果园生草栽培是欧美等果树生产发达国家普遍采用的果园可持续发展的土壤管理模式^[1]，我国于1998年将果园生草栽培作为绿色果品生产主要技术措施在全国进行推广^[2]. 但实践中清耕果园面积占果园总面积的90%以上，果园生草在我国尚处于试验与小面积应用阶段. 对渭北黄土高原苹果园生草栽培研究发现^{[3, 4, 5, 6]}，生草能降低土壤容重、 增加土壤孔隙度、 提高田间贮水量，提高土壤养分与有机碳的含量，改善了土壤有机碳的质量，改变了土壤有机碳各组分的含量与分布. 而土壤有机碳与养分可通过土壤微生物的代谢、 降解及利用进行转化和循环^[7]，因此从土壤微生物生态学角度分析果园生草条件下土壤微生物的种类组成和数量变化，及土壤微生物对碳源的利用情况不仅有助于探讨生草果园土壤碳转化的机制，而且有助于揭示生草果园土壤的生态学过程.

Biolog方法是利用微生物对碳源的利用程度来反映微生物生理活动的轮廓以及指示微生物群落的总体活性和代谢功能的分析方法^[8]. 自Garland等^[9]首次将这种方法用来描述微生物的群落特征后，Biolog技术已经广泛应用于不同生态环境所引起的土壤微生物群落变化的研究与评价，如比较不同土地利用方式^[10]、 不同植被类型^[11,12]、 污染土壤^[13,14]、 不同气候类型^[15]的微生物群落的功能多样性. 然而，采用Biolog技术对生草果园土壤微生物功能多样性进行研究的报道还很少见. 因此，本研究以渭北生草果园为对象，利用Biolog微平板检测技术，对生草果园土壤微生物代谢功能多样性的变化规律进行分析，初步阐明果园生草条件下土壤微生物群落的碳源利用特征，通过揭示生草果园土壤生态学过程的驱动机制，以期为生草果园的科学管理和果园生草的推广提供新的理论依据和数据支持.

试验区是白水县中部杜康镇塬面西北农林科技大学苹果试验站果园，位于渭北黄土高原苹果代表产区白水县，地处东经109°16′~109°45′，北纬35°4′~35°27′，属暖温带大陆性季风气候，平均海拔850 m左右，土壤为黄绵土，土层深厚，剖面质地均匀，多年平均气温11.4℃，多年平均降水量577.8 mm，降水年际变化大，年内分配不均，日照充足，光热资源丰富，无霜期207 d. 苹果品种为13 a生乔化红富士(富士/新疆野苹果Malus demestica Borkh)，栽植密度3 m×8 m.

选取苹果园清耕(clear tillage)、 苹果∕白三叶(Trifolium repens)间作、 苹果∕小冠花(Coronilla varia L.)间作、 苹果/鸡脚草(Dactylis glomerata L.)间作这4种管理模式(下文分别称清耕、 白三叶、 小冠花和鸡脚草)，每个模式重复3次，共12个小区，每小区面积是30 m²(6棵苹果树)，2005年3月进行间生草播种，现已持续生草8 a，播前深翻整地，开沟条播，播种密度为0.75 g ·m^-2，每年刈割2~3次，覆盖于苹果树行间，各处理区的生态条件和田间管理措施保持一致.

2013年10月，在各处理区随机布设5个采样点，清除表层凋落物，用直径为3.5 cm土钻采集5~20 cm深度土样，同一小区土样混匀作为1个样品，共12个样，土样去除根系、 枯落物，装入无菌塑料袋，放入冰盒，运回实验室后分成2份，一份过2 mm筛后放在4℃冰箱保存，用于土壤微生物功能多样性和微生物量碳的测定，另一份自然风干后过筛，用于土壤理化性质测定.

称取相当于5 g烘干土重的新鲜土样加入装有45 mL无菌水的三角瓶中，加无菌棉花塞，振荡30 min后，按逐步稀释依次稀释为10^-2、 10^-3梯度液. 用10^-3稀释液接种Biolog-ECO生态测试板，接种量为150 μL，每样1板，每板3次重复. 将接种好的测试板加盖，在(25±1)℃下连续培养10 d，每隔24 h用 BIOLOG自动读数装置在590 nm下读数.

