多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的芳香化合物，是环境中广泛存在的一类典型的持久性有机污染物. 土壤中多环芳烃污染的来源主要是：煤、 石油、 木材以及有机高分子化物的不完全燃烧以及石油在开采、 运输及使用过程中的排放^{[1, 2, 3]}. PAHs主要特征是疏水性高、 性质稳定，能够通过大气沉降等途径进入土壤，且易吸附到土壤颗粒上形成难以降解的污染物，造成多环芳烃特别是高分子量PAHs在土壤环境中的大量累积^[4]，威胁土壤生态系统安全与人类健康. PAHs容易被土壤强烈吸附，然后以结合态、 可解吸态、 游离态这3种形态存在^[5]. 目前认为，土壤中结合残留态污染物不会引起生物毒性效应，而游离态和可解吸态组分才会对生物体产生毒性效应，用总浓度进行风险评估通常导致风险的高估以及修复管理策略失误. 因此进行有关土壤中PAHs生物有效态组分表征方法的研究具有重要意义并成为热点之一^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]}.

污染物生物有效性是指污染物被生物吸收和利用的潜力，它反映了在一定时间内，化学物质从环境介质中穿过生物体膜进入生物体的量或有效毒性剂量^[13]. 传统的总浓度提取方法有索氏提取、 超声波提取、 加速溶剂提取(ASE)^{[14, 15]}等，这种耗竭性提取关注于土壤中污染物的总浓度，将其全部视为有效态浓度，往往会高估土壤中污染物的实际污染风险水平. 因此，采用生物有效性(bioavailability)浓度来评价土壤中PAHs的污染风险水平更为科学合理. 目前常采用的生物有效性的表征方法为模式生物法^{[7, 16, 17, 18]}，如植物根系蓄积、 蚯蚓蓄积、 微生物降解，但该法费时费力、 周期长、 影响因素多、 重现性低，从而限制了在实际中的应用. 为弥补模式生物方法的不足，人们尝试采用化学方法^{[19, 20, 21, 22]}替代生物方法. 某一浓度区间内化学方法的提取组分可能正是生物可利用组分，因此有望实现对生物方法的模拟. 目前所用的化学方法主要有温和溶剂提取^{[23, 24]}、 树脂吸附^[25]、 超临界流体萃取^[26]等. 现有研究主要报道了单一的提取方法对单一的PAH的生物有效性预测^{[9, 27, 28]}，而不同的化学提取法对不同环数的PAHs的提取差异，以及对生物有效性预测效果的比较，这些方面的研究还比较缺乏.

随着土壤老化时间的增长，PAHs的生物有效性不断下降，引发的环境和人体健康风险也随之下降. 因此，老化时间对PAHs的生物有效性的影响有重要的研究意义. 本研究以添加了PAHs的红壤、 黄壤两种土壤为供试土样，采用ASE提取、 Tenax-TA树脂提取、 HPCD提取以及正丁醇提取这4种不同的化学提取法对不同老化时间污染土中多环芳烃进行提取，以赤子爱胜蚯蚓为模式生物，进行PAHs生物蓄积实验，分析蚯蚓蓄积量与4种化学提取量之间的相关性，试图寻找出土壤中PAHs生物有效性较为合适的预测方法，以期为科学评估PAHs污染土壤的环境风险提供参考.

选取3种代表性的PAHs，分别为3环的菲、 4环的芘以及5环的苯并[a]芘作为目标污染物，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，Tenax-TA树脂(60~80目)购自北京康林科技有限责任公司，使用前用体积比为1 ∶1的丙酮/正己烷溶液清洗，75℃烘干备用; HPCD、 层析硅胶、 硅藻土、 氧化铝以及无水硫酸钠均为分析纯试剂，正丁醇、 丙酮、 正己烷、 甲醇、 乙腈、 等均为色谱纯试剂，购于南京第一化学试剂公司. 其中硅藻土、 无水硫酸钠、 氧化铝、 石英砂，用之前要经过高温处理(200℃，4 h),硅胶(130℃，2 h)活化.

配有PAHs专用柱(250 mm×416 mm,5 mm粒径，美国Supelco公司)的高效液相色谱仪(HPLC LC-20A型，日本岛津公司); 加速溶剂萃取仪(ASE200型，美国戴安公司); R210/R215型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); Sigma2-16K型离心机(德国Sigma公司).

