2015, Vol. 36
2. 重庆大学重庆大学城市建设与环境工程学院, 重庆 400045
2. College of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400045, China
生活垃圾填埋场稳定化过程产生的填埋气包含有55%~60%的甲烷，40%~45%的二氧化碳及微量的非甲烷类有机物(NMOCs)[1,2]. 作为重要的温室气体，甲烷对环境变化产生了重要影响，长期驯化过程覆盖层土壤中衍生的甲烷氧化菌等功能微生物能够有效缓解甲烷等温室气体的排放[3, 4, 5]，因此填埋场覆盖层在人为源甲烷减排领域起着重要作用. 受多种因素影响，填埋气波动范围很大，甲烷的扩散通量变化范围为0~1 800 g ·(m2 ·d)-1[6, 7]. 准确监测生物气变化过程不同梯度覆盖土的生物特性是有效认识甲烷氧化规律的重要前提，对强化覆盖土的温室气体减排有重要意义.
近年来，关于覆盖层甲烷氧化规律及其动力学已做了大量研究. Chanton等[8]分析了覆盖层中甲烷氧化能力与甲烷扩散通量间的关系，同一点监测结果误差达30%以上，尽管得到甲烷氧化速率和甲烷氧化率与甲烷扩散通量有正相关和反相关关系，但相关性较差(0.51 < R < 0.75). 另外，由于生物气浓度的不确定性，使得拟合结果差异很大，覆盖土的半饱和常数Km变化达200倍以上[9]，De Visscher等[10]研究发现Km随覆盖层深度增加而增大，另有研究者发现Km受多种因素影响，与深度无显著相关性[11]. 此外，还有通过建立生物气迁移转化模型的方法预测生物气浓度变化和甲烷氧化能力的研究[12]，这些研究多采用理想化条件，模型参数复杂，多种原因导致结果与实际情况并不吻合. 目前研究中还无法实现原位生物气的连续检测及实际场地的甲烷氧化动力学，因此由于生物气通量变化范围大导致的结果差异性问题始终未得到解决.
覆盖层中的微生物活动是实现甲烷氧化的根本原因，准确分析微生物群落结构，尤其甲烷氧化菌的群落结构随覆盖层梯度的变化，能够深入了解覆盖层生物特性. Arora等[13]对同一填埋场的研究得到不同点的甲烷氧化菌数量和甲烷氧化活性变化很大，分别相差1 000倍和30倍. Gebert等[14]和Kong等[15]都调查比较了不同填埋场覆盖土的甲烷氧化菌群落结构，Gebert等[14]认为甲烷氧化菌组成在不同深度和不同覆盖土中无显著差异，而Kong等[15]发现甲烷氧化菌群落结构随梯度变化而变化. Lee等[16]通过建立模拟覆盖层分析了不同梯度处甲烷氧化活性和微生物群落结构差异，发现不同梯度的甲烷氧化菌数量无显著差异. 由于检测手段的局限导致覆盖层甲烷氧化群落分析有较大差异，深入了解微生物群落结构关系对覆盖层的深入认识有重要意义.
针对无法实现覆盖层原位连续分析生物气浓度而导致的误差问题，本研究基于实际填埋场覆盖土，建立可实时在线监测的模拟覆盖层系统； 连续改变初始生物气浓度，监测不同梯度生物气的连续变化； 以双基质甲烷氧化动力学模型拟合动态变化过程中不同梯度覆盖土动力学参数，利用高通量测序技术深入分析不同梯度覆盖土微生物群落结构差异性. 该研究通过生物气连续监测分析生物气连续变化过程的甲烷氧化菌活性、 多样性和丰度，可进一步减少误差，以期为填埋场温室气体减排和甲烷氧化菌群落结构变化研究提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 模拟覆盖层装置的建立生活垃圾填埋场覆盖土取自重庆市长生桥生活垃圾填埋场，填埋时间为1.5~2 a，取土深度为0.1~0.3 m. 土样经风干破碎，剔除石块，过2 mm筛混合后有机质碳含量为1.62%(质量分数)，调节含水量为17.61%，装填高度为80 cm.
