人工纳米颗粒(nanoparticles,NPs)因其具有小尺寸效应、 大比表面等特殊的理化特性而被广泛应用. 其中，纳米ZnO是最常见的金属型纳米颗粒之一，广泛用于塑料、 陶瓷、 玻璃、 水泥、 橡胶、 润滑剂、 油漆、 涂料、 食品(锌源营养)、 电池、 防火阻燃剂、 化妆品、 防晒产品等领域^[1]. 在其生产、 使用及处理等过程中，纳米ZnO不可避免地会进入水体和土壤等环境中. 更值得重视的是，纳米ZnO不仅会对植物和土壤微生物产生毒性，而且可以被植物吸收并随食物链进行传递和富集，对环境和人畜健康产生潜在风险^{[1, 2]}. 研究表明纳米ZnO具有细菌毒性^[3]、 可降低土壤呼吸和土壤微生物总DNA、 改变微生物群落结构^[4]. 纳米ZnO对紫花苜蓿^[5]、 小麦^[6]、 油菜^[7]、 玉米和黄瓜^[8]均有一定植物毒性，同时可对大豆产生遗传毒性^[9]，并可以导致Zn在大豆可食部分中富集^[10]. 因此，其生物效应和生态毒理受到广泛关注^{[1, 11, 12]}.

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌是与植物关系最为密切的土壤微生物之一，能够与陆地80%以上高等植物的根系形成互惠共生体^[13]. AM真菌不仅可以改善宿主植物矿质营养、 增强宿主植物抗逆性、 利于宿主植物生存，而且可以改善土壤结构、 用于修复污染土壤. 已经证实，AM真菌对重金属Zn等污染物具有一定耐性，影响其生物有效性和毒性，并通过多种机制对宿主植物起到保护作用，这方面研究较多且比较深入^{[14, 15, 16]}.

纳米ZnO作为潜在新型污染物^[17]，其自身又含有重金属组分，在某些方面与重金属Zn类似，因此AM真菌很可能会影响纳米ZnO的生物毒性及植物中的吸收、 转运和积累等过程. Feng等^[18]首次发现纳米FeO和纳米Ag影响白三叶草的AM真菌侵染及其促生效应. 王卫中等^[19]研究发现纳米ZnO也可以影响AM真菌侵染，AM真菌则可减轻纳米ZnO的生物毒性，对玉米生长起到一定保护作用. 目前关于金属纳米颗粒和丛枝菌根的研究较少^[18]，对二者关系值得深入研究. Navarro等^[20]指出，纳米颗粒具有巨大的比表面积，可能会吸附其它污染物，改变纳米颗粒和污染物在环境中的迁移和生物有效性，并改变其毒性效应. 当纳米ZnO和重金属Zn共存时，两者的毒性效应可能会有所改变，同时将可能会影响到AM真菌的效应. 但是目前未有相关研究报道，基于此，本试验以常见的作物玉米为供试植物，在温室盆栽条件下研究纳米ZnO与离子态Zn(ZnSO₄)共存时对玉米生长的影响以及接菌下对两者共存时的响应，以期为了解纳米ZnO与重金属共存时的环境行为以及其与丛枝菌根的相互关系提供一些支持.

供试植物为玉米(Zea mays L. )，品种为郑单958. 供试AM真菌为Funneliformis mosseae(旧名为Glomus mosseae)BEG 167，以河沙为培养基质、 玉米和苏丹草为宿主植物盆栽扩繁，去除宿主植物地上部，把根剪碎，将含有寄主植物根段、 菌根真菌孢子(每克菌剂约含30个孢子)，及根外菌丝的根际土为接种剂. 供试纳米ZnO购自南京埃普瑞纳米材料有限公司(白色单晶，纯度为99.9%，平均粒径为30 nm，平均表面积为110 m² ·g^-1). ZnSO₄ ·7H₂O购自天津博迪化工股份有限公司. 供试土壤采自河南科技大学开元校区农场，过20目筛，用高温高压蒸汽灭菌法(121℃，105 kPa) 连续灭菌4 h后风干备用. 土壤基本理化性质如下，pH 8.46(水土比2.5 ∶1)，有机质2.06%，全氮1.36 g ·kg^-1，全磷1.02 g ·kg^-1，全钾11.49 g ·kg^-1，碱解氮79.48 mg ·kg^-1，速效磷22.94 mg ·kg^-1，速效钾285.36 mg ·kg^-1，全Zn 39.44 mg ·kg^-1，DTPA提取态Zn 0.81 mg ·kg^-1.

