多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)和砷是环境中普遍存在的有毒污染物，是我国第一批公布的68种优先控制污染物，同样被美国环保署列为优先级污染物，具有高毒性、 致癌、 致畸作用^[1]. 这两种污染物都会出现在木材生产厂^[2]、 燃气制造厂^[3]、 焦电厂^[4]、 采矿与冶金^[5]等工业企业场地及周边区域，它们的复合污染及危害问题已引起广泛关注^{[6, 7]}.

砷超富集植物蜈蚣草处于高砷环境中不被损伤且可从砷污染土壤中高量累积砷，并将砷区隔在羽叶部分的液泡中^[8]. 砷在环境中主要的存在形式是As(Ⅴ)，由于其化学结构类似于磷，它主要通过磷的运输通道吸收运输^[9]. 蜈蚣草通过As(Ⅴ)还原酶将As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)，这个过程中三价砷会与富硫醇基团的多肽类络合形成植物螯合态砷，并储存隔离在液泡中^[10].

PAHs作为一类非极性亲脂性有机化合物^[11]，由于其低水溶性特点导致其在环境中能够持久存在^{[12, 13]}，具有低水溶性、 低亨利定律常数、 高Kow(octanol-water partition coefficients)的物理化学性质，能够通过植物的根系吸收或是叶片的蜡质层进入植物体内，并最终进入食物链，影响人类健康. 芘(pyrene)是多环芳烃的一种，由4个苯环线性组合而成. 芘是中环多环芳烃的代表，辛醇水分配系数(lg Kow=5.22)高，水溶解度(S=0.135 mg ·L^-1)低，但易溶于乙醇、 二硫化碳、 乙醚、 苯和甲苯等有机溶剂.

本课题组前期研究发现，蜈蚣草能够耐受砷和多环芳烃^[14]，且砷、 菲共存显著影响蜈蚣草体内砷的赋存形态，添加砷可以改变蜈蚣草根部对菲的吸收，显著提高蜈蚣草地下部菲含量^[15]. 本研究以PAHs中环中最具有代表性的芘为目标物，探明砷-芘在蜈蚣草植株体内交互吸收与赋存的规律. 并采用双光子激光共聚焦扫描显微镜技术观察芘在蜈蚣草在组织细胞中分布和贮存信号，揭示其在细胞组织中的赋存规律，进一步解释PAHs和砷在超富集植物蜈蚣草中的生物化学行为和交互机制.

将采自湖南郴州市的蜈蚣草孢子均匀撒在播种盘基质中(花卉土 ∶蛭石=1 ∶1)，洒水保持湿润，覆薄膜保湿，置于温室内培育，室内昼间温度25℃，夜间温度20℃，湿度65%. 当孢子发育出数片幼叶时，分苗移栽到1/5强度的霍格兰营养液(pH=6.0)中进行培养. 4~5个月后，选取长势优良且相似的蜈蚣草苗备用.

实验共设计4组处理：空白对照、 单独砷、 芘、 芘加砷. 实验中砷选取砷酸钠，五价砷的配置浓度为10 mg ·L^-1，将芘单独溶解于丙酮有机试剂中，并添加到水培营养液中，使得芘浓度为2 mg ·L^-1. 每3 d换一次营养液，4个周期共12 d后将蜈蚣草收获. 将收获的蜈蚣草用清水洗净，自然晾干，将叶、 茎、 根部分开. 选取一部分蜈蚣草105℃杀青30 min，65°烘干24 h，用于蜈蚣草总砷测定. 剩余部分蜈蚣草冷冻干燥24 h，称量干重，冰浴磨碎-80℃冷藏，用于砷形态和芘的测定.

将烘干的植物样品采用HNO₃-HClO₄(US EPA 3050)方法消煮，定容稀释，原子荧光光度计(AFS-9130)测定植株各个部分总砷含量. 将冰浴磨碎后的蜈蚣草，用甲醇水(体积比1 ∶1)超声萃取3次，每次30 min，每15 min振荡一次. 将萃取液离心去除植物碎屑，萃取液旋转蒸发去除甲醇后，定容稀释，应用双道原子荧光光度计(AFS-LC-9130)测定砷形态^[15]. 用IC Anion PW阴离子交换色谱分离三价砷As(Ⅲ)，五价砷As(Ⅴ)，亚甲基砷酸盐MMA和甲基砷酸盐DMA，在pH=6.0条件下，用15 mmol ·L^-1 (NH₄)₂HPO₄作为流动相，流速为1.0 mL ·min^-1. 使用2% KBH₄和0.5% KOH为还原剂，7% HCl为载流. 高电倍增管负高压为290 V、 灯电流为100 mA、 载气流速为300 mL ·min^-1，屏蔽气流速为600 mL ·min^-1. 分析过程所用试剂均为优级纯，采用国家标准参比物质(GBW-07603)作为分析质量控制的标准，标样测定结果均在参比物质允许误差范围之内. 叶、 茎、 根部砷形态的提取效率分别为80.5%~83.8%、 79.9%~80.2%、 66.3%~77.9%.

