2015, Vol. 36
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
类固醇激素(steroidal hormone)是一类常见的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting compounds,EDCs)，包括类固醇雌激素如：雌酮(estrone,E1)、 雌二醇(17β-estradiol,E2)、 雌三醇(estriol,E3)和乙炔基雌二醇(17β-ethynylestradiol,EE2); 以及类固醇雄激素如：睾酮(testosterone,T)等，由于其在ng ·L-1作用下即可干扰水生生物内分泌系统而被广泛关注[1, 2, 3, 4]. 污水处理厂的出水中所含有的未完全去除的类固醇激素是天然水体中这类污染物的主要来源[5, 6]，微生物降解作用被认为是环境中类固醇激素类化合物的主要去除机制[7, 8]，以往研究从不同受污染环境中分离纯化出类固醇激素降解菌如污水处理厂[9, 10, 11]、 人工湿地[12]、 土壤[13]或是沙质含水层[14]. 靠近污水处理厂排放口的海洋环境也受到了不同程度的污染. 近年来海洋沉积物以及海水中多种类固醇激素被检出[15, 16]，然而关于海水类固醇激素降解菌的分离纯化鲜有报道，耐盐菌株对类固醇激素的降解特性和途径还尚未明确.
本研究通过人工咸水湖中分离纯化的1株耐盐交替赤杆菌属菌株MH-B5对类固醇激素的降解特性以及其对睾酮代谢产物分析从而推测可能代谢途径，制备并应用MH-B5固定化微生物颗粒降解雌二醇，以期为咸水环境类固醇激素污染的修复提供技术支持.
1 材料与方法 1.1 材料菌株分离自厦门筼筜湖咸水湖水样. 培养基选用216L培养基和陈海水，见文献[17]. 主要试剂：类固醇激素：E1、 E2、 E3、 EE2和T分别购自Sigma公司(纯度均大于99%); 降解产物标准样品：宝丹酮(1-Dehydrotestosterone,DHT,99%)和4-雄烯二酮(4-androstenedione,AD,99%)分别购自Dr. Ehrenstorfer公司; 实验中所用试剂均采用色谱纯级别.
1.2 菌株鉴定 1.2.1 16S rRNA基因序列分析及系统发育树构建应用单菌落PCR 法，选用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增得到菌株MH-B5的16S rRNA基因全长序列. PCR反应条件：94℃ 预变性10 min，30个循环(94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s)，最终72℃延伸10 min. 所得序列均由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序. 测序结果在NCBI(http: www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)进行blast分析，并通过软件DNAMAN(Version 4.0)对扩增序列和GenBank中近缘种的序列进行比对,然后用软件MEGA(Version 6.0)构建系统发育树.
1.2.2 pH与盐度对菌株MH-B5的生长影响菌株MH-B5接种于216L培养基，30℃，150 r ·min-1振荡培养24 h 作为种子液使用. 分别准备两组各10支试管，配备不同的pH和盐度梯度的216L培养基，分别取200 μL不同条件的培养基溶液于96孔板中，每孔接入10 μL的MH-B5菌株种子液. 每个pH梯度和盐度分别做3组平行. 完成后将96孔板使用全自动生长曲线分析仪(FP-1100-C,上海谓载商贸有限公司)，37℃，静置培养4 d，每间隔30 min对每孔菌液进行600 nm下的光密度测量(测定前系统自动振荡摇匀，转速为200 r ·min-1)，自动绘制生长曲线，以测定MH-B5菌株的pH和盐度生长范围. 设置系列pH从4.5~10的梯度，每0.5为一个划分单位，共12组，设置系列盐度梯度0~9%范围，每1.0%为一个划分单位，共10组.
1.3 降解特性分析陈海水经0.45 μm滤膜过滤并灭菌后待用. 单一目标污染物(E2、 E3、 EE2或T)分别加入陈海水中配制终浓度为2 mg ·L-1的陈海水类固醇激素培养基. 分别取 200 mL陈海水类固醇激素培养基进行批次实验，各批次实验体系中初始D600值为0.1，30℃、 150 r ·min-1好氧培养，取0、 3、 6、 9、 12、 24 h样品经液液萃取后待定量分析. 固定化微生物颗粒降解实验中等量固定化微生物代替游离菌液使得降解体系初始D600值为0.1.