试验设置2个纳米ZnO水平(0、 500 mg ·kg^-1，以锌含量计算)，两个ZnSO₄水平(0、 500 mg ·kg^-1，以锌含量计算)，分别为对照(CK)、 纳米ZnO、 ZnSO₄、 纳米ZnO与ZnSO₄复合处理，然后设置接菌处理(M)和不接菌处理(N)对照，每个处理重复4次. 选用双色花盆(上口直径170 mm，高150 mm)，每盆装1.5 kg土壤，基质分装采用逐级混匀的方法施加纳米ZnO和ZnSO₄，接菌处理每盆施加100 g风干菌剂，不接菌处理加入等量灭菌菌剂，并浇一定量过500目筛的菌剂滤液，以保证不接菌处理与接菌处理在其它微生物区系尽量一致.

选取形状大小一致的玉米种子，放置自来水中催芽，于2014年10月8日播种，每盆均匀播种6棵，深度为2~3 cm. 玉米在日光温室中生长，期间精细管理，适当调整各盆的位置和通风，并用称重法浇自来水，维持土壤含水量在70%左右，生长8周后收获. 生长期间浇1/3强度的Hoagland营养液2次，每次200 mL.

植株地上部和根系分开收获，自来水冲洗后用去离子水清洗，擦干后称取鲜重，选取毛细根段(也测定鲜重，通过计算最后加入根系总干重)用KOH溶液脱色、 派克牌黑色墨水染色，然后用方格交差法测定菌根侵染率. 将植株地上部和剩余根系装入信封于烘箱内70℃烘干至恒重，用万分之一电子天平称取干重. 植株地上部和根系粉碎，优级纯HNO₃-HClO₄(4 ∶1)消煮后，原子吸收分光光度计(Varian AA240，美国)测定 Zn含量. 同时用标准物质(灌木枝叶GBW07603,GSV2)以校准测定的准确性. 把整盆土壤混匀，取200 g风干，pH计法测定土壤pH.

根据植物干重和Zn含量计算出植物Zn吸收量. 生物富集系数(BCF)=植物体内的某元素含量/土壤中该元素含量.

利用Excel 2010和SPSS 19.0等统计软件对所测指标的数据进行单因素方差分析，Duncan多重比较各处理之间的差异显著性(P<0.05)，然后用三因素方差分析纳米ZnO、 ZnSO₄和接菌处理之间的交互作用.

不接菌处理玉米根系未被侵染. 接菌条件下施锌处理玉米根系AM真菌侵染率与不施锌(CK)相比均显著降低(图 1). 但是ZnSO₄处理、 纳米ZnO处理以及复合处理之间无显著差异，这说明纳米ZnO与ZnSO₄的菌根毒性类似，且二者共存时其毒性没有显著增加.

图 1

Fig. 1

CK：对照处理; NPs： 500 mg ·kg-1 ZnO NPs; Zn2+：500 mg ·kg-1 ZnSO4; NPs+Zn2+：500 mg ·kg-1 ZnO NPs+500 mg ·kg-1 ZnSO4; 图中竖棒表示标准偏差，不同字母表示单因素Duncan分析结果在P<0.05水平差异显著，下同 图 1 不同处理对玉米根系AM真菌侵染率的影响 Fig. 1 Effects of different treatments on AM fungal colonization rate of maize roots

由图 2(a)可知，与不施锌相比，ZnSO₄处理、 纳米ZnO处理以及复合处理(接菌处理除外)均降低玉米地上部干重. 不接菌时，复合处理中地上部干重低于纳米ZnO和ZnSO₄处理; 接菌时，3个施锌处理之间没有显著差异. 接种AM真菌仅在复合处理中显著增加了地上部干重，在不施锌时反而起到抑制作用，在ZnSO₄处理、 纳米ZnO处理中没有显著作用. 三因素方差分析显示，3个因素两两之间存在显著交互作用，但是3个因素之间并无显著交互作用(表 1).