土壤有机碳用重铬酸钾容量法(外加热)测定； 土壤pH值直接用pH计进行测定，水土比2.5 ∶1； 土壤全氮用凯氏法消解，凯氏定氮仪测定； 土壤含水量测定采用烘干法，105℃烘12 h后称重得到质量含水量； 微生物量碳用氯仿熏蒸浸提,TOC自动分析仪测定. 各处理土壤的基本性质见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 不同处理的土壤理化性质及微生物量碳 1) Table 1 Soil physico-chemical properties and microbial biomass carbon of different treatments 处理 pH 含水量 /% 全氮 /g·kg-1 有机碳 /g·kg-1 微生物量碳 /mg·kg-1 白三叶 8.21±0.03a 16.71±2.05a 0.58±0.01a 10.02±0.05a 295.21±5.96a 小冠花 8.20±0.05a 16.29±1.11a 0.52±0.02b 9.75±0.13a 263.21±20.65b 鸡脚草 8.18±0.02a 16.24±0.63a 0.47±0.02c 8.66±0.09b 205.78±19.32c 清耕 8.16±0.02a 15.43±0.60a 0.36±0.02d 7.74±0.32c 194.28±3.07c 1)同列中不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

表 1 不同处理的土壤理化性质及微生物量碳 1) Table 1 Soil physico-chemical properties and microbial biomass carbon of different treatments

土壤微生物群落利用碳源的整体能力用平均颜色变化率(average well color development,AWCD)表 示，采用Biolog微平板培养120 h的数据进行统计分析，土壤微生物群落功能多样性指数分析采用Shannon指数、 丰富度指数和McIntosh指数^[16]表征.

式中，C_i为所测定的31个碳源孔吸光值； R为对照孔吸光值； n为碳源数目.

群落Shannon指数(H):

式中，P_i为第i孔相对吸光值与整板平均相对吸光值总和的比，即:

群落丰富度指数(S)=碳源代谢孔的总数目(微孔的光密度值≥0.25,则认为该孔碳源被利用，即为碳源代谢孔).

群落McIntosh指数(U):

式中，n_i为第i孔的相对吸光度，即n_i=C_i－R.

采用Excel 2007软件对数据进行统计分析，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并用最小显著差数(least significant difference,LSD)法进行差异显著性检验，利用Pearson相关系数评价AWCD值、 Shannon指数、 丰富度指数、 McIntosh指数与土壤理化性质(pH、 含水量、 有机碳、 全氮)及微生物量碳的相关关系，主成分分析是采用降维的方法将不同样本的多元向量变换为互不相关的主元向量，在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同微生物群落的代谢特征^[17],利用培养120 h的吸光值对微平板中的31种碳源进行主成分分析.

平均颜色变化率(AWCD)是表征土壤微生物活性的重要指标，AWCD值的变化速率和最终能达到的AWCD值反映了土壤微生物利用某一碳源物质的能力，在一定程度上反映了土壤微生物种群的数量和结构特征. AWCD值越大，表明土壤中微生物活性越高^[18,19]. 从图 1可以看出，各处理土壤微生物呈现明显的特征: 随着培养时间的延长，其利用碳源量逐渐增加. 在0~24 h培养时期，各处理的AWCD均很小，说明在24 h之内碳源基本未被微生物群落利用； 24~120 h内AWCD快速增加，反映出微生物群落活性明显增强，碳源被大幅度利用； 120 h以后，各处理的AWCD增长速率有所降低且趋于稳定. 这表明AWCD在120 h时处于“拐点”处，采用120 h的吸光值进行分析能更真实地反映实际情况^[20].

