氮素排入水体会引起富营养化. 其中，硝酸盐在缺氧条件下会被转化为具有“三致”作用的亚硝盐，威胁人类健康. 氮素污染已成为公众关注的焦点^[1].

现有的脱氮处理技术中，生物脱氮工艺最为经济有效. 研究者对生物脱氮技术进行了广泛的研究，厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)被认为是最具前景的新型脱氮技术. 厌氧氨氧化是以氨氮为电子供体，以亚硝酸盐为电子受体，反应生成氮气的生物反应过程^[2]. 二十多年的研究证明了亚硝酸盐为厌氧氨氧化的直接电子受体，明确了该反应的计量关系^[3]，并且认为厌氧氨氧化微生物无法直接利用硝酸盐与氨氮反应^[4].

硝酸盐与氨氮同步反应的发生必须通过外在的电子供体将硝酸盐还原为亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐再与氨氮发生厌氧氨氧化反应，使得硝酸盐与氨氮同步去除^[5]. 目前，氨氮和硝酸盐同步去除方法主要为通过有机物将硝酸盐异养还原为亚硝酸盐，再进行厌氧氨氧化反应^[6]. 然而，该方法还存在污泥产量大、有机物抑制厌氧氨氧化反应等不足^[7].

零价铁(ZVI)具有无毒害，易沉降、较强还原力等优点，在水体修复中已经得到广泛的应用^{[8, 9]}. 在化学反应中，硝酸盐可以在零价铁的还原作用下自发地反应生成氨^{[10, 11]}. 零价铁也能在生物作用下将硝酸盐还原. 有研究表明^{[12, 13]}，硝酸盐可以在单质铁作用下发生氢自养反硝化反应，将硝酸盐还原为氮气. Zhang等^[14]在厌氧氨氧化反应器添加零价铁得到了反应器内部分硝酸盐的减少，但未能阐述其反应机制. 零价铁的特性体现了其作为清洁的硝酸盐还原电子供体的潜质，也在某些脱氮环节中起到重要的作用.

多数研究报道零价铁还原硝酸盐的中间产物为亚硝酸盐^{[15, 16, 17]}，当反应体系内还同时存在厌氧氨氧化菌和氨时，若厌氧氨氧化反应对亚硝酸盐更具亲和力，则硝酸盐的还原步骤停留在亚硝酸盐，中间产物亚硝酸盐直接与氨发生厌氧氨氧化反应，进而出现硝酸盐与氨氮同步转化.

硝酸盐与氨在零价铁同时存在的条件下，通过厌氧氨氧化微生物进行同步转化现象鲜见报道. 然而，对这种现象的进一步研究可丰富人们对自然界氮循环和铁循环的认识，拓展对厌氧氨氧化微生物存在环境范围的认知，并且利用其原理可在某些工程应用中强化脱氮环节.

基于此，本研究在一个反应器内，通过添加零价铁实现厌氧氨氧化微生物对氨氮与硝酸盐的同步转化，并研究其内在反应机制.

采用有效体积为1000 mL血清瓶作为反应器，该反应器设置有一个取样口及一个氮气平衡口. 反应器内溶液用氮气吹脱20 min，并加入铁屑，迅速密封，放置于恒温培养箱中，于振荡转速120r·min^-1，恒温35℃±0.5℃条件下反应. 每个实验组设置3个平行实验.

氨与硝酸盐的化学转化. 考察未添加污泥的情况下，反应液相硝酸盐与氨氮在零价铁的作用下的转化情况. 添加100 mg·L^-1氨氮、100 mg·L^-1硝态氮、零价铁30 g、基本培养液. 反应10 h，取样测定.

添加ANAMMOX污泥后氨与硝酸盐的转化. 通过控制零价铁的投加，考察零价铁在生物作用下，氨氮与硝酸盐同步转化情况. 设置空白试实验和生物实验组零价铁(ZVI)投加量分别为0 g、30 g，其他条件保持一致(添加100 mg·L^-1氨氮、100 mg·L^-1硝态氮、ANAMMOX污泥30 g、基本培养液)，反应10 h，取样测定.