覆盖层中气体扩散和甲烷氧化过程如图 1所示. 富含甲烷的填埋气(LFG)由底部向上扩散(图中红色虚线)，氧气随空气在顶部向内部扩散(图中蓝色虚线)，大多数填埋场中甲烷氧化的主要区域为0~60 cm处. 通过检测该范围内甲烷扩散过程中生物气动态变化，以Michaelise-Menten方程为基础推导不同梯度的半饱和常数Km； 对不同深度的覆盖土进行高通量测序分析，描述甲烷氧化菌群在甲烷氧化过程的动态变化.
 | 图 1 覆盖层甲烷氧化过程示意 Fig. 1 Process of methane oxidation in landfill cover |
不同生物气组成通过调节甲烷和空气流量实现，生物气由柱底端通入，气体流量采用皂膜流量计测定. 甲烷、 氧气和二氧化碳采用气相色谱(川仪SC-6000A)测定，色谱条件: 不锈钢色谱柱TDX8-12-25 2 m，进样口温度、 柱温以及检测器(TCD)温度分别为120、 90、 120℃，氮气为载气，载气流速为25 mL ·min-1，进样量0.5 mL. 有机质采用硫酸重铬酸钾氧化为容量法测定； 全氮采用硫酸钾为硫酸铜为硒粉消煮，定氮仪自动分析法测定； 铵态氮和硝态氮采用碱解扩散法测定； 全磷采用硫酸加高氯酸消煮后钼锑抗比色法测定，以上分析方法见土壤农业化学分析方法[17].
不同梯度生物气连续监测过程: 每隔20 cm设置生物气取样口，取样管路布置参见前期研究[18]. 通过反控软件设置程序，采用六通阀控制气路转换，继电器控制气路开关，相邻深度处取样时间间隔为15 min. 每隔12 h改变一次甲烷流量，监测时间为32 d.
1.3 土壤DNA提取用Mobio PowerSoil® DNA Isolation Kit提取土壤样品中微生物总基因组DNA. 用Mobio PowerWater® DNA Isolation Kit 提取富集培养6 d后液样中微生物总基因组DNA. 并利用Mobio PowerClean® DNA Clean-Up Kit完成对DNA的纯化过程. 纯化后的DNA产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测.
1.4 PCR扩增及荧光定量以部分纯化后的DNA为扩增模板，用细菌16S DNAV3+V4区引物(338F: 5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCA-3′及806R: 5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′[19])和 TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA聚合酶，在ABI GeneAmp® 9700型PCR仪里进行扩增. 25 μL PCR反应体系中包括各0.5 μL的引物，1 μL的DNA模板、 dNTP(10 mmol ·L-1)0.5 μL，LA Taq(5 U ·μL-1)0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，灭菌水19.5 μL. PCR扩增升温程序为: 94℃ 预变性4 min； 94℃ 变性30 s、 55℃ 退火30 s、 72℃ 延伸10 s，30个循环，最后于72℃ 延伸5 min，4℃ 保存. 每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl 洗脱； 2%琼脂糖电泳检测.
参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合，收集于试剂管中放于Ilumina MiseqPE250/PE300测序仪中测序，测序参照文献[20]的方法.
1.5 高通量测序数据处理 1.5.1 原始数据处理对16S DNA高变区序列进行测序，测序区域为V3+V4区. 使用Trimmomatic、 FLASH软件对Miseq测序数据进行处理获得干净数据: ① 过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20 bp，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的read； ② 根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10 bp； ③ 拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列； ④ 检测序列末端box序列，最小错配数为0将起始端包含box的序列进行反向互补，并去除box； ⑤ 检测序列上的barcode并区分样品，barcode错配数为0，最大引物错配数为2.
1.5.2 物种分类及丰度分析在Usearch软件平台中使用uparse方法将序列按照彼此相似性为97%分归为许多小组，一个小组为一个OTU，从而得到OTU 的代表序列. 然后，使用uchime检测PCR扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除，再用usearch_global方法将优化序列map比对回OTU代表序列，最总得到OTU各样品序列丰度统计表[21].
1.6 统计分析稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个(n小于测得标签序列总数)标签序列时出现OTU数量的期望值，然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的OTU数量的期望值，根据软件R(版本3.03)及Rstudio做出稀释曲线[21].