图 1

Fig. 1

图 1 不同处理土壤微生物群落平均颜色变化率 Fig. 1 Average well color development of soil microbial community in different treatments

在整个培养过程中，各处理土壤微生物群落的AWCD存在明显差异，大小顺序依次为: 白三叶>小冠花>鸡脚草>清耕，即豆科牧草白三叶处理的土壤微生物活性最大，小冠花、 鸡脚草处理次之，清耕处理最小. 对120 h的AWCD进行方差分析(表 2)，白三叶与小冠花处理差异不显著，清耕处理与这2个生草处理差异显著，而与鸡脚草处理无显著差异. 说明生草能提高土壤微生物的活性，且豆科牧草优于禾本科牧草.

研究土壤微生物对微平板上不同碳源利用能力，即Biolog代谢指纹图谱，有助于较为全面地了解微生物群落代谢功能特征^[21]. 从图 2可以看出，生草处理土壤微生物对31种碳源的利用能力大于清耕处理，白三叶土壤代谢指纹图谱中AWCDi≥0.8的碳源有17种(糖类7种，氨基酸类3种，羧酸类4种，多聚物类3种)，占总碳源的54.8%；小冠花土壤也有17种(糖类7种，氨基酸类4种，羧酸类3种，多聚物类2种，胺类1种)，占总碳源的54.8%； 鸡脚草土壤有15种(糖类5种，氨基酸类4种，羧酸类3种，多聚物类2种，胺类1种)，占总碳源的48.4%； 清耕土壤有12种(糖类4种，氨基酸类3种，羧酸类3种，多聚物类1种，胺类1种)，占总碳源的38.7%. 生草处理土壤微生物碳源利用代谢功能与清耕相比，差异显著的碳源分别为: 白三叶处理18种，小冠花11种，鸡脚草4种，说明生草使土壤微生物对单一碳源的利用能力发生改变，微生物活性改变. 豆科牧草白三叶和小冠花对碳源的种类影响较大，微生物对碳源的利用能力较强，土壤微生物对N-乙酰-D-葡萄糖胺、 D-甘露醇、 甘氨酰-L-谷氨酸、 吐温40、 β-甲基-D-葡萄糖苷、 肝糖、 L-丝氨酸、 L-苏氨酸的代谢能力显著高于清耕处理的土壤微生物. 此外，各处理土壤微生物对2-羟基苯甲酸基本不利用.

图 2

Fig. 2

G1~A3: 糖类； A4～F4: 氨基酸类； B1～H3: 羧酸类； C1～F1: 多聚物类； C3～D3: 芳香类； G4～H4: 胺类； AWCDi值为Biolog板上3次重复的平均值； *表示P＜0.05； ** 表示P＜0.01 图 2 土壤微生物生理碳代谢指纹图谱 Fig. 2 Metabolic fingerprint of carbon physiological profiles of soil microbial community

群落多样性指数可以反映土壤微生物群落利用碳源类型的差异. Shannon指数反映土壤微生物群落物种变化度和差异度，指数值越大，表示微生物种类多且分布均匀. 丰富度指数表示被利用碳源的总数目. McIntosh指数反映了碳源利用种类数的不同，能以此区分不同的碳源利用程度^[22,23]. 由表 2可以看出，与AWCD相似，白三叶处理的Shannon指数、 丰富度指数、 McIntosh指数均最大，表明白三叶处理土壤微生物种类最多、 分布较均匀且对碳源利用程度最高. 白三叶处理与小冠花处理土壤微生物功能多样性指数差异不显著，但均显著高于清耕处理，说明豆科牧草显著提高土壤微生物的种类数与均匀度以及增加土壤微生物的碳源利用能力. 小冠花处理土壤微生物丰富度指数比鸡脚草大，但是其Shannon指数却小于鸡脚草，这是因为微生物Shannon指数不仅取决于微生物碳代谢数目，而且与每个孔中微生物代谢活性有密切的关系，这种情况与毕江涛等^[24]在研究白沙蒿群落土壤微生物丰富度指数比沙米群落大，但Shannon指数小于沙米群落情况相同. 鸡脚草处理的Shannon指数与丰富度指数显著高于清耕处理，但McIntosh指数差异不显著，说明鸡脚草处理虽能显著提高土壤微生物的种类数，但土壤微生物的碳源利用能力没有显著增强，因此对土壤微生物的整体代谢活性影响较小，这也是两种处理的AWCD值差异不显著的原因.