供试土壤分别为采自海南的红壤(19°46′16.6″N，110°00′21.5″E)和南京八卦洲的黄壤(32°12′46″N，118°50′112.3″E). 土样置于室内自然风干，磨碎，过2 mm筛，其物理化学性见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of the test soils 样品来源 TOC /g·kg-1 pH 土壤颗粒组成/% 质地名称 2~0.05 mm 0.05~0.002 mm <0.002 mm 红壤 20.57 6.33 40.88 26.76 32.36 黏壤土 黄壤 28.57 7.56 13.61 63.11 23.28 粉砂壤土

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of the test soils

分别称取风干土样650 g于2 L的大烧杯中，分别加入含菲、 芘以及苯并[a]芘的丙酮溶液，在通风厨内不断搅拌土壤，直至土壤中丙酮完全挥发，然后反复过60目筛，使制备的污染土壤均匀. 最后制得的污染土壤PAHs的初始浓度为：红壤中菲、 芘、 苯并[a]芘分别为1 635、 1 352、 353 μg ·kg^-1; 黄壤中菲、 芘、 苯并[a]芘分别为924、 1 132、 428 μg ·kg^-1. 然后添加去离子水调节土壤至60%含水率，模拟自然田间状况，用铝箔封口避光培养(为保证其60%的含水率，须定期称重补充水分). 分别静置0、 7、 15、 30、 60 d后取样，进行PAHs化学法提取以及蚯蚓蓄积实验. 每个处理设置4个重复.

实验所用蚯蚓是购自南京养殖场的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)，属于正蚓科(Lumbricidae)，平均湿重在0.25 g左右. 实验前，要将蚯蚓在实验室环境下驯化至少14 d. 清理肠道48 h后，向90 mm的培养皿中分别加入40 g老化0、 7、 15、 30、 60 d的污染土，每个培养皿中放入7条蚯蚓，黑暗培养2周，温度保持在25℃. 为保持60%的含水率，需要定期补充水分. 实验结束后，实验组和对照组蚯蚓全部存活，将蚯蚓取出，清理肠胃48 h，称重，冷冻干燥后磨碎备用于蚯蚓体内PAHs蓄积量的提取; 每个处理设置4个重复.

污染土壤中PAHs总浓度的测定以及蚯蚓体内PAHs富集量的测定采用加速溶剂萃取仪(ASE200)提取，即将冷冻干燥过的蚯蚓样品或土壤样品与硅藻土搅拌均匀后装入ASE萃取池中，提取条件为：提取剂为正己烷/丙酮(4 ∶1,体积比)，温度125℃，压力10 MPa，预热5 min，静态提取5 min，循环2次，溶剂冲洗体积为60%萃取池体积. 提取液经旋转蒸发，浓缩至2 mL左右，然后转移浓缩后萃取液到固相萃取柱(SPE)对样品进行纯化. 其中，土壤样品的萃取液使用的SPE柱从下层至上层依次为1 g无水硫酸钠、 1 g硅胶、 1 g无水硫酸钠; 蚯蚓样品萃取液使用的SPE柱从下层至上层依次为1 g无水硫酸钠、 0.5 g硅胶、 0.5 g Al₂O₃、 1 g无水硫酸钠. SPE柱使用前需用5 mL正己烷进行润洗，弃去润洗液，用15 mL正己烷/二氯乙烷(9 ∶1，体积比)对2 mL浓缩的样品进行洗脱，将洗脱液旋转蒸干，用乙腈定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜后移入2 mL棕色样品瓶中，最后用高效液相色谱(HPLC)测定PAHs含量.

(1)Tenax -TA 6 h提取

参照Cornelissen等^[29]的方法：分别称取1 g不同老化处理后的污染土样、 0.2 g Tenax-TA、 1 mg HgCl₂加入60 mL棕色样品瓶中，再向其中加入30 mL去离子水，盖上盖子(特氟龙材料)在振荡器上振荡6 h. 振荡结束后，将全部体系转移到分液漏斗中进行分离，收集上层的Tenax树脂，再用去离子水清洗两次，用体积比为4 ∶1的正己烷/丙酮溶液15 mL超声5 min提取，重复1次，并将2次提取液充分混合，按照1.6节的方法进行纯化、 定容，用于HPLC法测定PAHs含量.

