氨氧化过程作为硝化作用的限速步骤，在全球氮素循环中发挥着极为重要的作用. 一直以来，氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)被认为是氨氧化过程的主要驱动者. 随着技术手段的不断进步，特别是宏基因组技术和高通量测序的发展，研究者在海洋中发现了一类新的氨氧化微生物——氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)^[1,2]，且其广泛存在于各种环境中^{[3, 4, 5]}. 很多环境中AOA在数量上较AOB占明显优势，表明由其推动的氨氧化过程可能比AOB更为强烈^{[6, 7, 8]}. AOA和AOB对氨氧化过程的相对贡献，一直都是氮素循环研究中最重要的研究问题之一.

由amoA、 amoB和amoC这3个结构基因构成的氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)，是好氧氨氧化微生物所特有的一种胞内酶，其中amoA基因编码该酶的活性中心，催化由铵盐到羟胺的过程，为该类微生物提供能量^[9,10]. amoA基因编码直接参与氨氧化过程的酶，与16S rRNA基因序列相比，其序列变化更能反映种群差异，对微生物的差异分析具有更高的分辨力^[11]. 目前，基于amoA基因序列的分析已被广泛应用于好氧氨氧化微生物分子生态学研究中，通常采用引物Arch-amoAF和Arch-amoAR检测AOA^[3]，引物amoA-1F和amoA-2R检测AOB^[10].

在最适温度条件下，通过向环境样品中添加过量氨氮测定潜在硝化速率(potential nitrification rates,PNR)^[12]，可以比较硝化微生物转化氨氮的速率，这对于了解AOA和AOB对硝化作用的相对贡献具有重要的参考价值. 已有研究表明PNR与好氧氨氧化微生物amoA基因拷贝数之间存在相关性，如Caffrey等^[13]发现美国几个东南部河口区域的PNR与氨氧化古菌amoA拷贝数有显著正相关关系，而与氨氧化细菌amoA拷贝数没有明显的相关性； Zheng等^[14]发现崇明岛东部潮间带沉积物中夏、 冬两季的PNR与好氧氨氧化微生物总amoA拷贝数均有显著的正相关关系.

乳山湾位于山东半岛，为一半封闭的浅水海湾，是重要的经济贝类养殖区. 养殖业的迅速发展导致排海的有机物显著增加，大量有机质和还原性物质在经历一系列生物、 化学过程后消耗了底层海水的大量氧气，使得乳山湾及近海水体溶解氧浓度明显降低^[15]. 研究表明，夏季乳山湾近海海域存在一个溶解氧低值区^[16]. 溶氧低值区的存在会破坏表层沉积物的氧化性环境，这可能会影响该海域物质形态和循环过程^[17]，特别会对硝化反应的进行及氨氧化微生物的种群丰度造成影响^{[13, 18, 19]}. 本研究以好氧氨氧化微生物为对象，通过实时荧光定量PCR技术和潜在硝化速率模拟培养实验，揭示沉积物中好 氧氨氧化微生物的种群活性特征，以期为乳山湾邻近海域沉积物中氮素生物地球化学过程研究提供依据.

2014年8月采集乳山湾近岸海域表层沉积物样品，采样站位为A3站(121.297°E,36.583°N)、 C2站(121.493°E,36.662°N)及E3站(121.660°E,36.642°N)(图 1). 利用CTD多参数温盐深仪对各个站位底层水的温度、 盐度、 溶解氧浓度等理化参数进行现场测定，营养盐浓度利用营养盐自动分析仪测定，具体理化参数见表 1. 沉积物分装在灭菌铝盒中，置于-80℃超低温冰箱中用于核酸提取. 部分沉积物样品低温保存立即带回实验室进行模拟培养实验.

