有机磷在水生及陆地生态系统中的相对丰度较高，具有潜在释放风险并能转变为生物可利用形式，是水生植物可利用磷的潜在重要来源^[1]. 对于浮游植物和浮游细菌，可溶性有机磷更易被其吸收利用^[2]. 例如，在东京湾沉积物的研究中，典型的有氧海洋条件下，几天之内肌醇六磷酸(植酸)可完全水解为磷酸盐^[3]. 同样地，在湖泊生态系统中，有机磷也可在数小时之内以生物可利用的形式从沉积物中释放到上覆水体中^[4]. 在北太平洋的透光层中发现溶解性有机磷是生物可利用磷的主要组成部分^[5]. Berelson等^[6]在Port Phillip 湾的营养盐循环研究中发现磷的内源再生量占湖泊溶解性磷酸盐的比例高达72%，比内源性氮营养盐的产生量占外源性营养盐的比例超出22%.

水-沉积物界面是溶解物质在生物体系与地球化学循环之间进行耦合作用的最初场所，也是水生生态系统物质循环不可缺少的环节^[7]. 目前，有关冰封期水-沉积物界面磷再生循环机制方面的研究尚鲜见. 实际上，冰封期内厌氧条件下，厌氧微生物的活性较强，沉积物中有机质的厌氧降解能直接导致沉积物中有机磷向水体释放，同时不溶性的Fe(OH)₃变成可溶性的Fe(OH)₂，使与铁结合的磷大量释放进入水体，为春季初级生产力的提高提供了物源基础^{[8, 9, 10, 11]}. 本文针对内蒙古高原湖泊冰封期长的特点(150 d)，以乌梁素海(WLSH)为研究对象，实验模拟了冰封期沉积物中有机磷的释放特征，初步探讨了底物添加与灭菌处理条件下，微生物活性与沉积物中有机磷释放间的关系，对探讨冰封期湖泊沉积物中有机磷释放的生物学机制，控制不同季节湖泊內源负荷和改善水环境质量，以及揭示有机磷的形态转化机制和重新认识有机磷在富营养化中的作用与贡献等均有重要意义.

乌梁素海(40°47′~41°03′N，108°43′~108°57′E)系黄河改道后形成的牛轭湖，是内蒙古高原西部干旱区最典型的浅水草型湖泊，也是全球范围内荒漠半荒漠地区极为少见的具有生物多样性和环境保护等多功能的大型草型湖泊，现有水域面积约330 km²，平均水深为0.8~1.0 m. 湖区位于内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗境内，属大陆性干旱、 半干旱气候，月平均气温低于0℃，每年冰封期超过150 d^[12]. 随着经济的发展和人类活动的愈加频繁，尤其是河套灌区农田退水的影响，近10年来乌梁素海富营养化进程加剧，面临严重的生态环境问题. 湖中现有大型水生植物共6科6属11种，以芦苇、 龙须眼子菜和穗花狐尾藻为优势种，生长繁茂，遍布全湖^[13]. 乌梁素海已成为以大型水生植物过量生长为表征的重度富营养化草型湖泊，为世界上沼泽化进程最快的湖泊之一^[13].

2013年8月于乌梁素海南部、 中部和北部沉水植物区系统采集表层沉积物样(KC mod B型无扰动采样器，Swedaq)，样品于封口聚乙烯塑料袋中冷藏保存，实验室中-24℃冷冻保存; 同步采集并现场过滤上覆水样; 同时现场监测pH、 温度、 溶解氧(DO)等水质指标. 采样站位使用GPS定位.

本实验中，通过添加底物(T_M)和灭菌(T_N)两种处理方式来促进或抑制微生物活性，考察冰封期微生物对沉积物中有机磷释放及形态转化的影响机制.

