近年来，水体富营养化问题正日益严重地威胁着人类的生存与发展^[1]. 目前，很多学者通过悬挂弹性填料或人工水草等方式，使载体表面富集大量周丛生物，达到净化不同深度水体的目的. 引入的周丛生物，不仅提高了水质净化效果，还构成了一个完整的微生态系统^{[2, 3]}.

微生物活动对水体的化学组成和化学物质的迁移等有很大的影响，而水体中存在的O₂、 NO^-₃、 Fe³⁺、 SO^2-₄等最终电子受体直接影响着微生物种群的分布和微生物活动^{[4, 5]}. 从生物地球化学角度讲，多数反应是把最终电子传递给外部最终电子受体的过程. 微生物利用这些最终电子受体，通过好氧呼吸、 脱氮、 铁还原、 硫酸盐还原和产甲烷等途径对有机污染物进行降解^[6]. 根据热力学原理，微生物利用这些最终电子受体的顺序为O₂>NO^-₃>Fe³⁺>SO^2-₄>CO₂^{[7, 8]}. 也就是说，微生物在降解有机污染物的过程中，首先利用O₂作为最终电子受体，当O₂消耗殆尽时依次利用NO^-₃、 Fe³⁺、 SO^2-₄ 和CO₂，这已在地下环境中得到初步验证^[9]. 不同电子受体和微生物的代谢活动相互作用，相互影响，最终影响水环境中的氧化还原情况，形成不同的氧化还原条带.

周丛生物定义为淹没于水体基质表面的各种微生物及其与周边的非生物物质交织在一起的集合体^[10]. 从环境化学角度看，周丛生物普遍理解为由金属氧化物(铁、 锰和铝氧化物等)、 有机质和少量矿物质组成^{[11, 12, 13]}. 周丛生物的胞外聚合物形成了整个微生物的骨架，为微生物的附着生长和包裹吸附其他物质提供了物质基础^[14]. 周丛生物对水体中营养盐的迁移转化^[15]和污染物的消纳^[16]具有重要影响，对污染物如磷有较强的富集^[17]和固持能力^[18]. 因此，周丛生物常用于低浓度污水(如地表水体)的净化和生态系统修复^[19].

本文通过水柱模拟实验对如下2个问题进行研究: 一是周丛生物作用下，不同水层水体中氧化还原条带的分布情况，二是不同水层氧化还原条带的分布与微生物特征的关联情况. 通过研究，初步阐明周丛生物与不同水层氧化还原条带的相互关系，揭示周丛生物对不同水层水质净化的机制，以期为开发高效的生态净水技术提供理论依据.

如图 1和图 2所示，培养装置由储液箱、 培养柱、 废液桶和支架这4个部分组成. 其中，储液箱(长×宽×高=30 cm×30 cm×45 cm)用于储备营养液； 培养柱(内径×外径×高=14 cm×15 cm×120 cm)为圆柱体，并在培养柱中悬挂周丛生物载体——工业弹性填料(长50 cm，半径10 cm，苏州宜兴永达环保公司)用于富集周丛生物. 培养柱一侧配有6个口径0.500 cm、 间距12 cm的水阀，用于采集不同水层水样. 废液桶为1 L的玻璃烧杯，用于收集废液. 以上3部分之间由硅胶软管相互连接.

图 1

Fig. 1

图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic design of the experimental equipment

图 2

Fig. 2

图 2 周丛生物富集载体: 工业弹性填料 Fig. 2 Periphyton substrate: industrial soft carriers (ISC)

实验初期，将工业弹性填料放入水柱装置后，添加从南京玄武湖采集的富营养水(水质指标见表 1)，使富营养水长期淹没弹性填料，每天更换一定的采集于玄武湖中的新鲜水. 培养期间COD为150~200 mg ·L^-1，pH值为7.0~9.0. 培养水柱置于温室，培养条件如下: 水体温度25℃左右，自然光照. 经过20 d的培养，填料表面出现一层亮绿色黏稠状物质，此时认为周丛生物已初步富集完成.

表 1(Table 1)

表 1 实验用水的水质指标 Table 1 Average (±S.D.) chemical parameters for water used in experiments 项目 pH TN/mg·L-1 NO-3-N/mg·L-1 NH+4-N/mg·L-1 TP/mg·L-1 TDP/mg·L-1 水 7.920±0.030 1.260±0.020 0.730±0.020 0.530±0.010 0.120±0.002 0.040±0.001

表 1 实验用水的水质指标 Table 1 Average (±S.D.) chemical parameters for water used in experiments

实验后期，按照1 L玄武湖水添加1 mL WC培养液的标准配置WC营养液，通过阀门控制流速模拟自然河道水体，动态驯化培养周丛生物. 主要过程如下: 往储液箱内注满WC营养液，打开进水阀和取样口6，控制流速，使得培养柱中玄武湖水被WC营养液缓慢地替代，至玄武湖水完全替换后关闭进水阀和取样口6，静置2 d. 打开进水阀和取样口6，控制流速(0.010 mL ·s^-1)使得培养柱中的营养液持续缓慢流动. 驯化培养过程中对培养柱取样口4以下部分轻微遮光，模拟水体自然环境. 维持动态培养一个月，培养柱中明显出现深褐色的周丛生物后，随即开展采样与监测.