表 2(Table 2)

表 2 120 h土壤微生物群落AWCD值及多样性指数 Table 2 AWCD and diversity indices in soil microbial community at incubation time of 120 h 处理 AWCD Shannon指数 丰富度指数 McIntosh指数 白三叶 1.03±0.07a 3.08±0.15a 24.33±0.50a 7.29±0.45a 小冠花 0.93±0.05a 3.04±0.67a 23.67±0.58ab 6.69±0.35a 鸡脚草 0.71±0.03b 3.06±0.27a 22.00±1.61b 5.10±0.19b 清耕 0.62±0.06b 2.88±0.53b 18.33±0.50c 4.90±0.30b

表 2 120 h土壤微生物群落AWCD值及多样性指数 Table 2 AWCD and diversity indices in soil microbial community at incubation time of 120 h

应用主成分分析，在31个因子中共提取了8个主成分因子，累积方差贡献率达到了94.3%，从中选取累积方差贡献率达到56.1%的前两个主成分PC1和PC2(特征根分别为13.94和3.46)来分析微生物群落功能多样性. 从图 3可以看出，不同处理在PC轴出现了明显的分异，整体可分为4大类: 白三叶、 小冠花、 鸡脚草、 清耕各为一类，可见PC1和PC2能区分不同处理土壤微生物的群落特征. 在PC1轴上，白三叶、 小冠花处理分布在正方向上，得分系数为0.23~1.82； 鸡脚草、 清耕处理分布在负方向上，得分系数为-1.28~-0.35. 在PC2轴上，小冠花、 鸡脚草处理分布在正方向上，得分系数为0.40~1.37； 白三叶、 清耕处理分布在负方向上，得分系数为-1.35~-0.46. 对主成分进行方差分析可知，不同处理在PC1和PC2上得分系数出现显著差异(表 3)，在PC1轴上，白三叶处理与其他处理均差异显著； 在PC2轴上，小冠花、 鸡脚草处理与白三叶、 清耕处理差异达到显著水平. 考虑到2个主成分所反映的变异，计算得到各处理的综合得分系数(表 3)，豆科牧草(白三叶和小冠花)、禾本科牧草鸡脚草与清耕三组处理有显著性的差异，而豆科牧草白三叶与小冠花处理之间差异不显著，说明这2种生草处理土壤微生物群落具有相似的碳源利用模式，土壤微生物群落代谢功能相似.

图 3

Fig. 3

图 3 不同处理土壤微生物群落代谢主成分分析 Fig. 3 Principal component analysis for carbon utilization of soil microbial community in different treatments

表 3(Table 3)

表 3 不同处理下主成分得分系数 Table 3 Principal component scores in different treatments 处理 第一主成分 第二主成分 综合主成分 白三叶 1.28±0.50a -0.77±0.28b 0.49±0.23a 小冠花 0.42±0.26b 0.97±0.46a 0.29±0.16a 鸡脚草 -0.61±0.24c 0.85±0.39a -0.18±0.07b 清耕 -1.09±0.22c -1.04±0.27b -0.61±0.07c

表 3 不同处理下主成分得分系数 Table 3 Principal component scores in different treatments

考察PCA的相关性矩阵，对前3个主成分贡献的特征向量系数大于0.50的碳源类型进行分析(见表 4). 对PC1贡献大的碳源有21种，其中糖类占33.3%，氨基酸类占23.8%，多聚物类与羧酸类均占14.3%，可见对PC1起分异作用的碳源主要是糖类和氨基酸类，其次是多聚物类和羧酸类. 对PC2和PC3贡献大的碳源分别有4种和2种，其中对PC2贡献最大的碳源是羧酸类，占50%.

