水库是典型的“汞(Hg)敏感生态系统”^[1]，汞在水库生态系统中的环境化学行为成为各国相关学者研究的热点问题之一^{[2, 3, 4]}. 有研究报道，水库环境有利于汞的活化及甲基化^[5]，被淹没的土壤和植被是新建水库水体和鱼体中甲基汞(MeHg)的重要来源^{[6, 7]}. 三峡水库是我国特大型年调节水库，其特殊的调度方式使其在库周形成垂直高度为30m，面积超过400 km²的消落带^[8]. 该消落带具有周期性淹水与退水的特点，每年4~9月的出露期间会生长出大片茂密的草本植被，随后水位上涨，将消落区淹没. 在土壤进行着干湿交替的变换时，植物也呈现出生长-淹没分解-再生长的更新过程，而植被在生长过程中会因环境因子的胁迫而向周围土壤分泌大量的有机物^{[9, 10]}，使其在局部土壤中过度积累而达到较高的浓度，这些分泌物可通过降低土壤pH、提高微生物活性等机制，来增加某些元素的溶解性和移动性而形成特殊的环境条件. 根系分泌物成分复杂，其中包含大量的小分子有机酸(如柠檬酸、草酸、酒石酸等)，它们能通过络合、吸附、氧化还原等作用影响重金属的迁移转化^{[11, 12]}，这势必会影响土壤中汞的化学行为. 因此，讨论在有机酸条件下土壤汞含量及其形态的变化特征，是研究“水库汞效应”的重要环节.

国内外已经有许多实验表明，外加柠檬酸、草酸、酒石酸等对土壤中Cd、Cu、Pb等重金属均有一定的活化能力^{[13, 14, 15, 16]}，但关于有机酸对土壤中Hg化学行为影响的报道相对偏少^{[17, 18]}. 目前普遍认为，低分子量有机酸对土壤中重金属的活化效应是酸化、络合、还原以及微生物共同作用的结果，然而不同重金属之间存在差异，不同种类的有机酸对不同地区土壤的影响效果也不尽相同. 因此，关于低分子量有机酸对三峡水库消落区土壤中汞解吸及活化的研究，仍然有很多内容值得深入探索. 而柠檬酸是植物根系分泌物中典型的低分子量有机酸，为三元酸，含有的羧基功能团及活性位点较多. 为此，本研究采集了消落区土壤，通过室内模拟实验，用不同浓度柠檬酸溶液分别浸提和培养土壤后，探讨不同浓度柠檬酸和浸提时间对三峡水库消落区土壤中汞解吸及活化的影响，并分析土壤中甲基汞含量随柠檬酸浓度和培养时间的变化特征.

供试土壤于2014年7月采自三峡水库腹心地带重庆忠县石宝寨新政村(N30°25′7.5″，E108°10′5.5″)消落区裸露试验地，其基本理化性质见表 1. 将土样去除植物残体和砂粒，冻干机(LGJ-10C，北京)避光冻干后用玛瑙研钵磨碎，过60目筛，于-80℃超低温冰箱(中科美菱DW-HW328，安徽)避光保存待用. 所用的柠檬酸(成都市科龙化工试剂厂)为优级纯，将其配制成浓度梯度为0(对照组)、1、2、4、5、6、8mmol ·L^-1的溶液后，均至少通入氩气1h以上，以去除试剂中的痕量汞. 实验所需的离心管和玻璃器皿在使用前均用硝酸(25%，体积比)浸泡24 h以上，再用超纯水(18.2MΩ ·cm，Millipore integral 3，Molsheim France)清洗，离心管在烘箱中烘干后使用，玻璃器皿经马弗炉500℃灼烧1 h，在洁净无汞的环境下冷却后使用. 实验所用的管子均为聚四氟乙烯管(Brooks Rand). 实验全过程佩戴一次性手套，避免交叉污染，室内温度为25℃±2℃.

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Physicochemical properties of soils used in this research pH 有机质/g·kg -1 CEC 1)/cmol·kg -1 机械组成/% 汞含量 <0.002 mm <0.02 mm 0.02~0.25 mm >0.25 mm THg/μg·kg -1 MeHg/ng·kg -1 7.46 9.55 17.12 19.28 50.28 48.69 1.03 45.09±0.12 249.46±10.28

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Physicochemical properties of soils used in this research

在50 mL的离心管中分别加入2 g供试土样(空白处理不加土)、20 mL各个浓度的柠檬酸，每个处理各设3个重复. 在25℃恒温黑暗条件下，220 r ·min^-1振荡120 min，并于不同时间点进行取样，取样点设置为1、5、10、30、60、90、120 min. 样品取出后立即放进离心机中，在25℃、4000 r ·min^-1下离心5 min. 结束后将样品上清液分成两份，一份过0.45 μm滤膜(Millipore，美国)，用于分析溶解态汞(DHg); 剩余样品用于分析上清液中总汞即土壤可提取态汞(THg)、活性汞(RHg). 土壤样品取出后放入自封袋，经冻干机避光冻干和玛瑙研钵磨细过100目筛，用于分析剩余的土壤总汞.

