多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指两个或两个以上苯环或环戊二烯稠合而成的化合物^[1]，主要来源于各种矿物燃料及有机物的不完全燃烧，并广泛存在于大气、 水体、 土壤等环境介质中. 石油化工、 钢铁制造、 煤焦油炼制等工业过程是高职业暴露污染源^{[2, 3, 4]}; 而燃煤排放、 交通污染、 个人习惯、 膳食、 吸烟暴露等被认为是非职业暴露的主要影响因素^{[5, 6, 7, 8, 9]}. PAHs作为一种痕量的致癌、 致畸、 致突变的“三致”物质，无疑会对人类的身体健康带来一定的影响，如PAHs的暴露可损害呼吸系统、 新生儿神经系统、 破坏淋巴细胞、 降低DNA修复能力等^{[10, 11, 12, 13]}，因此了解个体PAHs内暴露水平有利于评价区域PAHs暴露的健康风险.

近年来，针对儿童这一敏感人群的PAHs内暴露水平研究越来越多，多数报道仅采用1-OHP作为生物标志物来评价区域内个体的羟基多环芳烃(hydroxyl-polycyclic aromatic hydrocarbons，OH-PAHs)暴露水平，例如乌克兰学者 Mucha等^[14]、 丹麦学者Hansen等^[15]. 但岳强等^[16]、 Zhang等^[17]学者表示只有当PAHs污染相对较高时，才可以用1-OHP作为生物标志物，否则很难全面地反映有机体对环境污染物的实际负荷水平. 也有学者采用多种OH-PAHs的联合监测来反映环境和人为活动中PAHs的实际暴露水平^[18,19].

石同幸等^[20]、 段菁春等^[21]、 毕新慧等^[22]研究表明广州市大气环境中PAHs污染水平相对较高，尤其是冬季灰霾天气及有明显污染源(如餐饮等)时，大气中PAHs对人体健康的危害应引起高度重视. 就此本研究选取了广州市居民区及工业区的两所小学为暴露人群监测点，进行尿液采集，并利用快速液相色谱-三重四级杆串联质谱仪同时检测了10种OH-PAHs浓度，以期为评价广州市部分小学生PAHs的内暴露水平提供数据. 其中，居民区位于广州市南部大学城内，无明显污染物排放源，机动车尾气可能是潜在的影响因素，而工业区位于广州东部，除了受石化污染的影响外，周边物流公司频繁的重型汽车也可能是一个重要的影响因素. 两个区域均处于珠三角城市群，相距约15 km，且居民区不在工业区的主导风向上.

本研究于2014年9月15~20日同时采集了广州市居民区及工业区两所小学四年级学生的晨尿，将达到指定量的生物样品带回实验室，于-80℃超低温冰箱中冷冻保存，直至样品分析. 居民区小学生78名，平均年龄为7.88±0.82岁，工业区小学生86名，平均年龄8.12±0.89岁. 问卷调查表明，两个区域小学生性别、 年龄、 家庭经济水平等无显著差异.

仪器：12位固相萃取装置(Supelco)、 氮吹仪(EYELA MG-2200)、 快速液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(Agilent 1260/ABSIEX 4000Q)、 高效液相色谱仪(DGU-20As)、 涡旋仪、 恒温振荡器及离心机等.

试剂：甲醇(购自Budick&Jackson)、 醋酸及盐酸(购自广州化学试剂厂)等.

标准品：包括10种OH-PAHs标准品(1-OHN、 2-OHN、 2-OHF、 3-OHF、 1-OHPhe、 2-OHPhe、 3-OHPhe、 4-OHPhe、 9-OHPhe、 1-OHP)和2种同位素标记的OH-PAHs(氘代3-羟基菲、 ¹³ C-1-羟基芘)，均购自美国MRI.

其他耗材：聚乙烯塑料管、 特氟龙离心管、 C18固相萃取柱(Sep-Pak，Waters)、 针头过滤器及0.2 μm尼龙滤头等.