2 结果与讨论 2.1 模拟覆盖层的构建及稳态运行基于实际填埋场覆盖土，构建了可实时在线检测的模拟覆盖层系统，生物气(甲烷)由覆盖层底部向上扩散，氧气由大气中向下自然扩散. 运行过程中，根据实际填埋场生物气中甲烷通量变化，将其控制在0~2 000 g ·(m2 ·d)-1 [8]，连续监测不同梯度生物气(甲烷、 氧气、 二氧化碳)浓度连续变化过程，持续监测32 d. 不同甲烷通量条件下不同梯度生物气连续变化过程(部分)如图 2所示. 甲烷氧化过程中生物气在覆盖层中呈明显的梯度变化，甲烷通量不变时，2~3 h内生物气浓度达稳定状态，持续监测，稳定状态十分良好； 甲烷通量改变(增加或减小)，系统平衡破坏后，各梯度生物气浓度能迅速(2~3 h)恢复稳态(如图 2).
 | 图 2 不同梯度生物气连续监测曲线 Fig. 2 Continuous monitoring curves of bio-gas in different depths |
甲烷在向上扩散过程中逐渐被微生物消耗，随甲烷通量增大各梯度处的甲烷浓度也逐渐增大[图 2(a) ]，覆盖层表层甲烷浓度维持在1%以下，说明该覆盖层能够实现甲烷的高效去除. 由于甲烷氧化过程中氧气随空气在覆盖层中由上向下扩散，氧气浓度与覆盖层深度呈反相关. 甲烷氧化开始阶段，深度大于20 cm浓度氧气浓度迅速减小； 系统稳定后，深度大于40 cm处，氧气浓度为0 [图 2(b) ]，多数研究都取得了类似结果[7]. 不同梯度氧气浓度随甲烷通量的变化如图 3所示. 在20 cm深度处，随甲烷通量的增大氧气浓度呈减小趋势，该处氧气浓度小于5%； 当甲烷通量小于1 200 g ·(m2 ·d)-1时，5 cm深处的氧气浓度与甲烷通量无相关性，甲烷通量继续增大时，氧气浓度呈减小趋势[图 2(b) ]； 而表层氧气浓度与甲烷通量几乎没有关联性. 不同甲烷通量，覆盖层生物氧化过程产生的二氧化碳在不同梯度分布如图 2(c)所示. 甲烷氧化开始时，覆盖层内部二氧化碳浓度迅速增加，在20 cm深处的浓度最大，Mahieu等[22]通过碳同位素示踪法也发现该处是二氧化碳浓度峰值，且其分布与模型拟合结果相符.
 | 图 3 覆盖层中氧气浓度随甲烷通量变化关系 Fig. 3 Change of oxygen concentration in landfill cover with methane flux |
通过分析覆盖层中氧气能够间接反映覆盖层内部的甲烷氧化程度，甲烷氧化过程中的氧气在不同梯度的分布与甲烷通量的关系如图 3所示. 在20 cm深度处，氧气浓度随甲烷通量的增大而减小，接近表层的覆盖土的氧气含量由于与大气接触，基本不受甲烷通量控制. 以相同流量的惰性气体由覆盖层底端通入时，此时覆盖层中无甲烷氧化发生，此时覆盖层中60 cm深处的氧气浓度可达10%以上(数据未显示)，对比甲烷氧化过程可知该区域仍有较高的甲烷氧化活性； 当生物气通量为0时，覆盖层内部的氧气浓度仍呈梯度变化，说明覆盖层内除甲烷氧化菌外，还有其他微生物的生命活动[12].
2.2 甲烷氧化活性与甲烷通量相关性不同梯度甲烷氧化速率随甲烷通量变化如图 4所示. 当甲烷通量小于600 g ·(m2 ·d)-1，在20~60 cm深处甲烷氧化速率与甲烷通量呈正相关(R2为0.851和0.965)，当甲烷通量继续增大，甲烷氧化速率增加缓慢或保持不变，此时甲烷在该区域内达饱和[图 4(a)和4(b)]. 在0~20 cm区域内，甲烷氧化速率随甲烷通量增大而增大，且线性关系显著(R2=0.999)，Chanton等[8]通过实际场地抽样检测也分析了它们之间关系，但其数据相关性较差(R2为0.62和0.67)，并未准确预测覆盖层的甲烷氧化规律. 与多数研究者得到的结论相同[10, 23, 24]，甲烷氧化活性主要集中在0~20 cm区域内，但同样可以看出在60 cm处仍有较高的甲烷氧化活性，平均甲烷氧化速率大于500 g ·(m2 ·d)-1.
 | 图 4 不同梯度甲烷氧化速率与甲烷通量相关性 Fig. 4 Correlation between methane oxidation rate and methane flux in different depths |
通过拟合覆盖层甲烷氧化动力学能够进一步分析不同深度覆盖层甲烷氧化潜力. 覆盖层中甲烷的需氧氧化过程主要受甲烷和氧气控制，因此以双基质Michaelis-Menten方程[9,25]为基础，利用动态平衡结果进行拟合，推导过程如下:
通过监测不同梯度处cCH4，计算1/cCH4和1/VCH4并进行线性拟合即可得到动态甲烷氧化过程中覆盖层不同区域动力学参数Km,CH4.