称取5 g的供试土样于洁净无汞的硼硅玻璃瓶中，加入2.5 mL不同浓度的柠檬酸将土壤浸透混匀(空白处理加同样量的超纯水)，轻微覆盖一层保鲜膜后放入人工气候培养箱中(湿度60%、温度25℃、光照0 lx)培养，所有样品均做3个重复. 于不同时间点进行取样，取样点设置为1、3、5、10、20、30、45、60、90 h. 样品取出后立即用冻干机避光冻干，再用玛瑙研钵磨细过100目筛，测定其中的MeHg.

离心后上清液的THg按照美国环境保护署Method 1631^[19]方法测定; RHg测定前上清液需加SnCl₂，用金管预富集、二次金汞齐-冷原子荧光法测定; DHg测定前上清液需过0.45 μm滤膜，加0.5%BrCl氧化放置24 h，测定前30 min加入0.2%盐酸羟氨溶液去除游离卤素，采用金汞齐预富集-冷原子荧光法测定. 原供试土样以及离心后剩余底泥的总汞用DMA-80固体进样自动测汞仪(意大利麦尔斯通公司)直接测定. 原供试土样以及培养后土壤中的甲基汞含量采用硝酸和硫酸铜溶液浸提，二氯甲烷萃取并结合水相乙基化等温气相色谱——冷原子荧光法(GC-CVAFS)测定^[20].

分析过程中的质量控制采用空白实验、加标回收率及平行样控制. 方法检出限(MDL，即3倍空白的标准偏差)分别为0.2 ng ·L^-1(THg)和0.08 ng ·L^-1(MeHg)，而方法空白均低于检出限. 加标回收率为97%~110%(THg)和88%~106%(MeHg)，平行样分析的相对标准偏差为5.1%(THg)和8.6% (MeHg).

柠檬酸浸提土壤后络合汞的量(A)用公式(1)计算：

柠檬酸浸提汞反应的前半段用对数方程[式(2)]拟合; 后半段反应的级数采用尝试法分析计算^[21]，按照二级动力学方程[式(3)]进行拟合：

数据处理与图形制作分别使用软件SPSS 18.0与Origin 8.1.

从图 1(a)和1(c)中可以看出不同浓度柠檬酸处理土壤后，浸提液中RHg、THg的含量在达到最高值的振荡时间点之前与对照组(0mmol ·L^-1)相比均有所提升，且随柠檬酸浓度的增加而增大. 此外，同一浓度柠檬酸处理下，THg和RHg含量随振荡时间变化的趋势均一致. 除0、1mmol ·L^-1的处理下THg和RHg含量都随着振荡时间的增加而增加外，其余浓度条件下两者均是先增加后减少，且出现最高值的时间点随着柠檬酸浓度的升高而提前，其中2 mmol ·L^-1、6 mmol ·L^-1的条件下在60 min时达到最大值，5 mmol ·L^-1、6 mmol ·L^-1条件下的最大值出现在30 min时，而8mmol ·L^-1的柠檬酸处理下则使最大值提前在10 min时出现. 但图 1(b)显示，浸提液中DHg含量除了在第3 min时有明显上升外，之后基本保持不变，且随柠檬酸浓度变化的幅度很小. 表明DHg在浸提3 min后已大致全部溶出，其溶出量不受柠檬酸浓度的影响.

图 1

Fig. 1

图 1 不同浓度柠檬酸处理下各时间点的RHg、DHg、THg以及A值 Fig. 1 Contents of RHg,DHg,THg and A in each time point for the treatments with different citric acid concentrations

A值随柠檬酸浓度及振荡时间的变化趋势与THg相同. 对比图 1(c)和1(d)可以发现，两者图形的曲线特征基本接近，统计分析显示，在振荡过程中，A值与THg显著相关(P < 0.05)，表示柠檬酸处理土壤后络合汞的量主要体现在THg含量中. 经过计算发现(表 2)，除对照组外，A值随振荡时间的变化在上升阶段可以很好地用对数方程进行拟合，而在下降阶段基本符合二级动力学的变化规律. 这也从侧面反映了柠檬酸对土壤汞解吸及活化的反应机制与纯水是有差异的.

