细菌内毒素又称脂多糖，是革兰氏阴性细菌和某些蓝藻的细胞壁组分物质，活菌释放较少，主要由菌体解体后释放^[1]. 内毒素是常见的外源性致热原，属于强免疫刺激因子，具有广泛的生物活性，与多种人类疾病密切相关. 机体对内毒素反应极为敏感，Elin等^[2]报道了使用0.1~0.5 ng ·kg^-1内毒素进行体内注射可以引起人体的发热反应. 内毒素具有极强的耐热性，100℃高温下加热1 h仍无法灭活，160℃条件下加热2~4 h，或用强碱、 强酸或强氧化剂加温煮沸30 min才能破坏它的生物活性，因此常规消毒措施和处理工艺不易将其去除. 为了保证与血液接触的药品、 医疗器械及医疗用水的安全性，内毒素检查一直被认为是医药行业的重要检验项目.

当水中微生物增殖或者蓝藻暴发，菌体自然死亡或者经过消毒处理后释放的大量内毒素，可以通过呼吸和胃肠暴露等途径危害机体健康. 近年来，国外研究中饮用水的内毒素污染报道逐年增多，但是国内外尚没有将内毒素列入饮用水水质标准，世界卫生组织(WHO)也没有规定饮用水中内毒素的限值^[3]. 内毒素在水体中存在形态比较复杂，分为游离态内毒素和结合态内毒素，均具有内毒素活性. 游离态内毒素指以溶解状态在水中游离存在的内毒素分子. 结合态内毒素会受到水中悬浮颗粒物、 细菌总数和蓝藻数量等多种参数的影响，主要分为以下三类：①当细菌或者蓝藻死亡后，与菌体残体相连的内毒素分子. ②附着在水中悬浮颗粒物表面的内毒素. ③由于内毒素分子具有两亲性，容易聚集成团从而形成体积较大的内毒素聚集体等. 水体流速和流态对不同存在形态内毒素会产生影响，而且不同的水处理工艺会对不同形态内毒素的控制效果产生差异^[4]. 自备井是驻扎城市郊区和边远地区基层部队的主要水源. 由于部队驻地偏远分散，自备井水质特征差别较大，部队管理难度大，其中微生物和内毒素污染更容易直接影响官兵健康. 本研究对驻京部队14个自备井水源内毒素污染水平开展调查，分析了内毒素的两种存在形态所占比例，并同时检测了细菌学指标、 颗粒物特征、 浊度、 溶解性有机碳(DOC)和UV₂₅₄，探讨了内毒素活性与这些水质参数的相关性，旨在为自备井水源的水处理工艺选择提供科学依据.

无热原稀释试管(15 mm×100 mm)、 无热原反应试管(8 mm×75 mm)和无热原移液器吸头购买自湛江安度斯生物公司. 其他玻璃器皿经铬酸浸泡24 h，热自来水冲洗，超纯水冲洗，马弗炉干烘350~400℃ 2 h去除热原.

ATI320-06动态试管仪及配套软件(Lab Kinetic公司，英国)、 流式细胞仪(Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA,美国)、 EyeTech颗粒计数仪(安米德公司,荷兰)、 O. I. Analytical Aurora 1030 TOC分析仪、 TU-1901型双光束紫外可见光分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)、 HACH-2100P 便携式浊度计(HACH公司，美国)、 Pb-21酸度计(Sartorius公司，德国)、 Mill-Q纯水机(Millpore公司，美国)、 涡旋混合器、 马弗炉、 移液器. 动态浊度法鲎试剂(最低检测限0.03 EU ·mL^-1)、 无热原检查用水(<0.003 EU ·mL^-1)和无热原Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液购买自湛江安度斯生物公司. 内毒素工作标准品(control standard endotoxin，CSE，批号150601，每支90 EU)购买自中国药品生物制品检定所(北京). R2A培养基(Difco^TM R2A Agar，BD，Becton,Dickinson and Company，美国)，营养琼脂(Nutrient Agar，北京奥博星生物技术有限责任公司)，SYBR Green I (北京泛博生物化学有限公司)，DMSO(Amresco公司，美国).