以动态连续监测数据拟合不同梯度覆盖层甲烷氧化动力学曲线如图 5所示. 拟合结果理想(R2为0.955、 0913和0.902)，动态和静态拟合结果如表 1所示，不同梯度覆盖土甲烷半饱和常数Km误差小于1.6%，所以可以通过原位生物气浓度监测实现覆盖层中动力学参数的拟合. 垃圾填埋场环境处于连续动态变化，包括生物气通量，温度等多种环境因子，尤其生物气(甲烷、 氧气)通量是影响覆盖土生物特性的最重要因素之一. 因此通过连续动态监测覆盖土中生物气浓度变化实现覆盖土的动力学参数 拟合可有效避免覆盖土脱离系统环境造成的误差，这对于更准确认识覆盖土的生物特性有重要意义.
 | 图 5 动态甲烷氧化过程动力学拟合 Fig. 5 Kinetics fitting of CH4 oxidation in landfill cover |
 | 表 1 动态和静态拟合结果 Table 1 Fitting results in dynamic condition and static condition |
不同土壤的甲烷氧化动力学参数差异很大，许多研究对不同场地，不同条件下的覆盖土动力学参数进行了分析[1, 9, 11, 23, 24, 26]，经统计发现覆盖土的Km,CH4变化范围为0.08%~2.5%，本研究中Km,CH4为0.157%~0.729%，说明该覆盖土对甲烷有较强亲和氧化能力. 不同梯度覆盖土的Km,CH4不同，覆盖层剖面生物气平均浓度分布及Km,CH4随覆盖层梯度变化如图 6所示. 生物气在覆盖层中分布符合覆盖层中气体分布的一般规律，环境条件一定时，不同梯度甲烷氧化活性主要受甲烷和氧气浓度控制，当梯度大于40 cm时，此处甲烷浓度处于饱和，并远高于Km,CH4，因此控制因素主要为氧气浓度[25,27]. Km,CH4随覆盖层梯度增加而增大，De Visscher等[10,23]多次研究也发现其与覆盖层梯度呈正相关，而Im等[25]发现Km,CH4随梯度的增加而减小. Km,CH4一定程度上反映不同梯度甲烷氧化活性，受土壤特性和环境变化的影响处于动态变化过程，不同研究呈现不同结果，Dunfield等[28]发现甚至在纯培养微生物中Km,CH4也是不断变化过程. 本研究基于连续监测结果，分析可知较高的甲烷氧化活性对应较高的甲烷亲和性，并随着甲烷浓度的增大，Km,CH4变大.
 | 图 6 Km,CH4与深度和生物气分布的关系 Fig. 6 Relationship between Km,CH4and depth and distribution of bio-gas in landfill cover |
覆盖土原始土样(OCS)和模拟覆盖层中不同梯度覆盖土的理化性质如表 2所示. 理化性质分析了全N、 全P、 有机质、 硝态氮和铵态氮. 除全P外，原始土样的其他理化性质和覆盖层中相比有显著性差异，有机质含量显著增大，而硝态氮和铵态氮显著减少； 表明原始土样经覆盖层的甲烷氧化过程实现了微生物的富集，并在此过程中有N的消耗. 不同梯度覆盖土样的全N、 全P和铵态氮含量无显著性差异，有机质含量在20 cm处最高，有研究表明有机质含量在覆盖土中对甲烷氧化有重要影响，一般情况下甲烷氧化能力随着含量增多而增强[29,30]，但该处硝态氮含量最低，无机氮含量对填埋场覆盖土中甲烷氧化的影响相对复杂[5]，何品晶等[31]研究发现在一定条件下，随着铵态氮含量的增加，甲烷氧化速率与之呈正相关. 可以推测该处有较强的甲烷氧化能力，使得菌体富集更多，并消耗了较多的氮元素.