表 2(Table 2)

表 2 不同浓度柠檬酸条件下，土壤汞络合量的拟合结果及参数 Table 2 Fitting results and parameters of mercury complexation in soil for the treatments with different citric acid concentrations 拟合方程 柠檬酸浓度/mmol·L -1 振荡时间段/min 参数 相关系数 R 2 k b c t=kt+b 0 0~120 0.0917 12.277 0.9979 1 0~120 5.0206 13.123 0.9857 2 0~60 6.5458 17.217 0.9891 c t=kln t+b 4 0~60 8.5070 18.961 0.9793 5 0~30 11.496 19.966 0.9905 6 0~30 10.464 25.105 0.9961 8 0~10 12.413 33.334 0.9989 2 60~120 0.0001 0.9909 4 60~120 0.0002 0.9913 5 30~120 0.0002 0.9894 6 30~120 0.0003 0.9961 8 10~120 0.0003 0.9988

表 2 不同浓度柠檬酸条件下，土壤汞络合量的拟合结果及参数 Table 2 Fitting results and parameters of mercury complexation in soil for the treatments with different citric acid concentrations

用表 2中各方程的k值来反映其反应速率. 结合图 1(d)和表 2可以发现，A值在随振荡时间变化曲线的上升阶段，其汞络合速率大致随柠檬酸浓度(6mmol ·L^-1除外)的升高而增加，而下降阶段的二级动力学反应速率常数也基本上随柠檬酸浓度的增加而变大.

将不同柠檬酸浓度处理下RHg、THg、A值所出现的最大值(RHg_max、THg_max、A_max)分别对该柠檬酸浓度作图得出各自的关系曲线与相应的多元方程式(图 2)，发现RHg_max、THg_max以及A_max都与柠檬酸浓度表现出二次线性关系，呈显著相关(r²=0.97，P < 0.01; r²=0.99，P < 0.01; r²=0.98，P < 0.01)，表明增加柠檬酸浓度对络合土壤中的汞有促进作用. 从图 2中可以发现，当柠檬酸浓度达到5 mmol ·L^-1之后，三者的变化曲线均接近于水平，表明继续增加柠檬酸浓度不会使浸提液中RHg、THg含量以及汞络合量出现较大的增值.

图 2

Fig. 2

图 2 柠檬酸浓度对浸提液中汞含量的影响 Fig. 2 Effects of different citric acid concentrations on RHg，THg and mercury activation in extracts

0、1、2、4、5、6、8 mmol ·L^-1柠檬酸浓度处理下A_max分别占供试土壤总汞的1.03%、1.67%、1.99%、2.47%、2.68%、2.73%、2.73%; 设A_max出现最大值时(6 mmol ·L^-1柠檬酸)络合率为100%，则各个柠檬酸浓度下络合率分别为37.78%、61.01%、72.77%、92.29%、99.91%、100%、99.70%，表明柠檬酸浓度为5 mmol ·L^-1时对供试土壤中汞的络合率接近于100%. 将与各个柠檬酸浓度下的A_max对应的土壤表示为T0、T1、T2、T4、T5、T6、T8，发现其汞含量均明显低于原土，且逐渐降低，直至T5后则无明显变化(图 3). 表明随着浸提土壤的柠檬酸浓度的升高，振荡离心后各处理土壤总汞的释放量增加，这与相应浸提液中A_max随柠檬酸浓度的增加是一致的.

图 3

Fig. 3

图 3 底泥中总汞的含量 Fig. 3 Concentrations of total mercury in different sediments

不同浓度的柠檬酸培养土壤后，土壤中MeHg含量随培养时间的变化显示(图 4)，在前3 h内，MeHg含量基本维持稳定，第3 h后，除对照组增加缓慢外，其余柠檬酸浓度培养的土壤中MeHg含量均开始明显上升，且上升速率随着柠檬酸浓度的升高而越来越快. 另外，在同一培养时段内，土壤MeHg含量及增加量也随柠檬酸浓度的升高而增大. 表明柠檬酸对土壤中无机汞向甲基汞的转化过程有一定的促进作用，且促进作用随着柠檬酸浓度的增加而愈加显著.