释放实验采用WLSH过滤水作为上覆水. 将从乌梁素海南部、 中部和北部采集的表层沉积物除去植物和砾石等残渣，充分搅拌混匀，称取50.00 g±0.10 g(湿重)沉积物置于500 mL培养瓶底部平铺，缓慢加入400 mL上覆水进行培养，并记录液面位置. T_M处理添加葡萄糖作为微生物营养源，促进微生物生长繁殖; T_N处理添加福尔马林进行灭菌. 分别于第10、 20、 40、 60、 90、 120、 150、 180 d每个时间点取出各培养瓶进行水样及沉积物的分析测试. 采集样品时，同步测定pH、 氧化还原电位(ORP)、 温度、 DO和电导率等指标. 实验体系于N₂氛、 温度4℃的人工气候箱(模拟光照)中进行，模拟冰封期乌梁素海的水环境条件.

水样采集后，通过钼锑抗分光光度法^[14]测定可溶性总磷酸盐(DTP)和可溶性正磷酸盐(DIP)，可溶性有机磷(DOP)含量由差值法获得，DOP=DTP-DIP. 沉积物采集后，充分混匀，通过邻菲啰啉分光光度法^[15]测定活性铁含量. 按美国农业部的连续提取方法^[16]测定形态磷的含量，该方法将沉积物中的有机磷分为活性有机磷(LOP)、 中等活性有机磷(MLOP)、 非活性有机磷(NLOP)共3种，其中NaHCO₃-OP为活性有机磷(由pH为8.5的0.5 mol ·L^-1的NaHCO₃提取)，属吸附于沉积物的松散磷; 中活性有机磷(MLOP)包括HCl-OP(HCl提取态有机磷，1.0 mol ·L^-1的HCl提取)及Fulvic Acid-OP(富里酸结合态有机磷，0.5 mol ·L^-1的NaOH提取); 非活性有机磷(NLOP)则包括Humic Acid-OP(胡敏酸结合态有机磷，0.5 mol ·L^-1的NaOH提取)和Residual-OP(残渣态有机磷，沉积物灼烧后由1.0 mol ·L^-1的H₂SO₄提取).

DOP、 DIP、 DTP的释放速率按下式计算：

微生物在一定程度上影响着磷的释放和再生循环等界面行为与过程，特别是在有机质含量较高的湖泊中^{[17, 18]}. 沉积物中有相当数量的微生物具有将难溶解性磷化合物转化为可溶性磷的能力^[19]，提高磷的生物可利用性，进而影响上覆水中磷的浓度. 实验结果表明(图 1)，180 d冰封期内，T_N上覆水中DTP、 DIP及DOP的浓度均高于T_M的浓度. 厌氧条件下，微生物对沉积物中二价铁(Fe²⁺)的含量影响显著. 冰封期内，T_M沉积物中Fe²⁺的含量约为T_N的3倍(图 2)，表明实验体系中铁异化还原微生物的存在，同时揭示体系中厌氧微生物的同化利用对上覆水中磷浓度的影响作用.

图 1

Fig. 1

图 1 微生物对上覆水中磷的释放影响 Fig. 1 Effect of microorganisms on phosphorus release in overlying water

图 2

Fig. 2

图 2 微生物对沉积物中Fe2+释放影响 Fig. 2 Effect of microorganisms on Fe2+ release in sediments

T_M结果表明(图 2)，随着Fe²⁺含量的增加，上覆水中DTP的浓度逐渐降低; 而T_N结果相反，随着Fe²⁺含量的增加，上覆水中DTP的浓度逐渐增加. 在T_M释放实验中，铁的释放量受微生物同化、 异化作用的影响. 假单胞细菌为乌梁素海水体细菌优势类群^{[20, 21, 22]}，在沉积物中也发现有脱铁杆菌和芽单胞菌等铁还原细菌^[22]. 因Fe²⁺可作为电子供体，氧化亚铁硫杆菌等自养微生物可从Fe²⁺氧化为Fe³⁺的过程中获取代谢所需的能量. 冰封期，T_M的DO含量(平均值为3.0 mg ·L^-1)较低，微生物利用铁进行代谢，分解含铁有机化合物，最终以Fe³⁺或Fe²⁺形式释放出来. 冰封期为厌氧环境，Fe³⁺易于被还原为Fe²⁺，故T_M的Fe²⁺含量高于T_N的含量. 此外，乌梁素海为弱碱性湖泊，pH值范围在8.0~8.5之间. 沉积物中Fe²⁺向上覆水中迁移转化时，会被氧化为Fe³⁺，针铁矿及其他铁(Ⅲ)氧化物在中性pH环境中是带正电的，并具有较强吸附磷酸酯的功能^{[23, 24]}，从而Fe³⁺易结合上覆水中无机磷，形成Fe-P，沉淀进入沉积物中，而氧化铁的表面可促进有机磷酸酯的水解，从而导致上覆水中DIP及DOP含量的降低，进而DTP的含量也降低.因此，冰封期微生物驱动下铁的异化还原作用是影响水-沉积物界面有机磷释放的重要机制.