样品中类固醇激素浓度由高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC，UitiMate 3000，美国戴安公司)进行定量分析. 色谱柱为C18柱(3.050 mm,2.2 μm，Thermo)，梯度洗脱方法程序为流动相：A相为水，B相为乙腈; 流速0.5 mL ·min-1; 梯度洗脱程序：B相初始比例为22%，保持2 min，第3 min时升为42%，再保持1.5min，第7min时升为45%，第8 min时升为55%，保持0.5 min，第8.7 min时降至22%.
1.4 睾酮代谢产物分析方法批次降解T实验条件下取得样品经预处理后利用超高压液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)串联四级杆飞行时间质谱(quadrupole time-of-flight mass spectrometry,Q-TOF-MS)分析方法对 T 代谢产物进行定性分析. 由检测到的代谢产物推测菌株MH-B5对 T 的降解途径.
超高压液相色谱(Ultimate3000,Waters，USA)应用Waters C18 柱(Acquity UPLC BEH C18,2.1×100 mm,1.7 μm)，流速为0.5 mL ·min-1，流动相选用A相：3% 甲酸水； B相：甲醇，对目标样品中的代谢产物进行分离. 串联四级杆飞行时间质谱(microTOF-Q Ⅱ，Bruker,Germany)在正离子模式下，应用毛细管电压3 kV，碰撞能量10 eV. 对比睾酮已知降解产物的标准样品，推测Altererythrobacter sp. MH-B5降解T的产物以及其降解途径.
1.5 固定化方法 1.5.1 菌悬液制备将菌株MH-B5接种到灭菌后的216 L培养基中于30℃、 150 r ·min-1的恒温振荡培养箱中培养至对数期，并将所得菌液转移至50 mL 离心管中，9 000 r ·min-1,4℃离心 10 min，弃除上清液后无菌水稀释成菌悬液，待用.
1.5.2 单一载体固定化方法单一载体固定化微生物选用三乙酸纤维素作为固定化载体，具体制备方法参见文献[18]. 固定化微生物载体与菌悬液充分搅拌混匀后于甲苯溶液中交联硬化，在通风橱中置放20 h，将成型后的固定化微生物裁剪为1 cm×1 cm，平均厚度为0.3 cm的片状待用. 用等量无菌水代替菌悬液制备空白组固定化微生物.
1.5.3 复合载体固定化方法复合载体固定化方法采用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、 海藻酸钠(sodium alginate,SA)和高岭土(Kaolin)作为固定化微生物载体，具体制备方法参见文献[19]. 固定化微生物载体与菌悬液充分混匀之后于硼酸-氯化钙溶液中交联形成凝胶小球. 用等量无菌水代替菌悬液制备空白对照组小球.
2 结果与分析 2.1 菌株16S rRNA基因序列分析扩增菌株MH-B5的 16S rRNA基因，测序后进行同源性分析(图 1). GenBank中的序列登录号为JQ723700. 同GenBank中的基因序列进行同源性比对分析结果表明，该菌株与交替赤杆菌属Altererythrobacter xinjiangensis S3-63T[20]的16S rRNA相似度最高，为96.63%. 同时测序结果与EZ biocloud数据库[21]比对，菌株MH-B5与交替赤杆菌属中其它13个种的模式菌株的相似度范围为93.0％~96.3％.
 | 图 1 基于16S rRNA序列的菌株Altererythrobacter sp. MH-B5系统发育树(邻接法) Fig. 1Phylogenetic tree of Altererythrobacter sp. MH-B5 based on 16S rRNA using the neighbor-joining method |
菌株Altererythrobacter sp. MH-B5在不同初始pH条件下的生长曲线(图 2)显示，其pH耐受范围较宽，在 pH 5.5~9.0范围内均可以生长. 在初始pH 5.5时，经过相对较长时间的延滞期后能够生长; 在起始pH 6.0~8.5范围内，该菌可以正常生长，且生长速率较快，24 h进入稳定生长期.