采集不同水层水样用于多种指标的检测，鉴定不同水层水样的氧化还原条带. 为避免水体流动对实验的影响，水样采集由上而下依次取样. 首先打开进水阀和取样口1，关闭其他取样口，待水流流出3 s后，采集水样50 mL，采样结束迅速关闭水阀. 重复进水阀操作，采集其它水层水样.

采集不同水层对应的周丛生物样品，用于显微结构观察及Biolog实验功能多样性分析. 将填料从培养柱中取出，用消毒过的镊子轻轻将周丛生物从载体剥落，样品至于4℃冰箱内保存，以备分析测定.

主要测定指标为DO、 硫化物、 HCO^-₃、 Fe²⁺和NO^-₂. DO采用美国YSI多功能水质监测仪直接测定. 硫化物的测定采用碘量法、 NO^-₂的测定采用重氮化偶合分光光度法^[20]. HCO^-₃的测定采用传统滴定法、 Fe²⁺的测定采用邻菲啰啉分光光度法^[21].

显微结构，采用显微镜观察(Nikon,H600L).

采用Biolog生态测试板(ECO microplate，美国Matrix Technologies Corpration 生产)测定周丛生物微生物群落功能多样性，测定仪器为The Biolog EcoPlates^TM(美国，Hayward公司)^{[22, 23, 24]}.

所有实验中每组均设有3个平行. 采用Excel 2013和Origin pro 8.5对数据进行统计和绘图； 采用SPSS 16.0中的Duncan法和“Date Reduction”程序分别对数据进行差异显著性分析和主成分分析. 所有实验数据均采用平均值±标准误(mean±SD)表示，显著水平为P<0.05.

Biolog分析中平均每孔颜色变化率及多样性指数的计算方法如下.

(1)平均每孔颜色变化率(average well color development，AWCD)^[25] 计算公式为:

AWCD= Σ(C-R) /31

式中，C为测得31个反应孔的吸光值； R为对照孔的吸光值.

(2)Shannon指数(H)^[26] 可以表征微生物群落丰富度，计算公式为:

H=-Σ(P_ilnP_i)

式中，P_i为第i孔相对吸光值(C-R)与所有31孔的吸光值总和的比率.

(3)Simpson指数(D)^[26] 用于评估微生物群落优势度，计算公式为:

D=1-Σ(P_i)²

式中，P_i为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率.

(4)McIntosh指数(U)^[26] 是基于群落物种多维空间距离的多样性指数，反映微生物群落均一性，计算公式为: U=Σ(n_i)² 式中，n_i是第i孔的相对吸光值.

实际污染水环境里，存在不同种类的碳源和丰富的电子受体. 周丛生物作为一个含丰富物种的微生物聚集体，可以提供多种不同代谢途径的微生物物种，而不同代谢微生物利用电子受体是不同的. 本研究采集周丛生物反应器中不同水层的水样，检测该水层中代表性电子受体(O₂、 NO^-₃、 Fe³⁺、 CO₂、 SO^2-₄)的还原产物，观察氧化还原条带分层现象，稳定期的检测结果如图 3所示.

图 3

Fig. 3

图 3 不同水层Fe2+、 DO、 NO-2、 HCO-3和硫化物的分布及氧化还原带 Fig. 3 Distribution of Fe2+, DO, NO-2, HCO-3 and sulfide and redox zones in different water layers

从图 3可以看出DO、 NO^-₂、 Fe²⁺、 硫化物和HCO^-₃在不同位置的浓度分布规律. DO在初始阶段就开始下降，在12 cm处由初始的11.290 mg ·L^-1降至2.520 mg ·L^-1左右； NO^-₂和Fe²⁺分别是NO^-₃和Fe³⁺的还原产物，其浓度均呈先升高后降低的变化趋势，在24 cm和48 cm处分别达到峰值4.950 mg ·L^-1和38.326 mg ·L^-1； 硫化物从12 cm开始随水深的增大而逐渐增大，最大达到12.183 mg ·L^-1； HCO^-₃从12 cm开始随水深的增大而逐渐增大，到60 cm最大达到120 mg ·L^-1，在72 cm降低至110 mg ·L^-1.