图 4

Fig. 4

图 4 不同浓度柠檬酸培养下各时间点的土壤MeHg含量 Fig. 4 Contents of MeHg in each time point in soil for the treatments with different citric acid concentrations

有研究表明，厌氧微生物(如铁还原菌^[22]和硫酸盐还原菌^[23])所引起的甲基化作用是土壤中MeHg产生的主要因素. 本实验中1~3 h内MeHg含量较低，可能是因为此时土壤中厌氧菌数量较少，甲基化作用很弱. 随后土壤中MeHg含量上升，说明将土壤浸透可能形成了一定的厌氧环境，使厌氧菌数量随着培养时间的延长而增加，从而甲基化作用增强. 但有学者报道^{[24, 25]}，在有氧情况下也存在甲基化现象，Xiang等^[26]在研究三峡水库消落区土壤中TCB(total culturable bacteria)与甲基汞的关系时也曾推测某些好氧菌在汞的甲基化中可能具有重要作用. 而浸透土壤中存在一定的溶解氧，这或许也是本研究中土壤MeHg含量有所上升的原因之一. 至于微生物在厌氧或好氧条件下对汞的具体甲基化作用机制还有待进一步研究.

本实验中MeHg含量随培养时间的增加而一直上升，没有出现平缓或下降的现象，有可能是因为培养时间不够长，没有形成足够的厌氧环境亦或溶解氧没有完全消耗殆尽，土壤中的有机质也未完全分解，汞的甲基化与去甲基化还没有达到新的平衡状态.

有研究指出^{[27, 28]}，土壤中的低分子量有机酸会给周围环境带来大量的质子以及有机酸根阴离子，其中质子能够通过酸化土壤而使其中的原生矿物溶解，导致大量的重金属被释放出来. 而有机酸根阴离子能对重金属产生足够强的亲和力，能和其它阴离子以及土壤胶体矿物表面的阳离子吸附位点竞争重金属离子，从而生成有机酸重金属的复合体，使得重金属离子在土壤固-液相间的吸附平衡向液相偏移，导致溶液中重金属离子的数量增多.

由于有机酸(如柠檬酸、酒石酸、琥珀酸等)包含的羧基、羟基等官能团能络合重金属，故常作为络合剂活化土壤重金属，用于污染土壤的修复^{[29, 30]}. 许多报道^{[16, 31, 32]}显示柠檬酸解吸及活化土壤中Cu、Pb的效果较好，主要是因为柠檬酸是三元酸，含有的羧基功能团及活性位点较多. 而柠檬酸与Hg络合的稳定性也较高，柠檬酸-Hg络合物的稳定系数为10^10.9[33]，因此本研究中用柠檬酸溶液浸提的土壤与对照相比，汞的络合量A值明显上升. 但随着培养时间的增加，A值逐渐降低，可能是由于已经形成的柠檬酸-Hg螯合物在振荡时又被吸附或包裹在土壤颗粒中，并在离心时进入底泥，最终导致后期浸提液中汞含量逐渐下降.

重金属在土壤中以多种形态存在，不同赋存形态的重金属与土壤胶体结合强度不一，因此解吸及活化所需的化学能也有差异. 相关研究表明^[34]，低分子量有机酸对土壤中重金属的解吸作用主要发生在有效态重金属这一部分，一般而言，有效态所占的比例越高，解吸量也就越大. 本实验中，随着柠檬酸浓度的增加，土壤中可解吸的汞含量的溶出量随之升高，直至接近或等于最终可解吸的汞含量(图 2). 此时A_max占供试土壤总汞的2.73%，这也从侧面反映了供试土壤中能被能被柠檬酸络合的弱酸溶解态及可交换态汞占总汞的比例是2.73%.

另外，柠檬酸浓度的增加提高了环境中H⁺的浓度，使其pH值降低，这不仅促进矿物的溶解而释放汞，同时能消耗土壤胶体和矿物表面的阳离子吸附位点^[35]. 其次，由于柠檬酸是微生物的能量来源之一，且弱酸性环境比酸性或中碱性环境更利于汞的甲基化^[36]，所以也为微生物将无机汞转化为甲基汞创造了更优越的条件.

(1) 柠檬酸对三峡水库消落区土壤中的汞有解吸及活化作用，且提高柠檬酸浓度能促进土壤中汞的活化. 汞络合量随柠檬酸浓度的增加先增大而后保持稳定，最大可占供试土壤总汞的2.73%.

(2) 柠檬酸对土壤汞的络合在上升阶段能用对数方程拟合，且络合速率基本随柠檬酸浓度的增加而增大; 在下降阶段符合二级动力学的变化规律，且反应速率常数也大致随柠檬酸浓度的增加而变大.

(3) 柠檬酸对土壤中无机汞向甲基汞的转化过程有一定的促进作用，且促进作用随着柠檬酸浓度的增加而愈加显著.