将冰浴磨碎后的植物样品用丙酮和二氯甲烷混合溶液(1 ∶1，体积比)超声萃取3次，每次30 min，每15 min振荡一次. 将萃取液离心去除植物碎屑，取上层澄清液旋转蒸发浓缩至0.5 mL，转移到硅胶柱中净化，并用正己烷和二氯甲烷混合液淋洗，承接溶液旋蒸至约1 mL，加入7~8 mL正己烷，再次旋蒸至约0.5 mL，加内标、 定容至1 mL，利用GC-MS(Agilent6890)测定含量，(n=4,RSD<10.5)，回收率92%~98%.

将蜈蚣草样品用蒸馏水洗净，制作活体植物切片，中性树胶封片，应用双光子激光共焦扫描显微镜(Carl Zeiss LSM 780)观测. 物镜为W plan-Apochromat 20×/1.0 DIC(UV) VIS-IR M27 75 mm，设置激发波长为710 nm，发射波长为740 nm，检测波长为371~495 nm. 并定义红色为芘伪彩色信号，绿色为植物自身荧光信号.

数据采用SPSS 21.0(SPSS Inc,Chicago)软件进行方差分析与显著性分析，均值差的显著水平为0.05; 并用Origin 8.0软件绘制图表; 显微图片采用ZEN 2012 blue edition显微图像分析软件处理.

表 1为添加芘与砷处理下，蜈蚣草根部、 茎部、 叶部砷和芘的含量. 添加芘使得蜈蚣草各个部位砷含量均有不同程度的下降. 较未加芘处理，添加芘处理中叶部和茎部总砷下降幅度最大，达到35%左右，浓度分别下降了113.2 mg ·kg^-1、 71.35 mg ·kg^-1. 而芘对根部砷影响相对较小，砷的浓度下降了20.5%.

表 1(Table 1)

表 1 蜈蚣草各部分总砷和芘的含量1) Table 1 Concentrations of total arsenic and pyrene in different parts of P. vittata L. 处理组 叶 茎 根 总砷/mg·kg -1 芘/μg·kg -1 总砷/mg·kg -1 芘/μg·kg -1 总砷/mg·kg -1 芘/μg·kg -1 CK 0.087±0.04c — 0.053±0.01c — 0.017±0.006c — As 315±14.8a — 207±18.78a — 115±17.5a — PYR 0.033±0.02c 586±32.9A 0.05±0.01c 420±46.4B 0.04±0.01c 2272±137B PYR+As 202±13.8b 460±52.4B 136±7.65b 552±55.8A 91.4±6.36b 6304±396A 1) “—”表示忽略不计或未检出； 大、 小写字母代表列内各处理间的显著性差异(P<0.05)，相同字母为无显著性差异，相反为达到显著性差异

表 1 蜈蚣草各部分总砷和芘的含量1) Table 1 Concentrations of total arsenic and pyrene in different parts of P. vittata L.

蜈蚣草可通过根部吸收芘并运输至地上部位，根部对芘的吸收量(以DW计)最大，能够达到2.27 mg ·kg^-1，叶部与茎部芘的含量为420~586 μg ·kg^-1，是根部芘含量的18.5%~25.8%. 添加砷对蜈蚣草吸收芘有显著影响，提高了茎部与根部芘的赋存含量，而降低了叶部芘的含量. 与只加芘相比，添加砷后叶部芘的含量减少了21.5%，而添加砷后，根部芘的含量增加了4.032 mg ·kg^-1，提升了1.77倍，茎部芘含量提高了36.2%.

图 1为蜈蚣草各部分三价砷和五价砷的含量与比例分布. 与未添加芘处理相比，添加芘均使得叶、 茎、 根这3部分中三价砷和五价砷含量显著降低. 其中叶部三价砷与五价砷下降幅度最大，分别下降了42.2%和32.49%，而茎部和根部中三价砷和五价砷含量降低了36.8%~37.6%和26.2%~29.9%. 各部分中三价砷占总砷的比例略有下降，五价砷占总砷的比例略有升高，说明芘的添加可能对于蜈蚣草各部五价砷的还原能力有较小的抑制作用.