对于理想的水-沉积物界面，界面物质交换速率应保持不变，但在实际中，往往首先寻找释放速率相对稳定的时段为有效时段，然后再取在该有效时段下平均释放速率为释放强度数值.对乌梁素海沉积物进行了180 d的释放实验，由释放速率变化图可知(图 3)，释放速率变化曲线在实验初期(0~60 d)均有较大变幅，但每组的释放速率均在60 d后曲线逐渐变得较为平坦，表明所有释放实验在进行60 d后，释放速率趋于稳定. 释放实验结果表明水-沉积物界面DTP、 DIP、 DOP的释放速率均为正值，冰封期内DTP、 DIP、 DOP转移扩散的矢量方向指向上覆水，即乌梁素海沉积物向上覆水中释放的DTP、 DIP、 DOP，沉积物表现为DTP、 DIP、 DOP的“源”.

图 3

Fig. 3

图 3 乌梁素海模拟实验中释放速率变化 Fig. 3 DTP，DIP，DOP release rates from WLSH sediments

对本研究中的释放速率与释放时间进行拟合(图 3)，拟合结果显示，上覆水中DTP、 DOP及DIP均符合对数函数的释放规律(P < 0.01)，表明0~40 d内沉积物释磷过程为快速反应，随后该过程渐趋缓慢，与已有研究结果相符合^{[25, 26, 27]}. 结合乌梁素海上覆水中有机磷分布、 沉积物中磷形态的研究成果及乌梁素海为草型湖泊的生态特征^{[7, 28]}，本研究所得出的乌梁素海沉积物在整个冰封期内均表现为上覆水中DTP、 DIP、 DOP源的结论，再次揭示了有机磷作为生物有效磷源的重要性，也表明有机磷在水-沉积物界面的环境地球化学行为对湖泊富营养化的重要影响.

实验结果表明(图 4)，沉积物中有机磷的主导形态为HCl-OP和Re-OP，各形态有机磷含量分布趋势为MLOP＞NLOP＞LOP. 随着时间的推移，无论在何种条件下，LOP的含量均为减少的. 沉积物中，LOP最易矿化易为动植物所吸收利用，活性最高，所以释放初期，含量明显降低. T_M的LOP含量较T_N的偏低，而上覆水中DIP、 DOP浓度也低于T_N，由于沉积物中含有大量微生物，厌氧条件下通过酶解作用将LOP转化为可吸收利用的无机磷，供自身所需; 乌梁素海是弱碱性湖泊，钙的含量较高(平均值为93.31 mg ·L^-1)^[29]，部分被磷酸酶水解的溶解性有机磷转化为无机磷，而且很快与CaCO₃结合形成Ca-P，或者与金属、 胡敏酸复合物结合^[30]. T_M的MLOP含量先减少后增加，而NLOP的含量恰恰与MLOP相反，随着时间的推移呈现先增加后减少的趋势; T_N的MLOP含量波动性增加，而NLOP的含量波动性减少. 0~60 d，随着LOP的减少，一部分MLOP转化为LOP释放到上覆水中，同时还有一部分MLOP转化为NLOP，导致NLOP的含量增加，60~180 d，NLOP又会转化为MLOP.