图 2

Fig. 2

N表示不接菌处理，M表示接菌处理，下同 图 2 不同处理对玉米地上部和根系干重的影响 Fig. 2 Effects of different treatments on dry weights of maize shoots and roots

表 1(Table 1)

表 1 接菌(M)、 纳米ZnO、 ZnSO4对各变量的三因素方差分析结果(F值) Table 1 Three-way ANOVA analysis on significance levels (F values) of AM inoculation (M), ZnO NPs, ZnSO4 and their interactions on measured variables 变量 M NPs Zn 2+ M×NPs M×Zn 2+ NPs×Zn 2+ M×NPs×Zn 2+ 菌根侵染率 — 7.14 * 9.90 * — — 7.51 * — 地上部干重 7.75 * 45.34 ** 25.04 ** 21.23 ** 13.48 ** 12.28 ** 0.00ns 根系干重 46.63 ** 22.48 ** 50.42 ** 5.73 * 1.40ns 21.36 ** 0.01ns 地上部Zn含量 16.69 ** 239.85 ** 504.60 ** 0.13ns 7.62 * 121.40 ** 2.47ns 根系Zn含量 3.38ns 98.33 ** 212.40 ** 1.96ns 0.50ns 2.96ns 1.75ns 地上部Zn吸收量 19.56 ** 208.10 ** 576.77 ** 8.76 ** 3.31ns 185.40 ** 21.35 ** 根系Zn吸收量 23.90 ** 102.13 ** 186.53 ** 1.58ns 2.84ns 2.96ns 0.27ns 土壤pH 643.72 ** 17.04 ** 63.98 ** 0.27ns 11.25 ** 23.02 ** 7.57 * 1)显著性结果：*表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示不显著，“—”表示无此项分析结果; M、 NPs、 Zn2+分别代表接菌处理、 施加纳米ZnO处理、 施加ZnSO4处理

表 1 接菌(M)、 纳米ZnO、 ZnSO4对各变量的三因素方差分析结果(F值) Table 1 Three-way ANOVA analysis on significance levels (F values) of AM inoculation (M), ZnO NPs, ZnSO4 and their interactions on measured variables

由图 2(b)可知，与不施锌相比，ZnSO₄处理、 纳米ZnO处理以及复合处理均降低玉米根系干重. 接菌或不接菌时，3个施锌处理之间均没有显著差异. 接种AM真菌在CK、 ZnSO₄处理中降低根系干重. 三因素方差分析显示，纳米ZnO与接菌处理、 ZnSO₄处理存在显著交互作用(表 1).

以上可以说明，纳米ZnO处理与ZnSO₄处理对玉米有类似的生物毒性，抑制其生长，且纳米ZnO与ZnSO₄共存时存在显著交互作用，但仅在不接种处理中毒性有一定程度增加. 接菌处理与复合处理之间并没有显著交互作用(表 1).

由图 3可知，与不施锌处理相比，无论接菌与否，纳米ZnO、 ZnSO₄处理均显著增加了玉米地上部和根系Zn含量; 复合处理时玉米地上部和根系Zn含量达到最高，但是与土壤总Zn量并不呈线性关系.

与不接菌处理相比，在不施锌和纳米ZnO处理时，接菌没有显著影响玉米地上部和根系Zn含量; 施加ZnSO₄时，接菌降低玉米地上部Zn含量; 复合处理时，接菌显著降低玉米地上部和根系中Zn含量. 三因素方差分析显示，接菌处理和ZnSO₄处理之间、 纳米ZnO和ZnSO₄处理之间对地上Zn含量存在显著交互作用(表 1).