表 4(Table 4)

表 4 与PC1，PC2和PC3显著相关的碳源 Table 4 Carbon sources significantly correlated with PC1,PC2 and PC3 主成分 碳源种类 相关系数 主成分 碳源种类 相关系数 糖类 N-乙酰-D-葡萄糖胺 0.889 多聚物类 α-环式糊精 0.723 D-纤维二糖 0.806 肝糖 0.777 β-甲基-D-葡萄糖苷 0.768 吐温40 0.895 D-半乳糖酸内脂 0.715 PC1 羧酸类 D-半乳糖醛酸 0.836 α-D-葡萄糖-1-磷酸 0.799 丙酮酸甲酯 0.704 D,L-α-磷酸甘油 0.847 γ-羟丁酸 0.725 α-D-乳糖 0.719 胺类 苯乙胺 0.762 PC1 D-甘露醇 0.960 PC2 糖类 D-木糖 -0.679 氨基酸类 L-精氨酸 -0.649 羧酸类 衣康酸 0.797 甘氨酰-L-谷氨酸 0.702 α-丁酮酸 0.606 L-苯基丙氨酸 0.814 多聚物类 吐温80 0.725 L-丝氨酸 0.773 PC3 氨基酸类 L-天门冬酰胺 -0.774 L-苏氨酸 0.786 芳香类 4-羟基苯甲酸 -0.557 糖类 i-赤藓糖醇 0.730

表 4 与PC1，PC2和PC3显著相关的碳源 Table 4 Carbon sources significantly correlated with PC1,PC2 and PC3

由表 5可知，土壤微生物群落功能多样性各指标与土壤有机碳、 全氮、 微生物量碳呈极显著正相关，Shannon指数与pH呈显著正相关，可见土壤养分及有机碳组分与微生物群落功能多样性密切相关，是造成各处理土壤微生物多样性差异的重要原因.

表 5(Table 5)

表 5 土壤理化性质及微生物量碳与微生物群落功能多样性相关性分析 Table 5 Correlation analysis of soil properties and functional diversity of soil microbial community 项目 AWCD Shannon指数 丰富度指数 McIntosh指数 pH 0.489 0.671* 0.457 0.480 含水量 0.300 0.423 0.293 0.281 全氮 0.883** 0.803** 0.945** 0.837** 有机碳 0.952** 0.866** 0.919** 0.925** 微生物量碳 0.913** 0.840** 0.736** 0.922** 1)*表示P<0.05； ** 表示P<0.01

表 5 土壤理化性质及微生物量碳与微生物群落功能多样性相关性分析 Table 5 Correlation analysis of soil properties and functional diversity of soil microbial community

土壤微生物多样性能敏感地反映土壤环境的微小变化，可作为衡量土壤质量和评价土壤生态系统稳定的重要生物学指标^{[25, 26, 27, 28]}. 本试验中不同处理土壤微生物利用碳源的代谢活性随着培养时间的延长呈逐渐增加的趋势，即AWCD随着培养时间的延 续呈现出微生物常规生长曲线^[8]. AWCD的值越高，土壤中微生物群落的代谢活性也就越强^[19]，整个培养过程中，生草处理的土壤微生物对碳源的代谢能力明显高于清耕处理，分析其可能的原因是: 生草栽培降低了果园土壤容重，增加了土壤的通气性，提高了土壤有机质与养分的含量^[4,5]，改善了土壤水热状况与营养状况^[29]，使土壤环境更加适合微生物的生存与繁殖. 这与钱进芳等^[30]在山核桃林地的研究结果相一致. 此外，不同生草处理的土壤微生物对碳源的利用能力存在明显差异，表现为: 白三叶>小冠花>鸡脚草. 这是因为生草能通过凋落物和根系分泌物为土壤微生物提供营养物质，而不同的生草凋落物和根系分泌物的质量与数量不同，导致其在分解过程中释放的有机物质(供微生物利用的碳源与氮源)有很大的差异，通过对土壤微生物的生长选择性刺激作用来影响土壤微生物的活性和多样性^{[31, 32, 33, 34, 35]}. Grayston等^[35]认为，不同植物根系产生的碳源类型及其有效性不一样，导致土壤微生物群落组成与数量的差异.