图 1

Fig. 1

图 1 乳山湾邻近海域采样站位示意 Fig. 1 Sampling stations in adjacent waters of Rushan Bay

表 1(Table 1)

表 1 乳山湾邻近海域底层水的理化参数 Table 1 Physiochemical parameters of bottom water in adjacent waters of Rushan Bay 站位 温度/℃ 盐度/PSU 溶解氧/mg·L-1 NH+4/μmol·L-1 NO-2/μmol·L-1 NO-3/μmol·L-1 A3 22.555 30.764 4.384 1.089 0.278 2.548 C2 23.294 30.516 4.133 0.617 0.382 3.059 E3 21.581 30.579 4.455 0.891 2.317 2.997

表 1 乳山湾邻近海域底层水的理化参数 Table 1 Physiochemical parameters of bottom water in adjacent waters of Rushan Bay

分别用PowerSoil DNA Isolation kit(MoBio,USA)和RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit(MoBio,USA)提取表层沉积物中微生物总DNA和总RNA. 反转录按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche,Germany)操作说明进行. 利用引物Arch-amoAF/Arch-amoAR和amoA-1F/amoA-2R分别扩增AOA和AOB amoA基因(表 2). PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，检测目的条带.

表 2(Table 2)

表 2 引物序列 Table 2 Primers used in this study 引物名称 引物序列(5′-3′) 长度 /bp 退火温度 /℃ Arch-amoAF STAATGGTCTGGCTTAGACG 635 56 Arch-amoAR GCGGCCATCCATCTGTATGT amoA-1F GGGGTTTCTACTGGTGGT 491 58 amoA-2R CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC

表 2 引物序列 Table 2 Primers used in this study

将目的条带切胶纯化，连接到pMD18-T载体(宝生物，大连)后转化到Escherichia coli Trans 5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选含有目的基因的阳性克隆. 快速质粒小提试剂盒(康为，北京)制备质粒，将得到的质粒DNA进行PCR扩增，经电泳确认后，送测序公司测序(华大基因，北京)，测序结果提交至GenBank，登录号为KT122944和KT122945.

用Picodrop超微量紫外分光光度计(Picodrop,UK)测得重组质粒的浓度，计算amoA重组质粒的拷贝浓度. 将得到的质粒10倍梯度稀释，保存于-80℃超低温冰箱中，用于建立定量PCR体系的质粒标准曲线.

以梯度稀释的质粒标准品为模板，利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche,Germany)进行荧光定量PCR反应(Applied Biosystems,USA)，并在反应体系中加入0.2 μg ·μL^-1牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA). 定量古菌amoA基因拷贝数的反应程序为: 50℃ UNG酶激活2 min，95℃热启动10 min，随后40个循环，包括95℃ 15 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min； 定量细菌amoA基因拷贝数的反应程序为: 50℃ UNG酶激活2 min，95℃热启动10 min，随后40个循环，包括95℃ 15 s，58℃ 2 min. 扩增完毕后进行熔解曲线分析，以确定每个样品都是特异性扩增. 每个质粒浓度做3个平行样，实验体系中同时添加阴性对照. 以质粒拷贝数对数值为横坐标，C_t值为纵坐标，绘制标准曲线.

样品测定的定量PCR体系和条件与标准曲线相同，每个样品3个平行样，实验体系中同时包括阳性对照和阴性对照. 通过标准曲线换算样品中amoA基因的拷贝数.

按照Bernhard等^[20]的方法测定潜在硝化速率. 将1.0 g沉积物加入30 mL人工配制的水样(海水经0.22 μm滤膜过滤后，加入NH₄Cl和KH₂PO₄使其终浓度分别为300 μmol ·L^-1和60 μmol ·L^-1)中，黑暗条件下连续振荡培养，0、 24、 48 h分别取样、 离心、 过滤，-20℃保存. 另一组实验中加入1.0 g ·L^-1氨苄青霉素^[21]，实验方法同上. 测定硝酸盐和亚硝酸盐浓度，根据硝酸盐和亚硝酸盐浓度随时间的变化计算潜在硝化速率. 所有样品设置3个平行样.

总DNA定量PCR结果表明，表层沉积物中氨氧化古菌amoA基因拷贝数为2.483×10⁵~6.432×10⁵ cells ·g^-1，氨氧化细菌amoA基因拷贝数为2.679×10⁷~4.801×10⁷ cells ·g^-1(图 2). 总RNA定量PCR结果表明，每克沉积物中存活的氨氧化细菌amoA基因拷贝数为2.978×10³~4.382×10⁴ cells ·g^-1，而在3个采样站位中均未检测到存活的氨氧化古菌. 本研究中细菌amoA拷贝数均高于古菌amoA，这与之前的部分研究结果相似^{[21, 22, 23, 24]}. 研究区域中活性AOB占总AOB比值低于1%，而活性AOA未检测到，推测这一结果可能是因为绝大多数氨氧化微生物处在非活性细胞状态，并没有执行氨氧化功能.