图 3

Fig. 3

图 3 不同处理对玉米地上部和根系Zn含量的影响 Fig. 3 Effects of different treatments on concentrations of Zn in maize shoots and roots

根据玉米干重和相应的Zn含量可以计算出玉米Zn吸收量. 由图 4可知，与不施锌相比，施加纳米ZnO、 ZnSO₄均显著增加了玉米地上部和根系Zn吸收量，且地上部吸收量都是ZnSO₄处理高于纳米ZnO处理，但是两处理之间根系Zn吸收量无显著差异. 复合处理时，玉米根系Zn吸收量显著高于单一纳米ZnO、 ZnSO₄处理，地上部Zn吸收量受接菌处理影响较大.

图 4

Fig. 4

图 4 不同处理对玉米地上部和根系Zn吸收量的影响 Fig. 4 Effects of different treatments on uptake of Zn in maize shoots and roots

与不接菌处理相比，接菌在不施锌时没有显著影响玉米地上部和根系Zn吸收量. 接菌没有显著影响纳米ZnO处理中的根系Zn吸收量，以及复合处理中的地上部Zn吸收量，其他情况下均是显著抑制作用.

三因素方差分析显示，纳米ZnO与ZnSO₄处理之间、 接菌和纳米ZnO之间，以及三因素之间对地上部Zn吸收量存在显著交互作用(表 1). 三因素之间对根系Zn吸收量没有显著交互作用.

由表 2可知，与不施锌相比，施加纳米ZnO或ZnSO₄后根系Zn的BCF均显著较低，而地上部则比较复杂，复合处理中BCF最低. 施加ZnSO₄时地上部Zn的BCF高于纳米ZnO处理(在不接菌处理中差异显著)，根系Zn的BCF没有显著差异.

与不接菌处理相比，接菌处理在施加ZnSO₄和复合处理中降低地上部Zn的BCF，而根系Zn的BCF仅在对照处理中差异显著，其他处理中均没有显著变化.

表 2(Table 2)

表 2 不同处理下玉米地上部和根系中Zn的BCF 1) Table 2 BCF of Zn in maize shoots and roots under different treatments 项目 处理 不接菌处理(N) 接菌处理(M) CK 1.45(0.20) b 1.39(0.11)b 地上部 NPs 1.31(0.05)bc 1.20(0.14)cd Zn 2+ 1.75(0.06)a 1.37(0.12)bc NPs+Zn 2+ 1.04(0.05)d 0.85(0.03)e CK 3.37(0.41)a 2.32(0.52)b 根系 NPs 1.10(0.12)cd 1.01(0.15)cd Zn 2+ 1.39(0.14)cd 1.40(0.30)c NPs+Zn 2+ 1.13(0.15)cd 0.93(0.18)d 1)表内数据为平均值(标准偏差)，括号后不同字母表示单因素Duncan分析结果在P<0.05水平差异显著

表 2 不同处理下玉米地上部和根系中Zn的BCF 1) Table 2 BCF of Zn in maize shoots and roots under different treatments

由图 5可知，与不施锌相比，纳米ZnO处理中玉米收获后土壤pH均升高，而ZnSO₄处理和复合处理中没有显著变化(不接菌处理)或显著降低(接菌处理). 与不接菌相比，接菌在所有处理中均使土壤pH显著升高.

三因素方差分析显示，除接菌与纳米ZnO处理之间外，纳米ZnO与ZnSO₄处理之间、 接菌和ZnSO₄之间，以及三因素之间对土壤pH均存在显著交互作用.

图 5

Fig. 5

图 5 不同处理对玉米植株收获后土壤pH的影响 Fig. 5 Effects of different treatments on soil pH after harvest of maize plants

锌污染往往对AM真菌侵染不利^{[21, 22]}. 本研究进一步证实，施加离子态或纳米颗粒态的锌均抑制菌根侵染. 已有研究证实纳米ZnO具有抗真菌活性^[23]，土壤中纳米ZnO对丛枝菌根具有一定毒性，浓度越高，毒性越强^[19]. 金属纳米颗粒的微生物毒性一方面可能是其颗粒巨大的比表面积和活性造成的，另一方面可能是其更容易转换为离子态^[11]. 从菌根侵染和玉米植株干重来看，纳米ZnO和ZnSO₄的毒性类似. 这意味着纳米ZnO的毒性很大程度上可能是由释放出Zn²⁺引起的，与笔者的另外一项研究结果类似^[24].