采用全混式厌氧搅拌罐，其有效体积为0.7 L，截面尺寸为60 mm×60 mm，有效高度为200 mm，设置三相分离器. 由蠕动泵从底部进水，出水经三相分离器进行水、气、固分离，最后经出水堰排水. 反应器出水处、搅拌器接口处均设置水封装置，并且进水采用氮气吹脱除氧，以确保反应器处于厌氧状态. 反应器温度控制为35℃±0.5℃. 为避免光照对厌氧氨氧化菌的伤害，反应器外部用黑色遮光布覆盖避光. 反应接种30 g厌氧氨氧化颗粒污泥，并添加30 g铁屑. 实验装置如图 1所示.

图 1

Fig. 1

1. 进水泵; 2. 反应区; 3. 三相分离区; 4. 沉淀区; 5. 出水泵; 6. 洗气瓶; 7. 搅拌电机; 8. 温度控制器 图 1 连续流装置示意 Fig. 1 Scheme of experimental reactor of the continuous flow

通过改变不同水力停留时间(HRT为24、12、10及6 h)、不同进水NH₄⁺-N/NO₃^--N比例(比例为1∶1、2∶1及1∶2)，考察氨氮和硝酸盐同步去除的持续性，反应产物组成变化及反应NH₄⁺-N/NO₃^--N的比例关系.

实验用铁屑为14~18目，首先采用0.5 mol·L^-1稀盐酸酸化处理30 min，以去除可能的铁氧化物，后用脱氧一级水淘洗5次以去除悬浮细小铁颗粒. 反应器接种厌氧氨氧化污泥取自本课题组培养亚硝酸盐型厌氧氨氧化反应器，其颗粒直径1~2 mm，原反应器氮负荷达到4.5 kg·(m³·d)^-1. 批试实验所用污泥：原污泥取出后，用基本培养液培养12 h，去除污泥内部未反应的原基质，未经驯化直接使用. 基本培养液成分为(mg·L^-1)： KH₂PO₄ 5、CaCl₂·2H₂O 136、MgCl₂·7H₂O 200、NaHCO₃=KHCO₃=400，微量元素Ⅰ 1 mL·L^-1，微量元素Ⅱ1.25 mL·L^-1. 微量元素Ⅰ组成：EDTA 5000 mg·L^-1，硫酸亚铁5000 mg·L^-1. 微量元素Ⅱ的组成如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 微量元素Ⅱ的组成 Table 1 Composition of trace elements Ⅱ 组成成分 浓度/mg·L-1 组成成分 浓度/mg·L-1 EDTA 5000 NaMoO4·2H2O 220 ZnSO4·7H2O 430 NiCl2·6H2O 190 CoCl2·6H2O 240 NaSeO4·10H2O 210 MnCl2·4H2O 990 H3BO4 14 CuSO4·5H2O 250 NaWO4·2H2O 50

表 1 微量元素Ⅱ的组成 Table 1 Composition of trace elements Ⅱ

实验中各污染物指标的监测方法均参照文献[18]进行：NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法，NO₂^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法、NO₃^--N采用紫外分光光度法、总铁采用邻菲啰啉分光光度法、pH值采用pHS-3TC型酸度计测定.

为排除在化学作用下，零价铁促使氨与硝酸盐进行同步转化反应的可能性，反应体系中添加零价铁30 g、氨氮100mg·L^-1，硝态氮100mg·L^-1，基本培养液，其基质转化情况如2图所示. 从中可见，在零价铁作用下，反应体系内硝态氮转化5.58 mg·L^-1±0.06mg·L^-1，平均转化速率为0.56 mg·(L·h)^-1，氨氮生成5.16mg·L^-1±0.25mg·L^-1，硝态氮转化量与氨氮生成量基本保持一致. 没有微生物参与的条件下，硝酸盐在零价铁作用下还原成氨，并且硝酸盐不能与氨同步转化. 有研究表明零价铁作用下硝酸盐还原主要产物为氨^{[15, 16, 17]}，并且中性条件下反应速率较慢. 本实验结果与其一致.