图 1

Fig. 1

图 1 蜈蚣草中三价砷和五价砷含量与比例 Fig. 1 Concentrations and proportions of As(Ⅲ) and As(Ⅴ)

砷累积量呈现出叶部>根部>茎部的规律(图 2)，且芘对于蜈蚣草砷累积量的抑制作用明显，与未加芘处理，添加芘导致砷处理的植株叶部砷累积量下降了162.4 μg ·株^-1，降低幅度为24.0%，茎部与根部砷累积量分别下降了71.5 μg ·株^-1、 63.2 μg ·株^-1，其中茎部的下降幅度最大，为33.6%.

图 2

Fig. 2

图 2 蜈蚣草中砷累积量和芘累积量 Fig. 2 Arsenic accumulation and pyrene accumulationin P. vitatta L.

蜈蚣草根部对芘累积量最大，能够达到5.6 μg ·株^-1，而叶部与茎部芘累积量分别为1200 ng ·株^-1、 436 ng ·株^-1(以DW计). 添加砷对于蜈蚣草茎部与根部芘累积量有显著影响，能够提高蜈蚣草植株中芘的累积量，而对于叶部芘累积量影响不大. 与未加砷相比，添加砷处理蜈蚣草根部芘累积量能够达到15.4 μg ·株^-1，而根部芘累积量增加9.8 μg ·株^-1.

图 3为采用双光子激光共聚焦显微镜观察蜈蚣草组织细胞中芘的原位信号分布. 在蜈蚣草根尖部位，芘主要附着于根部的表皮细胞. 在表皮细胞中，细胞质、 细胞膜与细胞核中芘的含量均很高. 而在根部内部细胞中，芘较多地赋存于细胞的细胞膜、 细胞核中，细胞质中芘的信号较弱，含量较少(图 3根尖部、 根部). 在茎部，芘主要分布于U型维管束(vascular bundle)的内皮层(endodermis)和木质部(xylem)细胞的细胞膜以及茎部外缘表皮细胞(epidermis)的细胞膜中，其中芘信号的强弱关系为：木质部细胞的细胞膜>茎部外缘表皮细胞>内皮层细胞，而在木质部与内皮层之间的韧皮部(phloem)和内皮层与外皮层之间的皮层(cortex)形成了芘的空白赋存区域(图 3茎部横切面). 在蜈蚣草羽叶部位，芘主要赋存于上下表皮细胞、 叶脉组织当中，栅栏组织和海绵组织中几乎没有芘的赋存(图 3叶部横切面). 这种特征类似于茎部芘的赋存特征，蜈蚣草植株的这种特征对于减轻芘对植株的伤害有很大的作用.

图 3

Fig. 3

红色为芘荧光信号，绿色为植物本身荧光信号，蓝色箭头指向芘信号贮存位置 图 3 蜈蚣草芘信号的微观分布示意 Fig. 3 Microscopic distribution of pyrene signals in Pteris vittata L.

蜈蚣草中砷能够促进根部、 茎部芘的积累，而芘抑制砷的吸收与贮存. 加砷处理后，除叶部芘的含量降低外，添加砷均促进了芘在根部和茎部的吸收与赋存，其中根部芘的赋存含量增长了1.77倍，茎部芘含量提高了36.2%. 根部芘的含量远远高于地上部分，添加砷导致芘的转运系数显著下降(表 2). 关于砷为何能够提升芘在蜈蚣草根部的赋存浓度，Sun等^[15]在研究菲与砷在蜈蚣草体内交互作用过程中得出砷能够提升根部菲的含量，并推断有可能是砷影响了菲在蜈蚣草的根表吸收能力以及其在蜈蚣草根内的降解过程，进而导致了菲在蜈蚣草地下部的累积，或有可能砷存在下改变了蜈蚣草根的细胞通透性或者根构型，影响了蜈蚣草根对菲的根表吸附.

表 2(Table 2)

表 2 蜈蚣草芘的转移系数 Table 2 Transfer factor of pyrene in P. vitatta L. 项目 砷 芘 处理条件 PYR PYR+As PYR PYR+As 转运系数TF 2.44 2.53 0.235 0.0776

表 2 蜈蚣草芘的转移系数 Table 2 Transfer factor of pyrene in P. vitatta L.