(2)HPCD提取

参照Stokes等^[30]的方法，称取1 g不同老化处理后的污染土样于玻璃离心管中加入20 mL的HPCD(50 mmol ·L^-1)溶液，在室温下(25℃)振荡20 h，振荡结束后，高速离心20 min(4 500 r ·min^-1)，舍弃上清液. 然后加20 mL去离子水，涡旋5 s，离心，弃去上清液. 残余物中的PAHs用ASE耗竭性提取法提取，最后用差减法计算得出HPCD的提取量.

(3)正丁醇提取

参照Kelsey等^[31]的研究，称取1 g不同老化处理后的污染土样于玻璃离心管中加入10 mL的正丁醇溶液，在室温下(25℃)振荡2 h，振荡结束后，高速离心20 min(4 500 r ·min^-1)，舍弃上清液. 然后加20 mL去离子水，涡旋5 s，离心，弃去上清液. 残余物中的PAHs用ASE耗竭性提取法提取，最后用差减法计算得出正丁醇的提取量.

PAHs使用HPLC荧光检测器进行检测. 分离柱为PAHs专用柱(250 mm×416 mm,5 mm粒径，美国Supelco公司)，检测器的波长设置：菲激发波长为245 nm，发射波长为365 nm; 芘激发波长为270 nm，发射波长为390 nm; 苯并[a]芘激发波长为260 nm，发射波长为420 nm. 流动相为乙腈 ∶水(9 ∶1，体积比); 进样量为20 μL，流速1.5mL ·min^-1，恒流; 柱温30℃.

在样品分析过程中进行空白、 平行样以及加标回收率的测定. 在土壤和蚯蚓样品中分别添加3种PAHs的混合标样(单点加标，加标浓度为1 000 μg ·L^-1)，采用1.6节中分析方法测定PAHs回收率，土壤样品中的加标回收率分别为93%、 97%、 99%，蚯蚓样品中的加标回收率为92%、 93%、 95%，相对标准偏差小于10%. 土壤中的PAHs浓度用干重表示，蚯蚓中的PAHs浓度用鲜重表示，值为算术平均值. 所有实验数据用Excel 2013和SPSS 13.0软件进行统计分析.

老化0、 7、 15、 30、 60 d后土壤中PAHs的耗竭性提取量的变化情况如图 1所示. 方差分析表明：除黄壤的菲之外,在0、 7、 15、 30 d随着老化时间的延长，PAHs的耗竭性提取量逐渐减少，3种PAH浓度在各土壤中4个时间点之间差异均显著，第7 d的浓度与起初浓度差异达极显著水平，老化30 d与老化60 d之间差异不显著; 表明在加入污染物后的前7 d内，污染物耗竭性提取浓度有一个急剧的下降过程. 这可能由于进入土壤中的污染物，一部分迅速与有机质作用，发生非线性吸附或分配吸收; 另一部分进入土壤纳米孔隙中，被土壤包被，空隙结构越小，越难被提取; 同时可能还有部分污染物被微生物降解^{[32, 33, 34]}.

图 1

Fig. 1

图 1 土壤中PAHs耗竭性提取总量随老化时间的变化 Fig. 1 Exhaustive extracted PAHs concentration in different aged soils

以老化0 d的提取量为参照的初始量，老化60 d后，在红壤中，菲、 芘及苯并[a]芘耗竭性提取量的浓度分别约为初始量的49%、 61%和29%，黄壤中，菲、 芘及苯并[a]芘耗竭性提取量的浓度分别约为初始量的68%、 41%和32%，表明红壤对苯并[a]芘的固定能力大于菲和芘,而黄壤对苯并[a]芘的固定能力也最大. 可能的原因一是苯并[a]芘与土壤组分之间的作用力大于菲和芘，二是苯并[a]芘进入土壤纳米微孔后相对难以被提取出来，且土壤微孔结构越多，其被土壤固定量就越大. 为保证后续实验数据的可比性，本研究拟采用耗竭性提取量较为稳定的老化污染土壤，即采用老化时间为30 d的污染土，来研究不同非耗竭性化学提取剂对土壤中PAHs生物有效性表征的差异.

