使得土壤CAT、 Ure、 Ive和ACP活性随海拔升高表现出显著差异. 马尾松林中土壤CAT、 Ure、 Ive和ACP活性变化规律不一致，CAT随海拔升高而升高，ACP则随海拔升高而降低，高海拔CAT和ACP活性显著高于低海拔，而低海拔的Ure和Ive活性却显著高于高海拔，后一点与Kautz等^[31]不一致，这可能与海拔、 植被、 土壤质地等因子有关.

土壤微生物与土壤酶活性有着复杂的联系，不能简单地说任何土壤微生物数量与土壤酶都呈正相关或者负相关，研究结果会随着植被、 气候和研究区域等不同而不同^{[31, 32, 33, 34]}. 文都日乐等^[35]在研究呼伦贝尔不同草地类型时发现土壤真菌与ACP和Ive呈极显著正相关，细菌PLFA、 放线菌PLFA与CAT呈极显著正相关; 放线菌PLFA与Ure呈显著正相关. 陈汝等^[36]在研究苹果砧木根际土壤时发现细菌PLFA与Ure呈极显著正相关，而与Ive和ACP呈显著正相关. 龙妍^[37]在研究葡萄园土壤时发现土壤细菌PLFA、 真菌PLFA和放线菌PLFA均与Ure、 Ive及ACP呈极显著正相关，与CAT负相关但未达到显著水平. 本研究中，细菌、 放线菌、 G^-及G⁺与Ure、 Ive、 CAT、 林分均呈极显著正相关，真菌与Ure、 Ive、 CAT呈显著正相关; 而细菌、 真菌、 放线菌、 G^-及G⁺与海拔呈极显著或显著负相关. 表明Ure、 Ive、 CAT、 林分及海拔是驱动微生物群落差异的主要因子. 由此说明影响土壤微生物群落功能多样性的主要因素可能与Ure、 Ive、 CAT、 林分及海拔等因素密切相关.

(1)柑橘林土壤PLFA含量及功能多样性显著高于马尾松林，且两林分各海拔间细菌、 真菌、 放线菌、 G^-及G⁺含量差异显著，其中i16:0、 10Me17:0、 10Me18:0 TBSA是两林分含量最高且共有的脂肪酸且i16:0高达15.26%.

(2)柑橘林土壤中，低海拔CAT、 Ure、 Ive和ACP活性显著高于高海拔土壤酶活性; 马尾松林土壤CAT随海拔升高而升高，Ure、 Ive和ACP无明显变化规律，但高海拔CAT和ACP活性显著高于低海拔，而高海拔的Ure和Ive活性显著低于低海拔.

(3)柑橘林与马尾松林细菌、 放线菌、 G^-及G⁺与Ure、 Ive、 CAT、 林分均呈极显著正相关，真菌与Ure、 Ive、 CAT呈显著正相关; 而细菌、 真菌、 放线菌、 G^-及G⁺与海拔呈极显著或显著负相关.