芘的添加影响了蜈蚣草植株对五价砷的吸收、 赋存以及在蜈蚣草体内的赋存形态. 加芘使得蜈蚣草各个部位总砷含量有不同程度的下降，下降幅度为20.5%~35.9%. 且添加芘使得蜈蚣草不同部位五价砷与三价砷含量均减少，较小地抑制了五价砷的还原转化. Sun等^[15]在研究菲和砷在蜈蚣草的交互行为时得到，菲会抑制蜈蚣草根部对砷的吸收和转运，此外Lin等^[16]在研究玉米(Zea mays L.)对芘和铜的交互作用时得出，芘的添加能够降低玉米对铜的富集; Wang等^[17]在研究东南景天(Sedum alfredii)对镉和芘复合污染土壤修复实验中也发现，芘的添加降低了景天属地上部分镉的浓度，进而降低了对镉的富集效率.

PAHs不仅影响蜈蚣草植株对砷的吸收，并且还会影响砷的赋存状态，芘的添加会抑制蜈蚣草各部五价砷向三价砷的转化，蜈蚣草中三价砷占总砷的比例略有下降，五价砷占总砷的比例略有升高，这说明芘的添加可能对于蜈蚣草各部五价砷的还原能力有较小的抑制作用. 芘可以与细胞质中的悬浮物质、 蛋白质发生交互反应，并产生生物细胞毒性^[18]，Sun等^[15]提出菲的添加抑制蜈蚣草对五价砷的还原能力，使得地上部三价砷显著降低. 由此推断芘可能与细胞中五价砷的转运蛋白及砷还原酶等蛋白质发生交互反应，使得细胞损伤或是转运蛋白及还原酶中毒，影响五价砷的正常吸收与转化，进而影响五价砷在植株中的含量与赋存形态.

通过双光子激光共聚焦显微技术原位观测组织细胞中芘的赋存位点，芘在蜈蚣草植株中的赋存规律为：在蜈蚣草微观组织细胞中，细胞外环境中的芘首先附着于细胞膜外层，并与细胞膜内层结合，通过跨膜运输进入到细胞内部，主要附着于细胞内部的细胞器膜结构与细胞核核膜附近，少量芘结合细胞质中有机化合物并储存于细胞质中. 在蜈蚣草茎部韧皮部部与皮层两个部位以及叶部栅栏组织和海绵组织中几乎没有芘的赋存，这有助于降低芘对蜈蚣草本身的毒害作用.

植物能够通过不同的途径吸收PAHs，一方面植物的叶子可以通过表面蜡质吸收沉积在上面富含PAHs的固体颗粒物中的PAHs^{[19, 20, 21]}，也可以通过根部根系吸收PAHs并转运到地上部的茎部和叶部^{[22, 23, 24, 25]}. 植物吸收与赋存PAHs的主要动力来自于植株的蒸腾作用与化学浓度梯度^{[26, 27, 28, 29]}. PAHs高Kow(辛醇/水分布系数)容易进入有机相^[30]，并且细胞膜磷脂双分子层外部亲水性，内部亲脂性的独特特点使得芘在细胞膜的吸附量较大^{[26, 31]}，化合物的亲油性是植物吸收量的决定性因素^[27]. 芘作为PAHs中的一种，具有低水溶性、 低亨利定律常数、 高Kow (octanol-water partition coefficients)(lgKow=5.22)的物理化学性质，能够与细胞膜和大分子有机物质等亲脂性结构亲和并附着. Kang等^[26]在研究黑麦草根部细胞中芘的亚细胞动力学规律时发现，芘表现出很强的吸收性和难以新陈代谢的特性，首先吸附在根的细胞壁上，然后透过细胞膜进入到细胞内部的一些细胞器里面. 而芘在亚细胞的分布与各个细胞器中脂含量成正相关性，其高亲脂性使得在细胞器膜的吸附量较大. Ren等^[32]也证实菲和蒽可以通过大肠杆菌的细胞膜的磷脂质进入到细胞质，且菲与大肠杆菌细胞质中的悬浮物质、 有机质能够发生交互反应.

(1)芘和砷在蜈蚣草植株中交互作用显著，砷的添加能够促进蜈蚣草根部和茎部芘的吸收和赋存，降低了叶部芘的含量.

(2)芘抑制蜈蚣草各部位对五价砷的吸收和转化，且植株体内三价砷的含量与比例均下降，五价砷含量下降，而比例上升.

(3)通过双光子激光共聚焦显微镜技术得出芘在蜈蚣草组织细胞中的赋存与分布规律：在蜈蚣草组织细胞中，芘主要附着于细胞膜附近，并依附于细胞内部的细胞器膜结构与细胞核核膜. 在蜈蚣草茎部韧皮部与皮层两个部位以及叶部栅栏组织和海绵组织中几乎没有芘的赋存，该赋存特征有助于降低芘对蜈蚣草组织细胞的毒害作用.

致谢： 林龙勇、 史沛丽、 费杨、 刘颖等在实验方面提供了帮助，在此一并致谢！