不同非耗竭性化学提取法测得的PAHs含量，随老化时间的变化规律如图 2所示. 与其他研究相似^[35]，随着老化时间的延长，非耗竭性化学提取量逐渐减少，但每个方法之间提取量的差异略显不同.

图 2

Fig. 2

图 2 不同非耗竭性化学提取法提取的土壤中PAHs量随老化时间的变化 Fig. 2 Different nonexhaustive extracted PAHs concentration in different aged soils

PAHs的Tenax提取量[图 2(a)和2(b)]经方差分析显示，两种土壤中，除苯并[a]芘在30 d时基本达到稳定外，菲和芘的提取量60 d内一直在减少，并且每个时间点之间的差异都很显著，表明菲和芘仍在不断与土壤有机质结合或扩散进入纳米微孔结构，而苯并[a]芘在老化30 d后与土壤有机质结合或扩散进入纳米微孔结构的过程已经基本完成.

HPCD提取量[图 2(c)和2(d)]经方差分析显示，在两种土壤中，3种PAHs在0、 7、 15、 30、 60 d这5个时间点的提取浓度，随着老化时间的延长而减少，并且差异均达到显著水平.

正丁醇提取量[图 2(e)和2(f)]经方差分析显示，在黄壤中，菲在0、 7、 15、 30 d的提取量逐渐减少，并且差异显著，60 d的提取量与30 d相比略有减少，但差异不显著，基本达到平衡. 对于芘和苯并[a]芘，各老化时间的提取量差异都达到显著水平; 而在红壤中，3种PAHs在各老化时间的提取量都存在显著差异.

由以上实验数据可知，老化时间显著改变了PAHs的赋存状态. 随着老化时间的延长，PAHs与土壤有机质结合增加，进入土壤空隙结构增多，被温和溶剂提取的能力显著降低，被土壤生物利用的能力也显著降低^{[27, 37]}.

为比较不同非耗竭性化学提取剂的提取能力，采用提取率作为指标. 提取率为非耗竭性化学提取量与耗竭性提取总量的百分比值. 由于老化时间不同，非耗竭性提取剂提取的PAHs的含量不同，耗竭性提取的总量也不同，因此给比较带来了不确定性. 经过上文分析(2.1节)，发现耗竭性提取总量在污染土壤老化30 d后含量基本无变化，达到相对稳定时期(如图 1)，因此选取30 d的老化污染土进行不同非耗竭性化学提取剂对PAHs提取能力的比较. 对于同一种提取方法，PAHs种类的不同，其提取能力相差很大(图 3). 在两种土壤中，Tenax的提取能力为菲>芘>苯并[a]芘，即随着环数的增加，Tenax的提取能力显著减小; HPCD的提取能力为菲>芘>苯并[a]芘，提取能力也随着环数的增加在减少，但不如Tenax提取变化那样显著，正丁醇的提取能力为菲<芘<苯并[a]芘，提取能力随环数的增加而增大.

图 3

Fig. 3

图 3 3种非耗竭性化学提取方法对土样中PAHs的提取率比较 Fig. 3 Comparison of PAHs nonexhaustive extraction percentage in soils with different chemical agents

同一种污染物，不同的提取剂提取能力相差很大，表现出的特点是，对菲和芘的提取能力：Tenax提取>HPCD提取>正丁醇提取; 对于苯并[a]芘：Tenax提取

导致这样的结果可能与各非耗竭性提取方法的机制以及污染物的理化性质相关：Tenax提取解吸进入土壤水的那部分PAHs，而污染物从土壤颗粒解吸的潜力与溶解度密切相关，菲在水相的溶解度高于芘和苯并[a]芘，因此Tenax对菲的提取能力高于芘和苯并[a]芘; 正丁醇有很强的脂溶性，是一种比HPCD提取能力更强的化学提取剂^[8]，与PAHs有很强的相似相溶性^[38]，因此亲脂性(辛醇-水分配系数)越高的苯并[a]芘则被正丁醇提取越高; 而HPCD是环外带有羟基的环状结构，环外亲水，环内亲脂，它对亲水性和疏水性的污染物都表现出一定的溶解能力，因此提取能力介于Tenax和正丁醇之间.