图 4

Fig. 4

图 4 微生物对有机磷的释放影响 Fig. 4 Effect of microorganisms on OP release

释放周期内(图 5)，T_M的LOP、 TLP含量先增加后降低，而T_N的LOP、 TLP含量逐渐降低，0~90 d，T_N的LOP、 TLP含量高于T_M，而90~180 d，T_M的LOP、 TLP含量高于T_N. 释放初期，因微生物可直接利用沉积物中的活性磷，用于自身的生长繁殖，从而导致T_N的含量高于T_M的含量. 分解无机磷的微生物主要包括假单胞菌属(如草生假单胞菌等)、 无色杆菌属、 黄杆菌属、 氧化硫硫杆菌等^[31]. 解无机磷细菌对无机磷酸盐的溶解作用主要包括微生物通过呼吸作用放出CO₂，周围的pH降低，引起磷酸盐的溶解^[32]; 同时微生物在代谢过程中分泌有机酸，通过质子酸化、 络合溶解等作用促进磷的释放^[33]. 某些微生物能释放H₂S，可与FePO₄作用，产生Fe₃(PO₄)₂和正磷酸盐离子; 解磷细菌能吸收Ca²⁺，使PO^3-₄游离出来; 解磷细菌通过NH⁺₄的同化作用放出质子，降低pH，从而引起磷酸盐的溶解^[34].

图 5

Fig. 5

图 5 微生物对沉积物中各形态有机磷的释放影响 Fig. 5 Effect of microorganisms on the release of different fractions of OP in sediments

HCl-OP在释放周期内呈现波动性变化(图 5)，0~60 d T_M的含量高于T_N，60~180 d T_N的含量高于T_M. 释放周期内，FAOP的含量先增加后减少，0~60 d，T_N的含量高于T_M，60~180 d，T_M的含量高于T_N，但其变化幅度比HCl-OP小. MLOP=HCl-OP+FAOP，其中HCl-OP的含量占MLOP含量的75%左右，MLOP的变化趋势与HCl-OP的趋势基本一致. 释放周期内，随着时间的推移，Re-OP的含量先增加后减少. HAOP的含量在释放周期内先增加后减少，且T_M的含量高于T_N，其变化范围较T_N的大，但HAOP的变化幅度比Re-OP小. NLOP=Re-OP+HAOP，其中Re-OP的含量占NLOP含量的85%左右，NLOP的变化趋势与Re-OP的趋势基本一致. 0~60 d，T_N的NLOP含量高于T_M，60~180 d T_M的NLOP含量高于T_N. 释放初期0~60 d(图 5)，T_M的MLOP高于T_N，而NLOP的含量低于T_N. 有研究表明，解磷细菌可使沉积物中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物^{[31, 35]}，即可将NLOP转化为活性相对较高的MLOP，从而使得T_M的MLOP含量升高而NLOP的含量降低. 解有机磷细菌对有机磷的矿化作用主要是在微生物的代谢过程中产生一些胞外酶^[36]，并通过酶的作用使核酸和磷脂等典型的有机磷的P—S、 P—N和P—O键断裂，矿化出可溶性的正磷酸盐^[37]，并释放至上覆水体中，供浮游植物利用. 60~180 d，T_M的MLOP低于T_N，而NLOP的含量高于T_N，说明释放中后期沉积物中的肌醇六磷酸盐(植酸)在碱性条件下，与沉积物中的钙盐相结合，形成大量极难溶的植酸钙^[38]，揭示释放实验后期沉积物中MLOP存在向NLOP转化的可能性.

冰封期内，水-沉积物系统中，多为厌氧环境. 解磷菌在好氧的条件下，可将系统内的磷过量地存储在自身体内，而厌氧条件下，将磷释放出来. 实验结果表明(图 6)，冰封期内，T_M和T_N上覆水中DIP的浓度先增加后减小，DOP的浓度先减小后增加. 释放初期，T_M的DOP相对浓度高于T_N的浓度，但随着时间的推移，释放中后期，T_N 的DOP相对浓度要高于T_M的浓度.

