工业的发展对环境和生态系统造成极大的压力，大量排放的污染物中不乏具有急性毒性的物质，当与人类或动物一次或短时间接触后，引起中毒，甚至死亡. 传统国际公认的斑马鱼、 大型蚤是用于水质急性毒性表征的标准生物^{[1, 2, 3]}，但由于前期准备过程漫长，实验操作过程繁琐限制了其广泛使用. 传统发光菌是一类在自然界中分离的能够产生化学发光现象的微生物，当细胞受急性毒物影响时，发光强度下降. Bulich等^[4]最早提出水环境毒性检测的发光细菌法，而明亮发光杆菌也已作为国家标准方法用于水质急性毒性测定^[5]. 由于发光菌大多从海洋中分离得到，适合生长的温度在20℃左右，因此实际应用中需要严格控制实验体系温度.

近年来，通过基因工程改造而构建的生物传感细胞得到许多研究人员青睐^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}. 生物传感细胞^{[12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]}具有启动基因与报道基因耦合的基因结构，当启动基因为组成型表达时，毒性物质会抑制报道基因转录和翻译，通过检测报道产物的量的减少即可表征毒性的强度. 绝大多数用于急性毒性检测的传感细胞宿主菌选用大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌^{[19, 20, 21]}，并未针对检测对象和检测环境的要求识别和选择更为敏感的微生物作为传感细胞的宿主，局限了应用范围^[22]. 不动杆菌ADP1为1株土壤中分离的微生物^{[23, 24]}，作为宿主细胞具有评价环境污染的潜力. 本研究所采用的生物传感细胞为不动杆菌ADP1_pWHlux，以不动杆菌ADP1为底盘微生物构建，其携带的质粒上具有发光基因luxCDABE，其表达受质粒复制起始点调控.

本研究主要目的为建立不动杆菌ADP1_pWHlux用于急性毒性检测方法，考察其对急性毒物的灵敏性和检测范围，并应用于北京市内清河污染河水样品的急性毒性检测，评价基于宿主细胞不动杆菌ADP1建立的生物传感细ADP1_pWHlux是否适合评价环境污染物的急性毒性，验证其在水质检测中应用的可行性，以期为环境风险评估提供重要的方法支撑与理论依据.

如无特殊说明，所有试剂均为分析纯，购自Sigma公司.

Luria-Bertani(LB)培养基(g ·L^-1)： 胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5. 培养带有抗性细胞时，采用含有200 μg ·mL^-1氨苄青霉素的LB(LB_ amp200)培养基.

ADP1_pWHlux由Dr. Wei Huang提供. 该细胞为通过向不动杆菌ADP1转化pWHlux得到的重组体. pWHlux在pWH1274^[25]质粒基础上插入发光基因片段luxCDABE构建得到.

发光检测实验所用酶标仪型号为LB 962(Berthold，USA)，与黑色底透96孔酶标板(Grenier，Germany)配合使用.

从平板培养皿挑取单菌落接种到含有LB_ amp200培养基的50 mL离心管中，于30℃，150 r ·min^-1的恒温振荡培养箱中过夜培养.

菌液在6 000 r ·min^-1条件下离心10 min，弃上清，收集菌体，用新鲜LB培养基重悬，按1 ∶10接种比例接种至新鲜LB培养基，用于急性毒性检测.

HgCl₂作为急性毒性检测的标准物质^[5]，稀释为0.000 4、 0.004、 0.04、 0.4、 1、 2、 4 mg ·L^-1质量浓度，保存于8 mL棕色瓶中.

酶标板微孔内加入菌液各100 μL，100 μL不同浓度HgCl₂再依次加入酶标板各孔，设置3个平行，无菌去离子水作为阴性对照. 酶标仪设置为每5 min读取每个微孔的化学发光强度，测量2 h.

实验选取的水中优先污染物Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Pb²⁺、 Ni²⁺、 ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-，是我国生活饮用水卫生标准^[26]中规定的指标.

称量BeCl₂、 BaCl₂、 CuCl₂、 Pb(CH₃COO)₂、 NiCl₂、 NaClO₃、 NaClO₂、 NaBrO₃，配制成母液，将母液稀释成不同质量浓度，根据ADP1_pWHlux细胞对毒性物质的响应情况，调整稀释的质量浓度梯度，考察细胞对急性毒性污染物的响应效应.

同ADP1_pWHlux对HgCl₂的测定方法，测定水中优先污染物时，酶标板微孔内加入培养、 稀释得到的菌液各150 μL，再加入污染物质各50 μL，无菌去离子水为阴性对照，设置3组平行，37℃条件下于酶标仪中测量发光强度.

在立水桥附近沿清河取3个水样，水样采集距河岸5 m. 清河采样点位置示意见图 1. Q1在立水桥东北侧一排污口，Q2在立水桥西南侧一排污口下游20 m，Q3为该排污口上游50 m. 采样时间为2014年4月初，气温约22℃.