根据图 3的不同最终电子受体及其还原产物的分布特点和浓度变化规律，将整个过程自上而下划分为5个氧化还原带，即氧还原带、 NO^-₃还原带、 铁还原带、 甲烷还原带和SO^2-₄还原带.

①氧还原带水深在18 cm以上的区间，DO浓度为11.290~10.630 mg ·L^-1，在该区好氧微生物利用O₂为电子受体，对污染物进行降解； ②NO^-₃还原带: 水深在16~36 cm内，NO^-₂浓度急剧升高，最高达4.920 mg ·L^-1，比其他区间最高高出29%. 在该区间周丛生物利用NO^-₃作为最终电子受体对污染物进行降解. NO^-₂作为NO^-₃的主要还原产物，其浓度的增加指示着硝酸盐还原带的出现； ③铁还原带: 水深在24~54 cm内，Fe²⁺最高浓度达到38.326 mg ·L^-1，Fe²⁺浓度的急剧增大指示着铁还原带的出现. 因此，周丛生物在这一区间主要利用Fe³⁺作为电子受体对污染物进行降解. ④产甲烷带: 水深在56~72 cm区间，HCO^-₃浓度最高达到120 mg ·L^-1. 根据这一特点将该区划分为产甲烷带. 在该区主要利用CO₂作为最终电子受体对污染物进行降解，但是与SO^2-₄还原带有一定的重合. ⑤SO^2-₄还原带: 水深在66~76 cm区间，硫化物浓度逐渐增大，最高达12.183 mg ·L^-1. 根据这一特点将该区划分为SO^2-₄还原带. 在该区主要利用硫化物作为最终电子受体对污染物进行降解，但是与产甲烷带有一定的重合，无明显的界限.

氧化还原条带的分层现象与周丛生物中存在多种电子受体紧密相关，其中主要的电子受体有O₂、 NO^-₃、 Fe³⁺、 CO₂和SO^2-₄. 不同电子受体和周丛生物的代谢活动相互作用，相互影响，最终导致水体形成5个不同的氧化还原条带.

由以上研究可知，不同水层中代表性最终还原产物具有显著差异，氧化还原能力也不同. 氧化还原条带的分布可能与不同水层周丛生物丰度及生长状况存在一定的关系.

在光学显微镜400倍下，观察不同水层的周丛生物. 由图 4可知，样品1取样于12 cm水深，由于接受充足的阳光与氧气，群落丰度较高，并且呈现以蓝绿藻为代表的光能自养型微生物群落； 样品4取样于48 cm水深，其水环境含氧量不高，好氧微生物和兼性厌氧微生物同时存在，群落丰度和生物量低于上层周丛生物. 样品6取样于60 cm水深，处于底层厌氧环境，阳光不充足，故没有观察到绿色自养微生物种类，厌氧微生物占优势但生物量较少. 由此可知，不同水层周丛生物群落丰度及生长状态因水深而存在显著性差异. 不同水层环境影响周丛生物的生长状况，通过周丛生物又反作用于水体，改变水体氧化还原条件，并形成不同的氧化还原条带.

图 4

Fig. 4

图 4 不同氧化还原条带下周丛生物的光学显微镜观察 Fig. 4 Observation of periphyton at different redox zones by optical microscopy

平均每孔颜色变化率^[25]是反应周丛生物利用不同碳源总体能力的一个重要指标. AWCD值越高，表明周丛生物对碳源的利用率也越高，活性也越大. 基于平均颜色显影变化下的原理，不同水层对应的周丛生物利用不同碳源的新陈代谢强度，如图 5所示.

图 5

Fig. 5

图 5 不同处理AWCD值变化曲线 Fig. 5 Changes in average well color development with incubation time in different treatments

结果表明，不同水层周丛生物的活性(AWCD)随着水深的增大而降低，AWCD值的变化说明不同水层中周丛生物的活性存在显著差异. 实验的24~48 h时间段内，各样品AWCD值均快速上升，48 h后，水深60 cm和72 cm样品进过短暂稳定后再次恢复上升趋势，而其他4组样品则保持上升趋势直至稳定. 达到最终稳定状态时，中层(水深36 cm、 48 cm)AWCD值相对较高、 上层(水深12 cm、 24 cm)AWCD值相对居中，而下层(水深60 cm、 72 cm)AWCD值则为最低.

实际水环境中，存在不同的最终电子受体，它们获取电子的能力不同. 周丛生物作为一个含丰富物种的微生物聚集体，巨大的比表面积为其吸附污染物质提供了附着点^{[27, 28]}.同时，周丛生物可以提供不同代谢途径的微生物，这些微生物利用水环境中的电子受体也不同. 因此在不同水深条件下，氧化还原带也不相同，周丛生物的活性也不同，表明周丛生物的代谢途径不一样，利用的电子受体不同，而不同的受体在接受电子后产生不同的还原产物.