图 6

Fig. 6

图 6 冰封期微生物对水-沉积物系统中磷形态转化的影响 Fig. 6 Effect of microorganisms on conversion of phosphorus fractions in water-sediments system during freezing period

在厌氧条件下，表层沉积物及沉积物表面ORP(T_M平均值为329.18 mV，T_N平均值为195.613 mV)较低，铁、 锰氧化物易被还原从而溶解度增大，其吸附固定的磷被释放出来. 释放过程中，T_M沉积物有机磷的相对含量降低，无机磷的相对含量增高，呈现有机磷向无机磷转化的趋势，沉积物有机磷约有6.1%转化为无机磷; 而T_N沉积物有机磷的相对含量升高，无机磷的相对含量降低，约有4.3%无机磷转化为有机磷，揭示了冰封期内，微生物可加速沉积物有机磷向无机磷的转化，提高了磷的生物可利用率，增加了沉积物磷向上覆水释放的风险. T_M沉积物中有机磷的含量从31.5%降低到25%左右，T_N的有机磷含量从20%左右增加到25.2%，但T_N在释放初期和中期沉积物中磷的形态变化并不明显. T_M的LOP含量先减小后增加，MLOP的含量先减小后增加，NLOP的含量逐渐减少. T_N的LOP含量逐渐减少，MLOP的含量逐渐增加，NLOP的含量逐渐减少. 沉积物中无机磷的含量占总磷的含量75%左右，T_M和T_N的NaHCO₃-IP含量逐渐增加，T_M的HCl-IP含量先增加后降低，T_N的HCl-IP含量降低. 解磷细菌可使沉积物中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物. 解有机磷细菌对有机磷的矿化作用主要是在微生物的代谢过程中产生一些胞外酶^[36]，并通过酶的作用使核酸和磷脂等典型的有机磷的P—S、 P—N和P—O键断裂，矿化出可溶性的正磷酸盐^[37]，并释放至上覆水体中. 解无机磷细菌对无机磷酸盐的溶解作用主要包括微生物通过呼吸作用放出CO₂，周围的pH降低，引起磷酸盐的溶解; 同时微生物在代谢过程中分泌有机酸，通过质子酸化、 络合溶解等作用促进磷的释放^[33]. Clostridium butyricum在厌氧状态下，能将PO^3-₄转化为HPO²₃^-和H₂PO^-₂，从而被植物吸收利用^[10]. 某些微生物能释放H₂S，其可与FePO₄作用，产生Fe₃(PO₄)₂和正磷酸盐离子，解磷细菌能吸收Ca²⁺，使PO^3-₄游离出来; 解磷细菌通过NH⁺₄的同化作用放出质子，降低pH，从而引起磷酸盐的溶解^[34].

(1)180 d冰封期内，T_N上覆水中DTP、 DIP及DOP的浓度均高于T_M的浓度，揭示体系中厌氧微生物的同化利用对上覆水中磷浓度的影响作用; 同时微生物驱动下铁的异化还原作用也是影响水-沉积物界面有机磷释放的重要机制.

(2)释放周期内，沉积物中LOP、 TLP的含量均减少; T_M的MLOP含量先减少后增加，NLOP的含量先增加后减少; T_N的MLOP含量波动性增加，NLOP的含量波动性减少. 释放初期(0~60 d)，T_M的MLOP含量高于TN，而NLOP的含量低于T_N; 释放中末期(60~180 d)，T_M的MLOP含量低于T_N，而NLOP的含量高于T_N，揭示释放中沉积物MLOP与NLOP之间存在相互转化的可能性.

(3)释放过程中，T_M沉积物有机磷的相对含量降低，无机磷的相对含量增高，呈现有机磷向无机磷转化的趋势，沉积物有机磷约有6.1%转化为无机磷，揭示了冰封期内，微生物可加速沉积物有机磷向无机磷的转化，提高了磷的生物可利用率，增加了沉积物磷向上覆水释放的风险.