在2013年5月对驻京部队14个自备井水源进行采样，采样容器均为无热原器皿，采样结束后，运输途中的水样需要低温(4℃)保存，到达实验室后立刻进行样品测试.

采用动态浊度法鲎试验定量检测内毒素活性，将0.1 mL鲎试剂加入反应管，加入0.1 mL样品混合均匀，立即放入ATI320-06动态试管仪进行检测. 样品和鲎试剂在37℃温育条件下发生凝集反应，ATI320-06动态试管仪及软件生成每个样品的反应动态曲线，记录反应试管在波长405 nm处达到95%透光率的达限时间. 样品的达限时间和所含内毒素活性负相关，根据标准曲线来确定样品内毒素活性. 每个样品采用2个平行样，并以0.1 EU ·mL^-1CSE溶液作为阳性对照，记录回收率、 稀释倍数、 达限时间等其他参数. 样品测试3次取均值. 试验结果应满足以下条件：①标准曲线中阴性对照的达限时间长于最低活性(0.031 25 EU ·mL^-1)的达限时间. ②标准曲线相关系数R大于0.98. ③平行样的变异系数不得大于10%. ④根据药典规定，加标回收率在50%~200%之间认为稀释倍数合适，没有明显的干扰^[5].

测试过程中水样用6 000 r ·min^-1离心15 min，上清液的内毒素活性是游离态内毒素，而离心前水样的内毒素活性为总内毒素，总内毒素活性减去游离态内毒素活性的差值就是结合态内毒素^[3].

将核酸染料SYBR Green Ⅰ在DMSO溶液中按1 ∶100稀释，最终稀释浓度为10 μL ·mL^-1. 采用96微孔板，加入100 μL水样后加1 μL稀释后的SYBR Green I对水中细菌染色，摇匀后20℃避光孵化25 min. 如样品中细菌浓度过高，需要稀释后测量，细菌浓度范围控制在3×10⁴~2×10⁶ cells ·mL^-1. 采用流式细胞仪(Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA,美国)进行细菌计数. 所测试的细菌总数为水中活菌和死菌的总和. 每个样品测试3次取平均值.

采用倾倒法进行异养菌平板计数，采用R2A培养基，培养温度为22℃，时间为168 h. 每个样品测试3次取平均值.

按照GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法-微生物指标》菌落总数 (琼脂倾注法) 测定^[6].

按照GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法-微生物指标》总大肠菌群检验(滤膜法)测定^[6].

采用EyeTech颗粒计数仪(安米德公司，荷兰)测试水中颗粒物的粒径分布和颗粒物总数，其颗粒物粒径的范围是0.1~3 600 μm，颗粒物测试的最大浓度为10⁹个 ·mL^-1.

采用HACH-2100P 便携式浊度计对水样的浊度进行测定.

经Millpore滤膜(0.45 μm)过滤后，通过O. I. Analytical Aurora 1030 TOC分析仪测定溶解性有机碳.

经Millpore滤膜(0.45 μm)过滤后，通过TU-1901型双光束紫外可见光分光光度仪测定UV₂₅₄的数值.