| 表 2 填埋场覆盖土理化性质 Table 2 Physico-chemical properties of landfill cover soils |
覆盖土原始土样和模拟覆盖层中不同梯度样品经高通量测序后的稀释性曲线如图 7所示，样品的序列长度>15 000，相似水平为97%. 可以明显看出原始土样的稀释曲线趋于平缓，而在覆盖层中反应后稀释曲线较陡，说明甲烷富集驯化后的微生物多样性显著增加； 表层覆盖土和60 cm深覆盖土的微生物多样性高于20 cm和40 cm处覆盖土. 20~40 cm处的覆盖层为高活性甲烷氧化区，所以该区域的微生物群落中的甲烷氧化菌对其他微生物产生竞争性优势； 而表层和底层(60 cm)处的主要生物气分别为甲烷和氧气，甲烷氧化活性很低，并且其他微生物(厌氧、 好氧或兼性厌氧型)与甲烷氧化菌竞争性很小，能够呈现出共同繁殖状态. 因此出现表层和底层的微生物多样性大于中间层.
 | 相似度=97%图 7 样品中微生物群落稀释曲线 Fig. 7 Rarefaction curves of microbial communities in landfill cover soils |
覆盖层中甲烷氧化菌的种类和数量直接影响甲烷氧化活性，不同梯度覆盖层的甲烷氧化多样性有较大差异，通过高通量测序技术得到的原始土样和不同梯度覆盖土的甲烷氧化菌属水平OUT数量如表 3所示. 与原始土覆盖土相比，模拟覆盖层中的甲烷氧化菌OTU数量和多样性显著增加，说明经甲烷富集后实现了甲烷氧化菌的大量富集. 原始覆盖土中Ⅰ型甲烷氧化菌的α-Proteobacteria里的Methylobacter、 Methylocaldum、 Methylococcaceae和Methylococcales及Ⅱ型甲烷氧化菌α-Proteobacteria的Methylocystis为优势甲烷氧化菌，且比例相近. 在模拟覆盖层中运行30 d后，除Methylocystis和Methylobacterium外所有甲烷氧化菌OUT数量均显著增加，优势甲烷氧化菌为Methylobacter和Methylococcales，两者比例达70%~89%. 不同地区覆盖层的微生物群结构差异性较大，Gebert等[14]在 瑞士的研究中发现只有Methylosarcina为覆盖土中优势菌； Sadasivam等[12]调查的浙江地区的覆盖土中得到的优势菌群有Methylocystis、 Methylosoma、 Methylocaldum和Methylococcus.
| 表 3 覆盖土中甲烷氧化菌序列数(OTU)和相对丰度1) Table 3 Sequence number and relative abundance of methanotrophs in landfill cover soil |
随覆盖层梯度的增加，Methylobacter比例呈减小趋势，而Methylococcales呈增加趋势. 通过连续检测数据分析知20~30 cm处的甲烷氧化活性最高，可以推测Methylococcales相比Methylobacter有更高的甲烷氧化活性. 另外，运行30 d后Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis数量并未增加，说明该覆盖层中的甲烷氧化过程主要为Ⅰ型甲烷氧化菌起作用，有研究表明Ⅰ型甲烷氧化菌相对于Ⅱ型甲烷氧化菌有较高的甲烷亲和性，低浓度甲烷/高浓度氧气有利于Ⅰ型甲烷氧化菌的生长，Ⅱ型甲烷氧化菌更适合生长在高浓度甲烷/低浓度氧气的环境中，因此通常在覆盖土的上层Ⅰ型甲烷氧化菌较多[32, 33, 34].
3 结论(1)构建了可以实时在线监测的模拟覆盖层系统，通过连续调节甲烷浓度[0~2 000 g ·(m2 ·d)-1]可以监测不同梯度生物气(甲烷、 氧气和二氧化碳)连续变化，甲烷通量不变时，各梯度生物气可持续稳定，改变甲烷通量2~3 h即可实现系统稳定. 该系统能有效监测覆盖层甲烷氧化过程生物气的连续变化.
(2)深度大于20 cm，随甲烷通量的增大氧气浓度呈减小趋势，表层氧气浓度与甲烷通量无相关性. 不同梯度的甲烷氧化速率与甲烷通量呈正相关(R2变化范围0.851~0.999). 以平衡后生物气浓度为基础，以双基质方程：
(3)高通量测序分析了原始覆盖土和模拟覆盖层中覆盖土的甲烷氧化菌等微生物群落结构，与原始覆盖土相比，32 d后模拟覆盖层中微生物OTU数量和种类显著增多，通过甲烷氧化菌OTU和相对丰度确定优势菌群为Ⅰ型菌的Methylobacter和Methylophilaceae及Ⅱ型菌Methylocystis.
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