 | 图 2 菌株Altererythrobacter sp. MH-B5在不同起始pH条件下的生长曲线 Fig. 2Effect of pH on the growth of Altererythrobacter sp. MH-B5 |
菌株Altererythrobacter sp. MH-B5在不同初始盐度梯度条件下的生长曲线(图 3)显示，其盐度耐受范围广，在0~7%范围内均可以生长. 盐度为6%~7%时，菌株经过近 24 h延滞期后能够生长; 盐度范围在 1%~4%内，该菌生长良好，且生长速率较快，18 h进入稳定生长期.
 | 图 3菌株Altererythrobacter sp. MH-B5在不同起始盐度条件下的生长曲线 Fig. 3Effect of salinity on the growth of Altererythrobacter sp. MH-B5 |
Altererythrobacter sp. MH-B5经富集培养后接种至含有E2、 E3、 EE2和T的无菌陈海水中进行降解能力实验. 实验结果(图 4)表明,Altererythrobacter sp. MH-B5对雄激素T和天然雌激素E2、 E3以及E2初级代谢产物E1有较强的降解能力，而对人工合成类固醇激素EE2无降解能力. 实验过程中对照组浓度无明显变化.
 | 图 4Altererythrobacter sp. MH-B5对常见类固醇激素的降解曲线 Fig. 4 Biodegradation of common steroid hormones by Altererythrobacter sp. MH-B5 |
Altererythrobacter sp. MH-B5对E2的降解结果如图 4(a) 所示，该菌在3 h 时将2 mg ·L-1，200 mL陈海水体系中的E2完全降解，与此同时降解体系中检测到了E2的初级代谢产物E1. E1的浓度随着反应时间的延续而降低，在 24 h 时被全部降解.
Altererythrobacter sp. MH-B5对E3同样具有降解能力 [图 4(b)]，在降解实验前8 h该菌对E3的降解效率较快，之后降解速率放缓，24 h 时去除效率达100%. 实验过程中无其他产物被检测到. 该菌对 T 的降解特性与 E3 类似，24 h 之内可将2 mg ·L-1，200 mL陈海水体系中的T完全降解.
2.4 菌株MH-B5对T降解途径分析将Altererythrobacter sp. MH-B5接种至含有 2 mg ·L-1 T的陈海水培养基中，恒温摇床(150 r ·min-1,30℃)培养6 h 后的样品经UPLC-Q/TOF-MS检测，发现 4 种物质峰如图 5所示. 根据睾酮代谢产物标准样品的保留时间和特征离子推测样品中物质峰分别为：ADD、 DHT、 AD和T这4种物质(表 1).
 | (a)色谱图和(b)质谱图 图 5T降解产物LC-Q/TOF-MS提取离子色谱图和质谱图 Fig. 5 Extracted ion and mass chromatograms obtained by LC-Q/TOF-MS analysis of testosterone biodegradation |
| 表 1 推测Altererythrobacter sp. MH-B5降解T的代谢产物 Table 1 Proposed metabolites of testosterone biodegradation by Altererythrobacter sp. MH-B5 |
应用复合载体和单一载体两种方法分别制备Altererythrobacter sp. MH-B5固定化微生物颗粒，并验证两种不同载体的固定化微生物颗粒对E2的降解能力，实验结果表明Altererythrobacter sp. MH-B5经固定化包埋后仍然可以降解E2及其代谢产物E1.
复合载体固定化微生物颗粒降解E2的实验结果如图 6(a)所示，在0~8 h过程中，E2浓度迅速由2.16 mg ·L-1降至0.122 mg ·L-1，去除率达94.3%，24 h 内E2去除率达100%. 降解过程中检测到E1产生，其浓度在8 h 达到峰值而后急速下降，24 h 之内可被Altererythrobacter sp. MH-B5复合载体固定化微生物颗粒完全去除. 空白对照组中 E2 的浓度也降低了11.5%.
 | 图 6 Altererythrobacter sp. MH-B5固定化微生物颗粒对E2的降解曲线 Fig. 6Biodegradation of E2 by immobilized Altererythrobacter sp. MH-B5 |
单一载体固定化微生物颗粒对E2的降解结果[图 6(b)]显示72 h内 E2被完全去除. 降解过程中未检测到E1. 0~8 h过程中实验组与对照组对E2的去除率分别为 27.5% 和 20.6%; 8~72 h 实验组中的E2去除率逐渐上升直至完全降解，同时对照组中E2的浓度无明显下降.