自备井水源的内毒素活性如图 1所示，总内毒素活性为0.15~13.20 EU ·mL^-1，游离态内毒素活性为0.10~5.29 EU ·mL^-1，结合态内毒素活性为0.01~8.60 EU ·mL^-1. 由于本研究中采样的部队营区非常分散，自备井水源水质污染特征不同，图 1所示14个自备井内毒素活性差异较大. 其中 1~6号样品的内毒素污染水平较低，总内毒素活性都低于0.50 EU ·mL^-1. 7~14号样品内毒素污染水平较高，其中 6个样品(除10号和12号之外)均是结合态内毒素所占比例明显高于游离态内毒素，9号样品的结合态内毒素比例最高达91.50%. 这表明在内毒素污染严重的自备井水源中，内毒素主要是以3种形式(内毒素聚集体、 附着在颗粒物表面的内毒素、 与菌体残体相连的内毒素)的结合态内毒素存在. 国内外研究中关于地下水源和地表水源的内毒素污染已有少量报道. Korsholm等^[7]研究表明233个地下水样品(包括原水、 处理后出水、 末梢水)的内毒素活性范围为1~200 EU ·mL^-1，其中大多数处于1~30 EU ·mL^-1范围. Goyal等^[8]报道了污水土地利用地域的地下水内毒素活性范围为0.3~480 ng ·mL^-1(1 ng为5~10 EU). 北京市水源-河北4个水库水在北京-石家庄段输送断面中内毒素活性为21.29~41.12 EU ·mL^{-1[9]; 密云水库水的内毒素活性为24.80 EU ·mL-1; 京密引水渠中内毒素活性为68.20 EU ·mL-1 [4]. 我国长江(武汉段)、 汉江(武汉段)的内毒素活性分别为100.98 EU ·mL-1和86.40 EU ·mL-1 [10]. 与前述报道中地表水源和受污染地下水源的内毒素污染水平相比，图 1所示的自备井水源内毒素活性范围略低.}

图 1

Fig. 1

图 1 自备井水源的内毒素污染特征 Fig. 1 Endotoxin contamination of groundwater in self-contained wells

自备井水源的细菌总数(流式细胞术法)检测值为4 000~308 000 cells ·mL^-1[图 2(a)]，HPC为24~87 200 CFU ·mL^-1[图 2(b)]，菌落总数(平板法)为7~2 020 CFU ·mL^-1[图 2(c)]，总大肠菌群为8~1 810 CFU ·100 mL^-1[图 2(d)]. 总内毒素和细菌学指标的关联顺序为细菌总数-流式细胞术法(r=0.88)>HPC(r=0.79)>总大肠菌群(r=0.50)>菌落总数-平板法 (r=0.49). 在内毒素的两种存在形态中，结合态内毒素包含与菌体残体相连的内毒素分子，与水中菌体残体数量相关性大; 游离态内毒素是由菌体解体后释放到水中，与水中活菌或者死菌相关性都较小. 图 2表明结合态内毒素与细菌学指标关联顺序为细菌总数-流式细胞术法 (r=0.81)>HPC(r=0.66)>总大肠菌群(r=0.65)>菌落总数-平板法(r=0.22). 如图 2所示，与HPC、 菌落总数(平板法)和总大肠菌群这3种培养计数方法相比，细菌总数(流式细胞术法)和总内毒素、 结合态内毒素的相关性最高，原因是结合态内毒素和死亡菌体相关，而细菌总数(流式细胞术法)包含死菌和活菌的数量，培养计数方法却只能表征活菌数量. 从中可知，在3种培养计数方法中，HPC与总内毒素、 结合态内毒素的相关性明显高于菌落总数(平板法)和总大肠菌群，表明R2A培养基比较适于培养与内毒素相关的细菌. Evans等^[11]报道河流水样的总内毒素与HPC的相关系数为r=0.88,结合态内毒素与HPC的相关系数为r=0.95. Korsholm等^[12]报道了229个未加氯的饮用水中总内毒素和HPC的相关系数为r=0.60. Jorgensen等^[13]报道了再生水中总内毒素与菌落总数(平板法)的相关系数为r=0.73,总内毒素与总大肠菌群的相关系数为r=0.82. 前述研究表明水中内毒素活性与细菌学指标之间存在相关性，这与图 2所示的结果基本等同.