不同的多样性指数反映土壤微生物群落组成的不同方面，把它们结合起来可以分析土壤微生物群落的功能多样性^[20]. 本研究中，生草处理的Shannon指数、 丰富度指数、 McIntosh指数均高于清耕处理，说明生草处理土壤微生物群落功能多样性优于清耕处理，且豆科牧草白三叶最优. 土壤养分及有机碳与土壤微生物多样性指数具有一定的相关性，Shannon指数、 丰富度指数、 McIntosh指数与土壤有机碳、 全氮、 微生物量碳呈极显著正相关，Shannon指数与pH呈显著正相关，说明土壤有机碳的组成与含量是影响土壤微生物多样性的重要因素，这与其他学者的研究结果相似^{[23, 30, 36]}. 如吴则焰等^[23]对不同植被类型土壤微生物群落特征的研究发现，土壤微生物群落功能多样性指数与土壤总有机碳、 全氮呈极显著正相关.

主成分分析表明，不同处理的微生物群落功能多样性差异显著，PC1和PC2把生草处理与清耕处理很好地区分开来，其中与PC1显著相关的碳源有21种，主要为糖类和氨基酸类，其次是多聚物类和羧酸类； 与PC2显著相关的碳源有4种，主要为羧酸类. 碳代谢指纹图谱也表明，生草处理土壤微生物对31种碳源的利用能力大于清耕处理，其中豆科牧草白三叶与小冠花土壤微生物对糖类(N-乙酰-D-葡萄糖胺、 D-甘露醇、 β-甲基-D-葡萄糖苷)、 氨基酸类(甘氨酰-L-谷氨酸、 L-丝氨酸、 L-苏氨酸)、 多聚物类(吐温40、 肝糖)的利用代谢能力显著高于清耕处理. 由此可知，生草处理与清耕处理土壤微生物群落形成了各自独特的代谢功能特征，且白三叶与小冠花处理土壤微生物比较偏好的碳源类型为糖类、 氨基酸类和多聚物类，说明这2种生草土壤中利用糖类、 氨基酸类和多聚物类的微生物的代谢活动和数量显著多于清耕处理. 这是因为果园生草后，凋落物的分解与根系的分泌为土壤微生物提供了大量糖类、 氨基酸、 多聚物等碳源物质^[37]，促进了碳源利用类型相对应的微生物的生长与繁殖，从而对土壤微生物的群落结构产生影响. 有研究表明^[38,39]，根系分泌物为土壤微生物提供了有效的碳源与氮源，且其种类与数量决定了土壤微生物的种类与数量，并对微生物的生长繁殖及代谢过程产生影响.

综上可见，生草栽培为果园土壤输入了大量凋落物及其根系分泌物，以及生草通过改变果园小气候^[29]、 土壤理化性质^[4,5]、 土壤团聚体^[6]等土壤环境，引起了土壤微生物群落组成发生变化，反之土壤微生物群落结构的变化也会对土壤的物理化学过程产生影响，进而影响生草的生长发育. Biolog技术能够快速测定土壤微生物群落的功能多样性，但该方法是利用微生物生长代谢来作为衡量微生物多样性的基础，只能对环境微生物群落活性与功能进行分析，无法直接获取微生物群落结构的详细信息，因此接下来的工作将是研究产生其代谢差异的微生物的种类组成，以及运用分子生物学的方法对生草果园土壤微生物多样性进行研究，以期进一步揭示生草果园土壤的生态学过程.

(1) 4个处理土壤微生物对碳源的利用差异很大，其中白三叶土壤微生物对碳源的利用程度最大，其次是小冠花和鸡脚草，清耕土壤微生物对碳源的利用程度最低.

(2) 4个处理土壤微生物群落代谢功能特征不同，主要体现在糖类上，其次是氨基酸类与多聚物类.

(3) 4个处理土壤微生物的AWCD、 Shannon指数、 丰富度指数、 McIntosh指数与土壤有机碳、 全氮、 微生物量碳呈极显著正相关，Shannon指数与pH呈显著正相关,表明微生物功能多样性能较真实地反映生草果园土壤的质量状况.