图 2

Fig. 2

图 2 乳山湾邻近海域表层沉积物中AOA和AOB的丰度分布 Fig. 2 Abundance distribution of AOA and AOB in surface sediments in adjacent waters of Rushan Bay

作为一种转肽酶的竞争性抑制剂，氨苄青霉素能够抑制革兰氏阴性菌、 阳性菌生长过程中细胞壁的形成，从而使细菌细胞破裂死亡； 但是氨苄青霉素不会抑制氨氧化古菌的活性. 目前已有研究通过添加氨苄青霉素以讨论硝化过程中AOA和AOB的相对贡献^[21]. 乳山湾邻近海域采样站位表层沉积物潜在硝化速率的分布特征如图 3. 未添加氨苄青霉素时其潜在硝化速率(以N/沉积物计)为0.782~1.666 μmol ·(d ·g)^-1； 添加氨苄青霉素后，潜在硝化速率下降了约90%. t检验结果表明，潜在硝化速率在添加氨苄青霉素前后变化显著(P<0.05). 由此可知，本研究区域的氨氧化过程主要由AOB推动，这也与未检测到活性AOA的结果基本一致.

图 3

Fig. 3

图 3 乳山湾邻近海域表层沉积物中的潜在硝化速率 Fig. 3 Potential nitrification rates in surface sediments in adjacent waters of Rushan Bay

分别对PNR和总AOA amoA基因拷贝数、 PNR和总AOB amoA基因拷贝数、 PNR和活性AOB amoA基因拷贝数进行相关性分析，结果表明，PNR与总AOB amoA拷贝数呈显著负相关(P<0.05)，而与活性AOB amoA基因拷贝数之间没有显著相关性(P<0.05)，见表 3.

表 3(Table 3)

表 3 潜在硝化速率与amoA基因拷贝数相关性分析 Table 3 Correlation analysis of potential nitrification rates and amoA gene copy numbers 项目 总AOA amoA 基因拷贝数 总AOB amoA 基因拷贝数 活性AOB amoA 基因拷贝数 潜在硝化速率(未添加氨苄青霉素) -0.431 -1.0001) 0.491 潜在硝化速率(添加氨苄青霉素) 0.457 — 1)表示二者显著相关(P<0.05)

表 3 潜在硝化速率与amoA基因拷贝数相关性分析 Table 3 Correlation analysis of potential nitrification rates and amoA gene copy numbers

好氧氨氧化过程与氮循环中其他过程相耦合，对维持氮平衡等具有重要意义. AOB和AOA作为该过程的主要驱动者，对好氧氨氧化过程的相对贡献一直是人们研究的焦点. 盐度^[13,22]、 pH^[25,26]、 铵盐浓度^[27]和亚硝酸盐浓度^[28]等均是影响AOA和AOB种群丰度的重要环境因子，其中铵盐浓度和盐度是两个较为重要的参数. AOA较AOB对铵盐有更高的亲和力，如Candidatus Nitrosopumilus maritimus SCM1对氨(NH₃+NH⁺₄)的半饱和常数为133 nmol ·L^-1，而AOB对氨(NH₃+NH⁺₄)的半饱和常数则为46~1 780 μmol ·L^-1，因此铵盐浓度可以作为影响AOA和AOB种群结构的一个重要因素^[29]. 盐度能够影响NH⁺₄的吸附^[30]，因此也是影响氨氧化过程的一个重要参数. 对活性AOB占AOB的比例与环境因子的关系进行分析发现，活性AOB占AOB的比例随着铵盐浓度的增加而增大，这可能与AOB适合在铵盐浓度较高的环境中存活有关(图 4)，这也与之前的其他研究结果相符^[31].