图 2

Fig. 2

(a)内毒素与细菌总数(流式细胞术法); (b)内毒素与HPC; (c)内毒素与菌落总数(平板法); (d)内毒素与总大肠菌群 图 2 自备井水源的内毒素与细菌学指标的相关性 Fig. 2 Correlations between endotoxins and bacteriological parameters in self-contained wells

自备井水源的浊度为0.2~17.8 NTU[图 3(a)]，颗粒物总数为 6 400~180 000 个 ·mL^-1[图 3(b)]. 总内毒素与浊度的相关系数 (r=0.49)略高于与颗粒物总数的相关系数 (r=0.41). 在内毒素的两种分布形态中，结合态内毒素对水中颗粒物和浊度的检测有一定的贡献，而游离态内毒素呈溶解性，与颗粒物和浊度的相关性较小. 图 3表明结合态内毒素与浊度的相关系数 (r=0.62)，与颗粒物总数的相关系数 (r=0.58)，这都要高于总内毒素与浊度(r=0.49)和颗粒物总数(r=0.41)的相关系数. 总内毒素、 结合态内毒素与颗粒物总数、 浊度的相关性(图 3)明显低于与细菌总数(流式细胞术法)和HPC的相关性(图 2)，原因是颗粒物和浊度中含有很多无机成分，与细菌和内毒素活性无关. 此外，从图 3(c)和图 3(d)可知，内毒素活性与小粒径颗粒物数(d<2 μm)和大粒径颗粒物数(d>2 μm)的相关性差异不大，这表明结合态内毒素在实际水体的存在状态复杂，有的小粒径颗粒物具有内毒素活性，如小粒径的内毒素聚集体、 附在小粒径颗粒物表面的内毒素分子、 和菌体残体相连的内毒素. 此外，大粒径颗粒物也具有内毒素活性，主要原因是一些大粒径颗粒物的表面积大，也容易被疏水性的内毒素分子附着.

图 3

Fig. 3

(a) 内毒素与浊度; (b) 内毒素与颗粒物总数; (c)内毒素与小粒径颗粒物数(d<2 μm); (d) 内毒素与大粒径颗粒物数(d>2 μm) 图 3 自备井水源内毒素与颗粒物、 浊度的关联性 Fig. 3 Correlations of endotoxins， suspended particles and turbidity self-contained wells

图 4表明自备井水源DOC值为0.4~1.9 mg ·L^-1,UV₂₅₄ 值为0.005~0.026 cm^-1. 总内毒素与DOC的相关系数(r=0.77)要高于与UV₂₅₄的相关系数(r=0.57). 在内毒素的两种存在形态中，游离态内毒素对水中DOC有一定的贡献，结合态内毒素与DOC的相关性差. 如图 4所示，自备井水源的游离态内毒素和DOC相关系数 (r=0.58) 和UV₂₅₄相关系数 (r=0.26)，结果表明游离态内毒素与水中DOC的相关性较大，与UV₂₅₄相关性很小.

图 4

Fig. 4

图 4 自备井水源内毒素与DOC、 UV254的相关性 Fig. 4 Correlations of endotoxins, DOC and UV254 in self-contained wells

自备井是驻扎城市郊区和边远地区基层部队的主要水源. 由于部队驻地偏远分散，自备井水质差别明显，管理难度大，其中微生物和内毒素污染更容易直接影响官兵健康. 本研究对驻京部队14个自备井水源内毒素污染水平开展调查，并同时检测了细菌学指标、 颗粒物特征、 浊度、 DOC和UV₂₅₄，旨在为自备井水源的水处理工艺选择提供科学依据. 结果表明，驻京部队14个自备井水源的总内毒素活性为0.15~13.20 EU ·mL^-1，其中游离态内毒素活性为0.10~5.29 EU ·mL^-1，结合态内毒素活性为0.01~8.60 EU ·mL^-1. 对于内毒素污染较严重的自备井水源来说，结合态内毒素所占比例明显高于游离态内毒素. 自备井水源的总内毒素、 结合态内毒素与细菌总数(流式细胞术法)、 HPC的相关性比较高. 溶解性的游离态内毒素和水中有机物具有关联，其与DOC、 UV₂₅₄的相关系数分别为 r=0.58 和0.26，表明游离态内毒素和DOC有一定的相关性，和UV₂₅₄相关性很小.