图 1

Fig. 1

图 1 清河采样点位置示意 Fig. 1 Sampling point of Qinghe

100 μL菌液和100 μL水样混合，无菌去离子水为阴性对照，HgCl₂为阳性对照，在室温下，置于酶标仪中测量发光强度.

所有测量设置3个平行样，并计算平均值和标准偏差.

上式反映待测样品中可被生物传感细胞有效利用部分急性毒性水平. 细胞对某种物质急性毒性的检出限定义为暴露于该质量浓度污染物60 min后，细胞发光明显低于阴性对照的质量浓度(P＜0.05).

暴露于不同浓度HgCl₂时，ADP1_pWHlux发光强度随时间的变化如图 2所示. 从中可知，4 mg ·L^-1的HgCl₂迅速对细胞发光产生抑制，5 min就可使发光强度降至初始值的57.8%； 在诱导100 min时，发光强度已降为0. 该结果表明，ADP1_pWHlux可对急性毒性物质迅速做出响应. 在实验所采用的0.000 4-4 mg ·L^-1的HgCl₂质量浓度范围内，不同HgCl₂质量浓度诱导ADP1_pWHlux发光强度呈现不同变化趋势，HgCl₂质量浓度在0.000 4-0.04 mg ·L^-1之间，ADP1_pWHlux发光强度变化与阴性对照无明显不同； 当HgCl₂质量浓度高于0.4 mg ·L^-1，ADP1_pWHlux发光强度迅速降低，且随着诱导时间的增长，高质量浓度HgCl₂发光强度降低速率明显快于低质量浓度条件. 因此后续实验选用0.4-4 mg ·L^-1 HgCl₂质量浓度，可得到明显剂量效应关系. 在诱导60 min时，发光强度随诱导时间的变化区别已较为明显. 为简化检测过程，缩短检测时间，快速得到结果，可直接读取诱导60 min时的发光数据.

图 2

Fig. 2

图 2 不同质量浓度HgCl2对ADP1_pWHlux发光强度的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of HgCl2 on luminous intensity of ADP1_pWHlux

诱导时间为60 min时，不同质量浓度HgCl₂对ADP1_pWHlux发光强度抑制的剂量效应关系如图 3所示. 在0.04-4 mg ·L^-1 HgCl₂质量浓度范围内，随质量浓度升高，ADP1_pWHlux发光抑制率增加，HgCl₂质量浓度与ADP1_pWHlux发光呈现明确剂量效应关系. 显著性差异检验(P＜0.05)表明，ADP1_pWHlux对HgCl₂的检出限为0.04 mg ·L^-1.

图 3

Fig. 3

图 3 不同质量浓度HgCl2对ADP1_pWHlux发光强度抑制的剂量效应关系(诱导60 min) Fig. 3 Dose-response relationship of different concentrations of HgCl2 and ADP1_pWHlux luminous intensity inhibition (induced 60 min)

不同污染物诱导60 min后，ADP1_pWHlux发光抑制率变化见图 4. 从中可见，ADP1_pWHlux对Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Pb²⁺、 Ni²⁺、 ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-这8种物质均有不同程度响应，污染物种类及毒性物质质量浓度导致细胞发光抑制率不同程度地升高，以此可表征不同污染物急性毒性大小. ADP1_pWHlux对不同质量浓度的Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺响应明显，污染物质量浓度分别在12.5-15.625 mg ·L^-1之间、 15.625-25 mg ·L^-1之间、 50-125 mg ·L^-1之间、 50-125 mg ·L^-1之间时，诱导ADP1_pWHlux发光抑制率已达50%； 较低质量浓度的污染物毒性效应增高较为缓慢，较高质量浓度的污染物毒性效应上升明显. 污染物Pb²⁺对ADP1_pWHlux的诱导不明显，不同质量浓度Pb²⁺诱导的 发光抑制率均不足20%. 实验中，在将Pb(CH₃COO)₂溶液与菌液混合时，酶标板微孔中迅速可见乳白色沉淀，这可能是由于污染物与菌液混合过程中，大量Pb²⁺与培养基成分发生沉淀反应，Pb²⁺不能穿过细胞膜引起急性毒性. 在实验所选质量浓度范围内，ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-均能诱导ADP1_pWHlux产生发光抑制作用，但发光抑制率均不高，仅250 mg ·L^-1 ClO₂^-诱导的发光抑制率达到50%，ClO₃^-、 BrO₃^-诱导的发光抑制率在20%左右. 因此，ADP1_pWHlux能够检测出ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-污染，但在实验所选浓度范围内，ClO₃^-、 BrO₃^-质量浓度与发光抑制率无明显剂量效应关系.