图 2

Fig. 2

温度33℃±0.5℃，振荡转速120r ·min-1，初始pH=7.5, 零价铁30 g，反应10 h 图 2 硝酸盐和氨氮在零价铁作用下的化学反应底物浓度变化 Fig. 2 Variations of substrates of chemical reaction between nitrate, ammonium and iron

化学作用下硝酸盐与氨不能发生同步转化. 研究生物条件下，氨与硝酸盐的转化情况及零价铁作用. 实验以零价铁为控制变量(0 g和30 g)，添加硝态氮100 mg·L^-1，氨氮100 mg·L^-1，污泥30 g，基本培养液，其实验结果如图 3所示. 反应10 h，未添加零价铁的生物反应体系内，氨氮、亚硝氮、硝态氮及总氮变化均较小(＜0.1 mg·L^-1)，氨不能与硝酸盐发生同步转化反应. 由此排除了短时间内生物反应中污泥内碳源引起的硝酸盐转化的可能性.

图 3

Fig. 3

温度33℃±0.5℃，振荡转速120r ·min-1，初始pH=7.5，反应10 h 图 3 控制添加零价铁生物反应底物浓度变化 Fig. 3 Variations of substrates of biochemical reaction between without iron added and with iron added

当添加零价铁后，相同反应时间条件下，硝态氮降低45.89 mg·L^-1±2.46 mg·L^-1(化学还原为5.16 mg·L^-1±0.25 mg·L^-1)，同时氨氮降低38.25 mg·L^-1±2.15 mg·L^-1，该过程中伴随大量液相总氮损失(86.70 mg·L^-1±3.46 mg·L^-1). 硝态氮与氨氮的转化速率分别为4.59 mg·(L·h)^-1和3.83 mg·(L·h)^-1，其摩尔损失比为0.9. 相比化学还原硝酸盐反应，添加厌氧氨氧化微生物的反应中硝酸盐与氨出现同步转化，硝酸盐的转化速率提高8.2倍. 反应过程中液相出现了与硝酸盐和氨转化等量的氮损失，极有可能转化成了氮气.

为进一步考察硝酸盐与氨氮同步转化反应的可持续性，反应中零价铁作用及同步反应的转化途径，启动连续流反应器对该反应过程进行研究. 通过在厌氧反应装置中接种课题组前期已研究培养出的亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥，用只含氨氮及硝酸盐的无机营养液培养，研究氨与硝酸盐同步转化特性. 其中0~5 d水力停留时间为24 h，6~16 d停留时间为10 h，17~40 d停留时间为6 h. 连续流运行中还改变了氨与硝酸盐的进水比例： 0~16 d氨氮∶硝态氮为100 mg·L^-1∶100 mg·L^-1(摩尔比1∶1)； 17~27 d氨氮∶硝态氮为50 mg·L^-1∶100 mg·L^-1(摩尔比1∶2)；28~40 d氨氮∶硝态氮为100 mg·L^-1∶50 mg·L^-1(摩尔比2∶1).

由图 4可见，反应接种污泥运行后，随即出现了明显的氨与硝酸盐的转化，氨氮转化速率为2~12 mg·(L·h)^-1，硝态氮转化速率达到1~8 mg·(L·h)^-1，液相总氮损失速率达3.4~17.2 mg·(L·h)^-1. 可以明显看出，由于运行条件的改变，导致氨及硝酸盐转化速率变化，但两者的变化保持一致，说明反应中氨氮与硝酸盐是持续同步转化的. 反应过程中出水亚硝酸盐浓度为0~3 mg·L^-1，其始终保持较低水平. 水中硝态氮与氨氮损失量与液相总氮损失量相当，并可见大量气泡产生，其极有可能转化为氮气. 反应过程中pH由进水7.0~8.0上升至7.9~8.5，该结果显示，反应为消耗氢离子的过程.