3 讨论本研究从人工咸水湖中分离得到1株具有类固醇激素降解功能菌株 MH-B5，16S rRNA基因序列比对分析显示该菌株与交替赤杆菌属中的16个模式菌株相似度均低于新种阈值98.5%[22]，这一结果表明菌株MH-B5可能为交替赤杆菌属的一个新种. 目前已报道的类固醇激素海水降解菌Vibrio sp. H5[23]和Buttiauxella sp. S19-1[24]均属于γ-变形菌纲，与菌株MH-B5分类学进化地位差异大，见图 1. 同时耐盐菌株MH-B5与淡水环境中分离得到的具有类固醇激素降解能力的菌株如分离自活性污泥的Sphingomonas sp. KC8[11]亲缘关系较远.
生长特性测定结果显示在盐度为0时菌株有微弱生长，说明其在淡水环境中有生长可能性，这一特质可能由于菌株MH-B5分离自人工咸水湖，湖水的盐度从与入海口连接处到内湖依次递减. 菌株MH-B5在盐度梯度1%~4%范围内生长良好，适于海水及盐度梯度变化较大的入海口水域中生长.
降解实验证实Altererythrobacter sp. MH-B5对E2的降解过程中有E1产生，这一代降解特性与分离自淡水环境的类固醇雌激素降解菌类似[8]. 进一步的实验结果(数据未展示)表明该菌可利用E1为唯一碳源进行生长. E1作为E2的代谢产物仍然具有雌激素活性，单纯将E2转化为E1的微生物过程难以有效去除环境中类固醇激素污染. 隋倩等[25]研究结果指出E1是我国污水处理厂中需优先控制的4种内分泌干扰物之一. 因此菌株MH-B5对E2以及E2初级代谢产物E1的降解特性对于咸水环境中类固醇雌激素污染的修复具有一定的优越性.
Altererythrobacter sp. MH-B5对T降解过程中，通过LC-Q/TOF-MS结果检测到AD、 DHT和ADD这3种降解产物，从而推测菌株MH-B5对 T 的降解过程如图 7所示：T首先经过生物催化反应，在 3β/17β-OH羟基类固醇脱氢酶的作用下发生脱氢氧化反应生成AD (1-2,图 7) 和DHT(1-1，图 7). DHT和AD进一步被生物降解生成产物ADD(2和3，图 7). 研究中未发现其他降解产物，这可能是由于其他产物浓度过低所致. 睾酮的降解途径已被广泛报道，不同种类的微生物如：Corynebacteriumequi[26]和Rhodococcussp[27]等均可以将 ADD进一步转化为9α-OH-AD(4，图 7)，之后经过自发裂解等反应(5，图 7)，最终矿化成CO2和水. Yang等[28]利用从猪粪便中富集到的微生物对T的降解途径进行研究，检测到6种降解产物并推测T的生物降解途径，结果与本文相同.
 | 图 7Altererythrobacter sp. MH-B5对睾酮降解途径推测 Fig. 7Proposed catabolic pathway of testosterone degradation by Altererythrobacter sp. MH-B5 |
Altererythrobacter sp. MH-B5经两种不同方法进行固定化后仍然可以降解E2和其中间产物E1. 复合载体固定化微生物颗粒降解E2的速度较单一载体固定化微生物颗粒快，准一阶降解速率分别为0.228 5 h-1 (R2=0.879 3)和0.018 5 h-1 (R2=0.920 5)，这一结果可能由于被包埋微生物在固定化过程中的存活率，固定化之后微生物的活性以及固定化载体的传质效率不同而导致. 实验过程中发现单一载体固定化微生物较复合载体固定化微生物的机械强度高，具有重复使用过程中不易裂解的优势，这为分离纯化的类固醇降解菌在自然环境中的应用提供了可能. 然而对耐盐菌株进行固定化并研究其降解类固醇激素的降解属于首次报道，因此如何优化固定化微生物的制备条件提高其降解速率还需要更深入地研究.
4 结论从咸水湖中分离得到Altererythrobacter sp. MH-B5是1株对E1、 E2、 E3和T具有较高降解能力的耐盐菌株，并且是属于交替赤杆菌属的1株潜在新种. 其能降解天然雌激素和雄激素睾酮. 固定化微生物技术为受类固醇激素污染的咸水环境提供了潜在的生物修复方式.
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