(1)样品的前处理

取2.0 mL解冻后的尿液于特氟龙离心管中，加入盐酸(0.2 mol ·L^-1)调整pH为5.0后，依次加入10.0 μL β-葡糖苷酸-芳基硫酸酯酶、 3.0 mL醋酸铵缓冲溶液(0.1 mol ·L^-1)、 10.0 μL回收率指示物氘代3-羟基菲，样品经涡旋仪充分混合后，恒温振荡(37.5℃、 170 r ·min^-1)12 h以上，并以3 000r ·min^-1的速度离心10 min; 离心结束后用C18固相萃取柱净化，C18小柱先用5.0 mL甲醇和10.0 mL去离子水活化，然后上样，随后用4.0 mL去离子水、 4.0 mL甲醇溶液(30%)淋洗固相萃取柱，并弃掉淋洗液，淋洗液流干后，固相萃取装置持续保持真空状态约1 min后，用8.0 mL甲醇洗脱柱子，并收集淋洗液，整个萃取过程中，流速保持在1.0mL ·min^-1左右; 净化后的样品在柔和的氮气下氮吹浓缩至200.0 μL左右，用0.2 μm的针头过滤器过滤，最后，添加10.0 μL ¹³ C-1-羟基芘作为内标，保存在带有尖底的进样瓶中，并利用快速液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测; 利用高效液相色谱仪测定肌酐，以校准尿液中OH-PAHs浓度. 本研究中涉及到的OH-PAHs浓度均以肌酐校正值表示(单位：μmol ·mol^-1，肌酐校准).

(2)仪器测定的条件和过程

快速液相色谱条件设定：以甲醇和水做流动相，反相C18色谱柱分析(ZORBAXSB-C18)，柱温设置为30℃，梯度洗脱条件为：流动相中甲醇的浓度在25 min内从55%上升到81.8%，流速为0.25 mL ·min^-1.

串联质谱条件设定：离子源为电喷雾电离源，负离子模式检测，扫描方式为MRM监测，电喷雾电压为-3 000 V，温度为360℃. MRM模式下的离子对和碰撞能量选择见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 羟基多环芳烃检测的质谱条件 Table 1 MS condition for the detection of hydroxy-PAHs OH-PAHs MS1 MS2 DP EP CE CXP 2-OHN 142.9 114.9 -75 -10 -36 -3 1-OHN 142.8 114.7 -80 -10 -34 -5 2-OHF 180.9 152.9 -95 -10 -30 -7 1-OHPhe 192.9 164.9 -100 -10 -42 -7 2-OHPhe 192.9 164.9 -110 -10 -40 -7 3-OHPhe 192.9 164.8 -100 -10 -32 -7 4-OHPhe 192.9 164.8 -95 -10 -42 -7 1-OHP 216.9 188.8 -110 -10 -44 -9

表 1 羟基多环芳烃检测的质谱条件 Table 1 MS condition for the detection of hydroxy-PAHs

羟基多环芳烃的仪器检出限为3.2~15 ng ·L^-1，方法检出限为10~50 ng ·L^-1. 实验过程中，所有样品均采用10%的实验室空白、 10%的空白加标以及10%的随机平行样品的实验室质控措施. 结果显示，实验室空白中未检出羟基化合物，空白样品的加标回收率在85.2%~99.8%之间，平行样品的相对标准偏差在3.31%~9.56%之间，均满足实验室检测要求.

广州市居民区及工业区受试样品中均检测出10种OH-PAHs，分别为：2-羟基萘(2-OHN)、 1-羟基萘(1-OHN)、 2-羟基芴(2-OHF)、 3-羟基芴(3-OHF)、 2-羟基菲(2-OHPhe)、 3-羟基菲(3-OHPhe)、 1-羟基菲(1-OHPhe)、 9-羟基菲(9-OHPhe)、 4-羟基菲(4-OHPhe)和1-羟基芘(1-OHP)，检测结果见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 小学生尿液中羟基多环芳烃的含量 (肌酐校准)/μmol ·mol-1 Table 2 Concentrations of hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students (creatinine corrected)/μmol ·mol-1 OH-PAHs 居民区(n=78) 工业区(n=84) 差异性检验(K-W检验) 中位数 几何平均值 算术平均值±标准偏差 数值范围 中位数 几何平均值 算术平均值±标准偏差 数值范围 2-OHN 2.39 2.37 3.43±3.79 0.40~24.37 2.35 2.65 4.18±5.02 0.32~29.06 0.488 1-OHN 1.61 1.57 2.96±6.25 0.19~51.56 1.31 1.58 3.01±4.70 0.20~34.49 0.755 2-&3-OHF1) 0.60 0.60 0.82±0.70 0.09~3.37 0.60 0.62 0.91±0.91 0.10~5.13 0.799 2-OHPhe 0.13 0.13 0.19±0.22 0.02~1.50 0.11 0.12 0.15±0.13 0.03~0.80 0.280 3-OHPhe 0.30 0.29 0.39±0.32 0.04~1.50 0.23 0.24 0.31±0.23 0.05~1.18 0.155 1-&9-OHPhe1) 0.45 0.46 0.71±0.87 0.03~6.51 0.39 0.38 0.49±0.39 0.10~2.48 0.096 4-OHPhe 0.08 0.07 0.11±0.10 0.002~0.52 0.06 0.06 0.08±0.07 0.061 1-OHP*2) 0.20 0.20 0.31±0.34 0.005~0.52 0.12 0.11 0.20±0.24 0.002~1.57 0.001 ∑OH-PAHs 6.85 6.18 8.91±10.57 0.83~80.63 6.27 6.47 9.33±10.27 1.06~72.47 0.224 1)由于2-OHF和3-OHF、 1-OHPhe和9-OHPhe无法通过液相色谱柱分离，因此用2-&3-OHF和1-&9-OHPhe来表示; 2)*表示二者的差别具有统计学意义，P<0.05