为验证不同化学提取法提取的PAHs能否表征污染土壤中PAH的生物有效性，采用蚯蚓富集的生物学方法来进行验证. 如图 4所示，耗竭性提取总量与蚯蚓富集量之间相关性不显著(R2为0.44~0.56)表明，耗竭性提取总量存在高估蚯蚓的富集能力以及高估PAHs污染风险的可能性，因此不能用来评估PAHs的生物有效性; 3种非耗竭性提取剂提取的PAHs的量与蚯蚓富集量呈显著的线性关系(Tenax提取、 HPCD提取以及正丁醇提取相关系数R2分别为：0.62~0.87、 0.94~0.99以及0.69~0.94)表明，非耗竭性提取法在一定程度上可以用于PAHs生物有效性的评价^{[39, 40, 41, 42]}. 从结果的相关程度来看，HPCD提取量与蚯蚓蓄积量之间的相关性优于Tenax提取和正丁醇提取，在预测PAHs的生物有效性方面表现更好，该结果与其它研究结果一致^{[9, 27]}. 这与HPCD具有独特的双亲结构密切相关，HPCD是环外带有羟基的环状结构，环外亲水，环内亲脂. 它能够增加有机物的可溶性，使潜在解吸的组分从土壤颗粒释放，该机制可能和蚯蚓肠道内物质对PAHs的吸收具有一定程度的相似性，因此表现出HPCD提取量与蚯蚓富集量的相关性最好^[30]. 而Tenax可以将PAHs吸附在表面，导致PAHs在土壤水相和固相之间的热力学平衡被打破，从而促进与土壤结合比较弱的那部分PAHs不断解吸进入土壤孔隙水中，但蚯蚓是靠吞食带有污染物的土壤，一部分PAHs在肠道中因解吸被富集，还有一部分PAHs因肠道内物质的增溶作用解吸而被富集，因此表现出Tenax提取量低于蚯蚓富集量^[41]; 然而，正丁醇对土壤中的菲和芘的提取能力低于蚯蚓富集，对苯并[a]芘的提取又高于蚯蚓富集，这跟正丁醇与各PAHs之间的分子相互作用相关. 更深入的认识需要进一步研究^{[29, 41, 43]}.

图 4

Fig. 4

图 4 土壤中PAHs的不同化学提取量与蚯蚓蓄积量之间的相关关系 Fig. 4 Correlation between chemical extracted PAHs concentration using different methods and accumulated concentration in earthworms in soils

此外，土壤类型对化学提取量与蚯蚓蓄积量之间的相关性有一定的影响，Cornelissen等^[44]研究发现土壤对有机污染物的固持能力与有机质的含量和土壤微孔结构密切正相关. 总体看来，黄壤中有机质含量高于红壤，所以对PAHs的固持能力相对较强，不容易被化学溶剂提取. 另外黄壤小于0.05 mm的土壤颗粒占86%，而红壤只有58%，黄壤要比红壤的微空隙结构较多，更多的PAHs进入微孔，更难被解吸出来. 然而这一部分的PAHs却可以被蚯蚓利用，所以表现出在黄壤中蚯蚓富集量与化学提取量相关系数偏大的结果，拟合曲线斜率大于红壤中二者拟合曲线斜率.

(1)随着老化时间的延长，污染土壤中PAHs的提取量显著降低. 耗竭性提取总量在30 d以后基本达到稳定水平.

(2)Tenax树脂法对土壤中的菲和芘的提取量较高，对苯并[a]芘则较低，正丁醇对苯并[a]芘的提取量较高，HPCD的提取能力介于二者之间.

(3)ASE耗竭性提取总量高估了土壤中PAHs的存在风险，并且与蚯蚓富集量没有显著的相关性(R²为0.44~0.56)，因此不能用总量来评估污染土壤PAHs的生物有效性; 然而HPCD提取量与蚯蚓体内PAHs富集量有显著正相关(R²为0.95~0.99)，可以将HPCD提取法作为预测污染土壤中PAHs生物有效性的较为理想的方法.