图 4

Fig. 4

接种ANAMMOX污泥30 g，一次性添加铁屑30 g，温度35℃±0.5℃，搅拌转速150r ·min-1 图 4 连续流反应器进出水水质变化 Fig. 4 Variations of substrates in influent and effluent of the continuous flow reactor

反应出水如图 5所示，

图 5

Fig. 5

图 5 运行5 d后反应器絮状沉淀物及出水絮状沉淀物 Fig. 5 Floccus in the reaction and in the effluent on the 5th d

可见松散絮体，混合均匀后取适量，测定其中总铁含量150 mg·L^-1，溶解性亚铁1.51 mg·L^-1，溶解性三价铁0.98 mg·L^-1，溶解性铁占水中总铁1.67%. 零价铁参与反应生成铁离子，因反应体系始终保持微碱性环境(pH 8.0~9.0)，铁离子形成絮状体，故无法确定零价铁氧化后的离子价态和数量. Fe/Fe²⁺和Fe²⁺/Fe³⁺的氧化还原电位分别为0.475 V和-0.771 V(25℃)，前者电动势高，更易发生反应. 反应前后，铁形态从零价变为正二价或正三价. 反应中，零价铁作为电子受体参与了硝酸盐同步反应过程.

连续运行过程中氨氮、硝态氮转化情况如图 6所示，0~5 d[HRT为24 h，n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)为1∶1]氨与硝酸盐的转化速率均较慢，氨与硝酸盐转化比为2.5~3.5; 6~16 d [HRT为10 h，n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)为1∶1]，氨与硝酸盐的转化速率明显提高，其氨与硝酸盐转化比降低至1.5左右(1.2~1.7); 17~27 d[HRT为6 h，n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)为1∶2]，氨和硝酸盐转化速率降低，氨氮与硝态氮转化比升高(2.0~3.0); 28~40 d[HRT为6 h，n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)为2∶1]，氨与硝酸盐的转化速率升高，两者的转化比并没有显著的变化(1.8~3.0). 结果显示，适当提高水力停留时间或改变进水n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)可加速反应，但对氨与硝酸盐转化速率的促进程度不同，这导致两者的反应摩尔比变化.

图 6

Fig. 6

图 6 反应时间及进水n(NH4+)∶n(NO3-)对氨氮与硝态氮同步转化反应的影响 Fig. 6 Effects of reaction time and molar ratio(NH4+∶NO3-) on the simultaneous reaction between ammonium and nitrate

氨氮与硝态氮同步转化比例如图 7所示，HRT和进水n(NH₄⁺)∶n(NO₃^-)都对两者摩尔转化比有较大影响，氨与硝酸盐同步反应中氨氮消耗与硝态氮消耗比例随外界条件而变化，反应体系内部存在复杂的多步反应.

图 7

Fig. 7

图 7 不同反应时间及进水n(NH4+)∶n(NO3-)条件下氨氮与硝酸盐同步转化比例统计 Fig. 7 Molar ratio of transformed ammonium and nitrate under the different reaction time and influent ammonium and nitrate

批试实验中氨氮与硝态氮的摩尔损失比达0.9，而连续流反应也出现持续的比例为1.2~3.5氨氮和硝态氮摩尔损失比，其结果都表明了厌氧氨氧化菌可利用零价铁同步转化硝酸盐与氨. 氨与硝酸盐同步转化的量与液相总氮损失量相当，说明其极有可能转化为了氮气. 添加厌氧氨氧化微生物后硝酸盐的还原加快8.2倍，显示厌氧氨氧化微生物还具有强化硝酸盐转化的能力. 反应出水中总铁含量高达150 mg·L^-1，其来自于零价铁的氧化，可认为零价铁作为电子供体参与反应. 反应前后pH由7.0~8.0上升至7.9~8.5的结果也表明氢离子参与该反应过程. 另外，连续运行中出水亚硝酸积累量较小(＜3.0 mg·L^-1)，并且溶解性总铁含量较低(2.5 mg·L^-1，占水中总铁1.67%).