采用96 h的吸光值计算周丛生物在不同水层的3种多样性指数，以分析其功能多样性. 由表 2可以看出，Shannon指数^[26]最大值出现于水深48 cm处，高于上层和下层，说明中层的微氧环境可能同时给好氧、 厌氧以及兼性微生物提供适宜的条件. Simposon指数^[26]与Mclntosh指数^[26]的最小值皆出现在中间水层兼性厌氧范围，进一步说明了中间水层周丛生物群落丰富度较高，但群落分布不均衡. 这3类指数从不同的侧面反映了不同水层周丛生物的功能多样性，从而通过不同的碳源代谢途径与水体的氧化还原条带相互制约与影响，揭示周丛生物的功能多样性直接影响水体的氧化还原环境.

表 2(Table 2)

表 2 96 h时的周丛生物功能多样性 Table 2 Functional diversity of periphyton at 96 h 深度/cm Shannon 指数 Simpson 指数 Mclntosh 指数 -12 2.130±0.210 0.840±0.060 2.150±0.190 -24 2.220±0.240 0.870±0.090 2.060±0.110 -36 1.330±0.070 0.530±0.040 1.590±0.820 -48 2.470±0.150 0.810±0.100 1.630±0.910 -60 1.920±0.120 0.790±0.050 1.480±0.740 -72 2.170±0.140 0.830±0.100 1.790±1.010

表 2 96 h时的周丛生物功能多样性 Table 2 Functional diversity of periphyton at 96 h

Biolog态测试板具有31种不同碳源与一个空白对照. 实验采用统计学方法取标准化后的平均值用于评估周丛生物的总体活性与功能多样性. 然而，通过分析不同水层周丛生物不同种类的碳源代谢能力异同，可以进一步揭示氧化还原条带的形成与周丛生物不同代谢途径之间的关系.

选取样品96 h的吸光值评估周丛生物对不同碳源的利用情况，如图 6所示. 结果大致表现为: 酚酸和羧酸被上层周丛生物利用较多； 多聚物和胺类被中层周丛生物利用较多； 对于碳水化合物和氨基酸类，各水层周丛生物均有所利用，但整体角度分析，其主要被底层周丛生物利用. 从微生物代谢底物的角度分析，不同水层周丛生物代谢途径及碳源利用情况存在显著差异. 这一现象的出现是由于周丛生物具有丰富的微生物群落，并且在各水群落分布不同. 通过对群落丰度的观察(图 4)证明某些优势群落的存在是造成氧化还原条带的关键因素. 正是由于优势微生物群落在不同水层的空间不均匀分布，造成各水层的微生物群落功能不同(图 5)，及其利用碳源的代谢途径也不一样(图 6)，进而使周丛生物利用不同的最终电子产物，最终形成不同的氧化还原条带.

图 6

Fig. 6

图 6 不同碳源在96 h时的代谢程度 Fig. 6 Average well color development for different C source group at 96 h

其中PC1(42.826%)能够将48 cm以下的周丛生物区分开，PC2 (15.582%)能够将36 cm以下的周丛生物区分开，说明不同水深周丛生物对碳源利用情况不一样. 12 cm处的周丛生物，分布趋向PC1轴，也与PC2有关联； 12 cm和24 cm、 36 cm和48 cm、 60 cm和72 cm处的周丛生物，所处水环境大致相似，其利用碳源相近，并分别与PC2、 PC1、 PC2强烈负相关. PC1负轴上出现了4个不同水深的样品，4个样品均处于水深48 cm上部，其利用碳源明显区别于48 cm以下的碳源. 可能是因为48 cm以上的水环境明显有别于下部厌氧遮光环境. 同时相邻两组之间的周丛生物所处水体环境相近，其利用碳源情况也类似，导致产生的氧化还原条带有一定的重合，无明显的界限. 如产甲烷带和硫酸盐还原带所处水体环境相似(遮光厌氧)，其碳源利用情况相似，并且它们有相似的氧化还原电位，故两个还原带存在一定的重合.

图 7

Fig. 7

图 7 不同水深周丛生物群落碳源利用主成分分析 Fig. 7 Principal component analysis on microbial community of periphyton at different water depths

周丛生物存在下，不同水层会形成氧化还原条带由上而下依次称为氧还原带、 NO^-₃还原带、 铁还原带、 产甲烷带和SO^2-₄还原带. 这种氧化还原条带出现分层现象的原因为: 不同水层周丛生物群落组成、 种群丰度及代谢活性的差异，导致其碳源代谢利用的最终电子产物不同，由此形成的还原产物不同，进而形成不同水层不同氧化还原环境.