表 2 小学生尿液中羟基多环芳烃的含量 (肌酐校准)/μmol ·mol-1 Table 2 Concentrations of hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students (creatinine corrected)/μmol ·mol-1

由表 2可以看出，居民区和工业区小学生尿液中∑OH-PAHs 分别为0.83~80.63 μmol ·mol^-1和1.06~72.47 μmol ·mol^-1，几何均值为6.18 μmol ·mol^-1和6.47 μmol ·mol^-1，居民区略低于工业区(无统计学意义，P>0.05). 两个区域检出含量最高的均为2-OHN，几何均值为2.37 μmol ·mol^-1和2.65 μmol ·mol^-1，最低的为4-OHPhe，几何均值为0.07 μmol ·mol^-1和0.06 μmol ·mol^-1.

其次，居民区2-OHN、 1-OHN、 2-&3-OHF的暴露水平低于工业区，2-OHPhe、 3-OHPhe、 1-&9-OHPhe、 4-OHPhe和1-OHP的暴露水平高于工业区，除1-OHP之间的差异性具有统计学意义外(P<0.05)，其他组分之间均无显著性差异. Cocco等^[7]、 钟俊俊等^[8]研究发现志愿者摄食烧烤等食品后，尿液中1-OHP含量会明显升高; 捷克学者Fiala等^[23]、 加拿大学者Vyskocil等^[24]研究表明，即使暴露在高浓度的PAHs空气污染中，食物也是主要的芘污染来源. 因此，该研究中居民区相对较高的1-OHP暴露水平可能与学生的饮食暴露差异有关.

近年来，美国、 德国、 泰国、 中国等相继报道了学生尿液中OH-PAHs的暴露水平，如表 3所示. 可以看出，广州市居民区和工业区小学生尿液中2-OHN、 2-&3-OHF、 2-OHPhe、 3-OHPhe、 1-&9-OHPhe、 4-OHPhe的暴露水平基本上均高于美国疾控中心第四次人体暴露调查报告、 美国普通儿童、 泰国交通污染地区儿童的暴露水平，是其1.02~3.62倍，但明显低于南方某中学、 南方某幼儿园、 广州钢铁焦化厂附近学生的暴露水平; 1-OHN则明显低于美国、 德国、 泰国以及国内一些研究成果中的报道; 居民区1-OHP的暴露水平明显高于第四次美疾控、 美国、 德国、 泰国等地区的研究结果，而工业区1-OHP的暴露水平相对较低，与第四次美疾控的暴露水平相当.