图 4

Fig. 4

图 4 乳山湾邻近海域不同站位表层沉积物中活性AOB占AOB的比例和铵盐浓度的关系 Fig. 4 Relationship between ratio of active AOB to AOB and ammonium concentrations in surface sediments in adjacent waters of Rushan Bay

采用Canoco for Windows 4.5软件对氨氧化微生物种群丰度和环境数据进行分析(图 5). 种群丰度与环境因子前两个排序轴的相关系数分别为0.764和0.236，且第一排序轴与第二排序轴近似垂直，相关系数为0.000，说明排序轴与环境因子间的线性结合程度较好地反映了物种与环境的关系，排序结果可靠. 表 4反映了种群丰度排序轴与环境因子的相关性. 第一排序轴与温度呈正相关，与溶解氧浓度、 铵盐浓度呈负相关； 第二排序轴与盐度呈正相关. 因此，溶解氧浓度、 温度及铵盐浓度在好氧氨氧化微生物种群丰度分布上影响最为重要. 其中，溶解氧浓度和铵盐浓度对AOA种群丰度影响较大，温度对AOB种群丰度分布影响较大.

图 5

Fig. 5

图 5 环境因子与AOA、 AOB种群丰度的RDA二维排序 Fig. 5 RDA ordination of the relationships of environmental parameters and abundance of AOA and AOB

表 4(Table 4)

表 4 环境因子与前两个排序轴间的相关系数 Table 4 Correlation coefficients of environmental parameters with the first two axes of RDA 排序轴 温度 盐度 溶解氧浓度 铵盐浓度 1 0.967 -0.405 -0.989 -0.708 2 0.256 0.914 0.142 0.707

表 4 环境因子与前两个排序轴间的相关系数 Table 4 Correlation coefficients of environmental parameters with the first two axes of RDA

潜在硝化速率(PNR)常作为指示氨氧化微生物硝化作用的重要生理指标. 本研究中PNR与古菌amoA基因丰度、 细菌amoA基因丰度均呈负相关关系，这与Caffrey等^[13]对6个不同河口的研究及Wang等^[26]对中国4个高氮湿地沉积物的研究结果不同. 他们的研究结果显示，PNR与古菌amoA基因丰度、 细菌amoA基因丰度均呈正相关关系. 而本研究的分析结果却表明，随着amoA基因拷贝数增加，潜在硝化能力降低，这与实际环境中的生物过程并不相符. 由于基于DNA水平的检测表明的是环境中存活和死亡微生物的总丰度，因此并不能真实反映环境中微生物的催化活性，而以微生物mRNA为基础研究PNR与amoA基因拷贝数的关系及AOA、 AOB对硝化过程的相对贡献就显得尤为必要. 本研究的相关分析结果表明，PNR与活性AOB amoA拷贝数之间存在正相关关系，但相关性较低(P>0.05). 推测可能是由于样本数量过少，或者是由于PNR培养时氧气和酶作用底物浓度不受限制^[32]，与氨氧化微生物实际存活的环境条件有差异所致. 这些问题，还需要更进一步地深入研究，才能更好地揭示AOA和AOB在氨氧化过程中的贡献.

本文通过荧光定量PCR技术和潜在硝化速率分析的方法，对乳山湾邻近海域表层沉积物中好氧氨氧化微生物种群分布特征进行了研究. 结果表明，研究海域中总氨氧化细菌(AOB)丰度均高于总氨氧化古菌(AOA)丰度. 活性AOB与总AOB比值低于1%，活性AOA在3个采样站位中均未检测，表明绝大多数氨氧化微生物可能处在非活性细胞状态. 潜在硝化速率在添加氨苄青霉素后显著降低(P<0.05)，可见AOB在研究海域沉积物氨氧化过程中发挥了重要作用. 溶解氧浓度、 温度及铵盐浓度对研究海域沉积物中好氧氨氧化微生物的种群丰度起着重要的调控作用. 本研究在潜在硝化速率与发挥直接作用的好氧氨氧化微生物关键功能基因mRNA表达量之间建立了联系，有助于明确AOA和AOB对硝化作用的相对贡献.

致谢: 感谢国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心冉祥滨副研究员及刘军同学在野外采样及环境因子分析中给予的帮助.