本研究显示，纳米ZnO和ZnSO₄均显著降低玉米菌根侵染率，但是仍有10%以上的玉米根系被侵染，这表明AM真菌对纳米ZnO和ZnSO₄有一定程度的耐性. 土壤中纳米ZnO含量高达3000 mg ·kg^-1时仍然具有一定的侵染能力(高达29%)^[19]，但在沙培条件下，2000 mg ·kg^-1的纳米ZnO则几乎完全抑制大豆根系的菌根侵染^[25]. Feng等^[18]研究发现沙培条件下纳米FeO(0.032~3.2 mg ·kg^-1)和纳米Ag(0.01~1 mg ·kg^-1)没有降低甚至增加了Glomus caledonium对白三叶草的菌根侵染. 纳米颗粒对菌根的效应可能与纳米颗粒(种类、 性质、 剂量等)、 植物、 AM真菌、 基质性质等因素有关.

土壤中较高含量的金属纳米颗粒对植物生长绝大多数是抑制作用^{[26, 27]}，而在较低浓度时往往不影响植物生长甚至体现出促进作用^[24]. 500 mg ·kg^-1的纳米ZnO抑制玉米植株生长^[19]，而500 mg ·kg^-1(Zn)的纳米ZnO或ZnCl₂并没有显著影响豇豆的生长^[28]，500 mg ·kg^-1的纳米ZnO甚至略促进大豆植株的生长^[29]. Liu等^[24]采用一系列浓度的纳米ZnO研究发现，土壤中100~200 mg ·kg^-1的纳米ZnO对玉米生长有促进作用，400 mg ·kg^-1时无显著作用，而800 mg ·kg^-1以上则显著抑制玉米生长. 本试验结果再次证实，500 mg ·kg^-1(Zn)的纳米ZnO已经显示出植物毒性. 显然，无论纳米ZnO还是ZnSO₄，都存在一个产生生物毒性的临界浓度，其高低可能主要取决于纳米ZnO粒径大小、 植物种类和土壤环境因素(如pH、 有机质含量等)等，已有研究表明这些因素对金属纳米颗粒的生物效应能够产生影响^{[6, 11]}.

污染条件下，菌根侵染和植物生长一般会随土壤Zn含量的增加而降低，而植物体内Zn含量往往会增加^[21]，但令人意外的是，本研究发现，与其单一处理相比，纳米ZnO与ZnSO₄复合处理(土壤锌含量是单一处理的2倍)时并没有显著抑制玉米菌根侵染和植株生长，植物体内Zn含量和Zn吸收量也没有成倍增加，尤其是地上部，Zn含量与ZnSO₄处理差异不显著，Zn吸收量甚至降低. 这表明纳米ZnO与ZnSO₄共存时可能存在复杂的共环境行为和交互作用，其生物毒性并非简单的拮抗作用、 加和作用或协同作用. 在土壤中，生物毒性较强的Zn形态往往是可溶态和易交换态的部分. 纳米ZnO释放Zn²⁺是其毒性机制之一^[24]，但是在土壤Zn²⁺较多时，其释放的离子态锌可能会减少. 同时，纳米ZnO颗粒比表面积较大，吸附能力强，对ZnSO₄释放的Zn²⁺可能具有吸附固定作用，从而也降低了其生物有效性. 已有研究表明，纳米ZnO对水环境中的Cd²⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺、 Pb²⁺等具有一定的吸附去除能力^[30]，因此土壤环境中纳米ZnO对Zn²⁺可能也有一定吸附能力，尚需进一步研究.