表 3(Table 3)

表 3 小学生尿液中羟基多环芳烃的浓度与国内外其他研究成果的比较 1)(肌酐校准)/μmol ·mol-1 Table 3 Comparison of the concentrations of hydroxyl-PAHs in this study and other studies(creatinine corrected)/μmol ·mol-1 地区 2-OHN 1-OHN 2-&3-OHF 2-OHPhe 3-OHPhe 1-&9-OHPhe 4-OHPhe 1-OHP 文献 第四次美疾控 2.24 1.89~2.65 1.63 1.43~1.86 0.34 0.10~0.25 0.05 0.04~0.05 0.12 0.11~0.14 0.15 0.13~0.16 0.03 0.02~0.03 0.12 0.10~0.14 [25] 美国普通儿童 1.89 1.74~2.07 1.60 1.32~1.93 0.39 0.10~0.32 0.05 0.04~0.05 0.12 0.10~0.14 0.16 0.02~0.15 0.04 0.03~0.06 0.07 0.06~0.08 [26] 德国普通儿童 — — — — — — 0.23 0.37 0.04~1.27 0.40 0.05 0.14 [27] 南方某中学 4.27 0.58~14.95 — — 1.74 0.68~6.17 0.25 0.09~0.69 — — 0.72 0.19~4.94 0.02 0.22 0.06~0.58 [28] 南方某幼儿园 10.21 2.33~50.4 — — 4.74 1.01~29.26 0.13 — — 1.51 0.05 0.45 0.10~1.64 [29,30] 广州钢铁焦化厂 6.72 1.59~30.07 — — 4.70 1.07~55.86 0.10 0.03~1.00 — — 1.05 0. 45~8. 98 0.03 0.50 0.17~11.93 [31] 泰国交通污染 2.74 0.69~7.59 4.67 2.53~7.28 0.37 0.13~0.87 0.11 0.04~0.14 0.11 0.04~0.21 0.13 0.02~0.29 0.03 0.01~0.09 0.18 0.10~0.50 [32] 广州市居民区 2.37 0.40~24.37 1.57 0.19~51.56 0.60 0.09~3.37 0.13 0.02~1.50 0.29 0.04~1.50 0.47 0.03~6.51 0.07 0.002~0.52 0.20 0.005~0.52 本研究 广州市工业区 2.65 0.32~29.06 1.58 0.20~34.49 0.62 0.10~5.13 0.12 0.03~0.80 0.24 0.05~1.18 0.38 0.10~2.48 0.06 0.11 0.002~1.57 本研究 1)“—”表示文章中没有相关数据

表 3 小学生尿液中羟基多环芳烃的浓度与国内外其他研究成果的比较 1)(肌酐校准)/μmol ·mol-1 Table 3 Comparison of the concentrations of hydroxyl-PAHs in this study and other studies(creatinine corrected)/μmol ·mol-1

可见，两区域中低环PAHs如萘、 芴、 菲的内暴露水平均有着相同的变化趋势，这是因为萘、 芴、 菲主要分布在大气气相中，所以，其内暴露水平也会受到环境空气中萘、 芴、 菲的影响，而多环芘则主要吸附在颗粒相中，在食物中的相对含量较高，因此，对于芘来说，饮食暴露是一个主要的影响因素. 总的来说，与国内其他研究结果相比，广州市小学生体内多环芳烃的内暴露水平相对较低，但相比国外的一些研究，广州市小学生体内多环芳烃污染还需引起注意.

如图 1所示，居民区小学生尿液中∑OHN、∑OHPhe、∑OHF、∑OHP所占比例分别为： 71.71%、 15.61%、 9.15%、 3.53%，工业区小学生尿液中 ∑OHN、∑OHPhe、∑OHF、∑OHP所占比例分别为： 77.02%、 11.06%、 9.79%、 2.14%，可见，居民区和工业区小学生尿液中OH-PAHs均以二、 三低环数的羟基萘、 羟基菲、 羟基芴为主，这与赵波等^[33]对石化企业普通人群尿液中OH-PAHs的组成特征类似， 且均表现出∑OHN>∑OHPhe>∑OHF>∑OHP的规律.

图 1

Fig. 1

*表示二者的差异性具有统计学意义，P<0.05 图 1 小学生尿液中羟基多环芳烃的组成特征 Fig. 1 Composition of hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students

其次，采用SPSS 21.0中的K-W检验对居民区和工业区小学生尿液中各OH-PAHs单体之间的组成特征进行差异性分析，结果显示，研究区域小学生尿液中2-OHN、 4-OHPhe及1-OHP之间的差别具有统计学意义(P<0.05)，其他组分无显著差异.

样品中OH-PAHs不同组成之间的相关性可以指示其来源，由于样本中OH-PAHs的平均浓度均不符合正态分布，故采用SPSS 21.0中的Spearman函数进行双尾检测来分析小学生尿液中OH-PAHs之间的相关性，结果见表 4、 表 5.