图 4

Fig. 4

图 4 不同污染物诱导下ADP1_pWHlux发光抑制率 Fig. 4 ADP1_pWHlux luminous inhibition rate induced by different pollutants

对不同质量浓度污染物诱导下的发光抑制率进行显著性差异检验(P＜0.05)，ADP1_pWHlux对几种水中优先污染物的检出限与相应生活饮用水卫生标准GB 5749-1985 2009-07-23^[26]对比见表 1. ADP1_pWHlux对Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺的检测范围均在0.025-250 mg ·L^-1； 对Ni²⁺的检测范围在0.002 5-250 mg ·L^-1； 对Pb²⁺、 BrO₃^-、 ClO₂^-的检出限均在0.002 5 mg ·L^-1； 对ClO₃^-检出限为0.025 mg ·L^-1. 与我国生活饮用水卫生标准相比较，除对Be²⁺的检出限高出生活饮用水卫生标准一个数量级外，对其它几种离子检出限均低于生活饮用水标准2-3个数量级. 因此，ADP1_pWHlux生物传感细胞具有较高的检测灵敏度.

表 1 (Table 1)

表 1 ADP1_pWHlux对几种水中优先污染物的检出限与相应生活饮用水标准 Table 1 ADP1_pWHlux detection limits of several priority pollutants in water and the corresponding standards for drinking water quality 项目 Be2+ Ba2+ Cu2+ Pb2+ Ni2+ BrO3- ClO3- ClO2- 检出限/mg ·L-1 0.025 0.025 0.025 0.002 5 0.002 5 0.002 5 0.025 0.002 5 水质标准/mg ·L-1 0.002 0.7 1.0 0.01 0.02 0.01 0.7 0.7

表 1 ADP1_pWHlux对几种水中优先污染物的检出限与相应生活饮用水标准 Table 1 ADP1_pWHlux detection limits of several priority pollutants in water and the corresponding standards for drinking water quality

综上，ADP1_pWHlux生物传感细胞对污染物检测范围较为广泛，对水中优先污染物Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Pb²⁺、 Ni²⁺、 ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-均能检出，检出限低，灵敏度高. 尤其对重金属离子Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺检出效果明显，有较好的剂量效应关系. 对Pb²⁺、 ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-检测灵敏度较高，但这几种污染物与ADP1_pWHlux发光没有明显的剂量效应关系.

ADP1_pWHlux应用于现场水样检测，样品诱导的发光强度变化如图 5所示. 阴性对照为去离子水，阳性对照为由低到高质量浓度梯度的HgCl₂. ADP1_pWHlux的发光强度与HgCl₂质量浓度呈现剂量效应关系，表明ADP1_pWHlux已正常工作. 由图 5可见，3个水样的急性毒性大小为0.4 mg ·L^-1 HgCl₂＜Q3＜Q2＜Q1＜1 mg ·L^-1 HgCl₂. 这与采样点分布规律是一致的，Q1取自排污口，污染最为严重； Q2取自排污口下游，距离污染源有一定距离，加上河水的稀释作用，污染较为严重； Q3取自排污口上游，受附近排污口影响较小，污染最轻. ADP1_pWHlux检测结果表明，排污口附近清河水质急性毒性较强.

图 5

Fig. 5

图 5 ADP1_pWHlux对水样的检测(诱导60 min) Fig. 5 Result of ADP1_pWHlux detecting water samples (induced 60 min)

(1)实验室构建的ADP1_pWHlux生物传感细胞可用于急性毒性检测. 4 mg ·L^-1 HgCl₂诱导5 min可作出响应，响应时间短； 对HgCl₂的检出限为0.04 mg ·L^-1； 确定诱导60 min为仪器读值时间，简化操作，缩短检测时间.

(2)ADP1_pWHlux对我国生活饮用水标准中的Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Pb²⁺、 Ni²⁺、 ClO₃^-、 ClO₂^-、 BrO₃^-离子均可检出. 对Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺检出效果明显. 对Be²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺的检测范围均在0.025-250 mg ·L^-1； 对Ni²⁺的检测范围在0.002 5-250 mg ·L^-1； 对Pb²⁺、 BrO₃^-、 ClO₂^-的检出限均在0.0025 mg ·L^-1； 对ClO₃^-检出限为0.025 mg ·L^-1.

(3)采用ADP1_pWHlux生物传感细胞检测方法对清河河水急性毒性进行评价，生物传感细胞60 min内报道基因表达量减少，发光受到抑制，且发光抑制程度与采样点位置规律一致，说明ADP1_pWHlux对现场水样的急性毒性有较为灵敏的评价，展现了该方法在水质评价中的应用前景.

致谢： 感谢英国牛津大学黄巍副教授和中国科学院海洋研究所王允博士为本研究提供测试所用的菌株，对菌株构建所做的工作以及对前期检测条件的探究工作.