绝大多数研究表明，植物体内Zn含量与生长基质中的ZnSO₄含量^[22]或纳米ZnO含量^[24]呈正相关，而且纳米ZnO的生物有效性也较高，容易被植物利用^[24]. 本研究发现，总体来看，与纳米ZnO相比，玉米更容易吸收ZnSO₄中的Zn(其F值较高，见表 1)，这显然与ZnSO₄溶解性好、 更容易释放Zn²⁺有关. 生物富集系数(BCF)也能证实了这一点. 一般认为植物体内正常Zn含量在8~400 mg ·kg^-1之间，高于400 mg ·kg^-1时植物就会出现中毒症状. 本研究结果显示，单一纳米ZnO、 ZnSO₄处理玉米地上部和根系Zn含量均高于400 mg ·kg^-1，这表明纳米ZnO和ZnSO₄已经对玉米植株产生了毒害. 同时，纳米ZnO处理下玉米地上部Zn含量均低于ZnSO₄处理，但是两处理之间玉米生物量却无显著差异，这表明Zn²⁺的释放仅是纳米ZnO的生物毒性机制之一.

AM真菌对植物抵御重金属毒害的贡献已被广泛证实^[16]. 在Zn污染条件下，AM真菌一般降低植物体内Zn含量和Zn吸收量，从而对宿主起到保护作用，促进植物生长. 本研究证实多数处理中接种AM真菌降低了玉米体内Zn含量或Zn吸收量，但是仅在复合处理中增加了地上部干重(ZnSO₄处理中甚至降低根系干重). 菌根促生效应往往与改善植物磷营养有关，一般在低磷土壤中比较显著，本研究发现植物磷营养没有得到显著改善(数据未列出)，显然这可能与土壤肥力(尤其是磷含量)较高、 菌根侵染率较低有关. 同时，这证实AM真菌可能直接影响植物锌含量，并非是由于生物量改变而产生的间接作用. 纳米ZnO污染往往引起土壤肥力下降以及Zn在作物可食部分中的累积^[29]，可能对环境和生物产生一定风险. 在纳米ZnO或ZnSO₄污染条件下，AM真菌均可降低玉米对Zn的吸收量，体现出一定程度的积极作用，同时对于降低锌污染引起的健康风险也有一定意义.

土壤pH是影响Zn生物有效性及毒性的重要环境因素，也是影响纳米ZnO溶解性和植物毒性的关键因素之一^[6]. 纳米ZnO溶解后会释放OH^-，导致土壤pH升高. 接种AM真菌后，无论是纳米ZnO、 ZnSO₄还是复合处理，土壤pH均显著增加，这是丛枝菌根降低Zn生物毒性的途径之一^{[16, 31]}. 锌污染和土壤pH升高往往会导致植物磷等矿质营养不良，AM真菌改善植物矿质营养也是帮助植物抵御纳米ZnO胁迫的机制之一^{[19, 25]}. 本研究发现，AM真菌在促生效应不显著的情况下也能在减轻纳米ZnO毒性方面发挥积极作用. 但纳米ZnO除了类似ZnSO₄的毒性之外，也可能具有非纳米污染物所不具有的纳米毒性，而且受土壤中的复杂因素影响，丛枝菌根与纳米ZnO、 离子态锌之间的关系值得深入探讨.

(1)纳米ZnO对AM真菌有一定毒性，抑制菌根侵染和玉米植株生长，表现出菌根毒性和植物毒性，与同浓度的ZnSO₄相比无显著差异.

(2)与纳米ZnO相比，土壤中施加ZnSO₄中的Zn更容易被玉米吸收.

(3)纳米ZnO与ZnSO₄二者共存其生物毒性并没有相应增加，说明二者间存在复杂的共环境行为和交互作用.

(4)与ZnSO₄的效应不同，施加纳米ZnO使玉米收获后的土壤pH升高.

(5)AM真菌对纳米ZnO、 ZnSO₄单一及复合污染均具有一定的耐性，接种AM真菌使土壤pH升高、 降低玉米体内Zn含量或Zn吸收量，在复合处理中增加地上部干重，具有一定的保护作用.