表 4(Table 4)

表 4 居民区小学生体内羟基多环芳烃的相关性 1) Table 4 Correlation among hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students in the residental zone (n=78) 2-OHN 1-OHN 2-&3-OHF 2-OHPhe 3-OHPhe 1-&9-OHPhe 4-OHPhe 1-OHP 2-OHN 1 0.879** 0.633** 0.605** 0.632** 0.630** 0.600** 0.576** 1-OHN 1 0.519** 0.527** 0.582** 0.593** 0.566** 0.511** 2-&3-OHF 1 0.775** 0.802** 0.755** 0.651** 0.726** 2-OHPhe 1 0.928** 0.866** 0.859** 0.780** 3-OHPhe 1 0.878** 0.831** 0.830** 1-&9-OHPhe 1 0.816** 0.842** 4-OHPhe 1 0.737** 1-OHP 1 1)**表示相关性在0.01显著， 下同

表 4 居民区小学生体内羟基多环芳烃的相关性 1) Table 4 Correlation among hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students in the residental zone

表 5(Table 5)

表 5 工业区小学生体内羟基多环芳烃的相关性 Table 5 Correlation among hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students in the industrial zone (n=84) 2-OHN 1-OHN 2-&3-OHF 2-OHPhe 3-OHPhe 1-&9-OHPhe 4-OHPhe 1-OHP 2-OHN 1 0.839** 0.467** 0.466** 0.428** 0.376** 0.552** 0.201 1-OHN 1 0.447** 0.353** 0.338** 0.357** 0.442** 0.164 2-&3-OHF 1 0.658** 0.707** 0.678** 0.577** 0.517** 2-OHPhe 1 0.855** 0.794** 0.616** 0.622** 3-OHPhe 1 0.846** 0.663** 0.755** 1-&9-OHPhe 1 0.550** 0.724** 4-OHPhe 1 0.404** 1-OHP 1

表 5 工业区小学生体内羟基多环芳烃的相关性 Table 5 Correlation among hydroxyl-PAHs in the urine of primary school students in the industrial zone

由表 4、 表 5可以看出，居民区小学生体内OH-PAHs之间均存在显著相关性(P<0.01)，相关系数在0.511~0.928之间. 这或许是因为居民区环境空气中PAHs仅来源于交通污染的影响，其暴露来源的单一性使得小学生体内OH-PAHs之间有着良好的相关性. 与居民区不同的是，工业区小学生尿液中除1-OHP与2-OHN、 1-OHN之间无显著相关性外，其他OH-PAHs单体之间均显著相关(P<0.01)，相关系数在0.338~0.855之间. 这可能是工业区环境空气中PAHs受石化工业排放及物流交通共同影响的结果.

居民区与工业区OH-PAHs之间的相关性存在着一定的差异. 由于两区域小学生在生活习惯及家庭经济水平等方面不存在明显的差异，因此，空气呼吸暴露差异以及由于大气颗粒物扩散、 沉降引起的其他暴露途径差异可能是导致两个区域小学生OH-PAHs暴露特点不同的重要原因. 这也表明，对尿液中多种OH-PAHs的同时检测较仅检测单个的OH-PAH能更准确地评估个体的实际暴露水平.

(1)广州市居民区和工业区小学生体内∑OH-PAHs 分别为6.18μmol ·mol^-1和6.47μmol ·mol^-1，居民区略低于工业区(无统计学意义，P>0.05); 就OH-PAHs单体而言，居民区2-OHN、 1-OHN、 2-&3-OHF的暴露水平低于工业区，2-OHPhe、 3-OHPhe、 1-&9-OHPhe、 4-OHPhe和1-OHP的暴露水平高于工业区，除1-OHP之间的差异性具有统计学意义外(P<0.05)，其他组分之间无显著性差异. 与国内外其他研究成果相比，广州市小学生体内多环芳烃污染还需引起重视.

(2)广州市居民区和工业区小学生体内OH-PAHs均以二、 三环的羟基萘、 羟基菲、 羟基芴为主， 且均表现出∑OHN>∑OHPhe>∑OHF>∑OHP的规律.

(3)广州市居民区及工业区小学生体内OH-PAHs单体之间相关性的差异说明采用多种OH-PAHs作为生物标志物来表征个体的实际暴露水平更可靠.