反应体系内，大量零价铁被氧化为铁离子，因该反应始终于中性和厌氧条件下进行，故排除零价铁的析氢腐蚀和氧气氧化的可能^[18]，零价铁作为供体将电子传递给硝酸盐(如图 8).

图 8

Fig. 8

图 8 硝酸盐与氨氮同步反应体系内硝酸盐转化途径分析 Fig. 8 Nitrate transforming pathway in the simultaneous nitrate and ammonium transform reaction

反应体系内部始终保持厌氧环境，以整个反应体系为对象，核算液相氨转化所需的充足的电子受体仅有硝酸盐和液相残留溶解氧. 以进水溶解氧8 mg·L^-1计，则其可导致氨氮损失10.25 mg·L^-1，其占总氨损失的25.6%，体系内氨氮的转化主要由硝酸盐引起. 报道证明氨氮无法与硝酸盐直接发生反应^[3]，而是硝酸盐转化为亚硝酸盐后方能与氨发生厌氧氨氧化反应.

零价铁还原硝酸盐反应中，硝酸盐先后被还原为亚硝酸盐和氨，该过程的第一步反应是速度限制步骤. 由于反应中，氨与硝酸盐的摩尔损失比始终大于0.9(批试实验为0.9，连续流中始终大于1.2)，与传统厌氧氨氧化中氨氮与亚硝氮的比^[19]相当，说明大部分的硝酸盐在还原至亚硝酸盐时，被厌氧氨氧化菌所利用. 这与零价铁与硝酸盐反应为固-液反应，反应集中在相界面上^[20]，亚硝酸盐进一步反应过程应该以还原成氨为主导的理论是不一致的. 另外，在本实验中，一定的硝酸盐浓度范围内，零价铁还原硝酸盐化学反应为一级反应^[21]，厌氧氨氧化微生物添加前后，其液相硝酸盐产物(中间)亚硝酸盐(两种情况都保持低浓度)和氨浓度(两种情况保持同一数量级，初始氨氮0、50、100 mg·L^-1浓度下，零价铁还原硝酸盐未有显著差异，未列出)未显著改变. 按照单纯的化学反应动力学无法解释添加厌氧氨氧化污泥后硝酸盐转化速率提高8.2倍(图 2、图 3)的现象. 目前研究表明，厌氧氨氧化微生物可以利用丙酸盐、二价铁还原硝酸盐^[22]，并且宏基因组测序表明厌氧氨氧化微生物体内存在编码硝酸盐还原酶NarGH的基因^[23]，某些情况下微生物体内该酶表达活跃^[24]. 实验中，厌氧氨氧化微生物也极有可能直接参与了硝酸盐还原为亚硝酸盐过程，从而加速了硝酸盐的还原，并使得其在亚硝酸盐竞争中取得优势，与体系中存在的氨发生厌氧氨氧化反应. 以上结果表明，硝酸盐与氨氮同步转化途径如图 9所示.

图 9

Fig. 9

图 9 硝酸盐与氨氮同步反应体系中氮素转化途径分析 Fig. 9 Nitrogen transforming pathway in simultaneous nitrate and ammonium transform reaction

(1)无机营养条件下，当存在零价铁时，厌氧氨氧化菌可实现硝酸盐和氨氮同步转化，转化速率最高达17.2 mg·(L·h)^-1，反应出水存在极少可溶性总铁(2.5 mg·L^-1，占水中总铁1.67%)和亚硝酸盐(＜3.0 mg·L^-1).

(2)中性条件下，零价铁化学还原硝酸盐速率为0.56 mg·(L·h)^-1，添加厌氧氨氧化污泥后硝酸盐还原加速至4.59 mg·(L·h)^-1，厌氧氨氧化污泥可强化零价铁的腐蚀和硝酸盐的还原.

(3)硝酸盐与氨反应的摩尔损失比随着水力停留时间及进水NH₄⁺-N∶NO₃^--N变化而变化，表明氨和硝酸盐转化并非简单接续反应，反应器中发生了更为复杂的反应造成不稳定的NH₄⁺-N∶NO₃^--N损失比.