环境科学  2015, Vol. 36 Issue (10): 3839-3844   PDF    
引用本文
沈冰洁, 祝贞科, 袁红朝, 葛体达, 王久荣, 陈明利, 吴晓芙, 吴金水. 不同种植方式对亚热带红壤微生物多样性的影响[J]. 环境科学, 2015, 36(10): 3839-3844.
SHEN Bing-jie, ZHU Zhen-ke, YUAN Hong-zhao, GE Ti-da, WANG Jiu-rong, CHEN Ming-li, WU Xiao-fu, WU Jin-shui. Effects of Different Plantation Type on the Abundance and Diversity of Soil Microbes in Subtropical Red Soils[J]. Environmental Science, 2015, 36(10): 3839-3844.
不同种植方式对亚热带红壤微生物多样性的影响
沈冰洁1,2, 祝贞科2, 袁红朝2, 葛体达2, 王久荣2, 陈明利1 , 吴晓芙1, 吴金水2    
1. 中南林业科技大学环境科学与工程学院, 长沙 410004;
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125
收稿日期: 2015-04-17; 修订日期: 2015-05-26.
基金项目： 湖南省教育厅重点实验室开放基金项目(12K071);国家自然科学基金项目(41301275, 41430860);湖湘青年科技创新创业平台培养对象自选项目
作者简介：沈冰洁(1990-),女,硕士研究生,主要研究方向土壤碳氮循环,E-mail:gtd@isa.ac.cn
通讯联系人,陈明利,E-mail:chenml18@163.com
摘要：土壤微生物在推动土壤碳循环过程方面发挥着重要作用,然而种植方式的改变对土壤微生物多样性的影响机制还不十分清楚. 本研究采集湖南省盘塘县长期定位试验站红壤稻田(PR)、旱地(UC)及水旱轮作(PR)这3种不同种植方式的土壤样品,采用末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)技术和实时荧光定量(RT-PCR)技术分析了土壤细菌16S rRNA基因的多样性和丰度,研究种植方式改变对土壤微生物数量、群落结构及其多样性的影响. 结果表明, 3种种植方式的土壤细菌16S rRNA基因数量(以干土计)为2.5×109-1.5×1010 拷贝·g-1,与PR相比,UP和UC处理16S rRNA基因丰度显著下降(P＜0.05). 同时,3种种植方式下土壤细菌的优势类群为变形菌(76、90和327 bp;相对丰度 47%-53%)和绿弯菌(65 bp;相对丰度10%-12%). 冗余分析表明种植方式改变了土壤理化性质,导致土壤细菌群落结构特征的显著变化,而土壤理化性质中有机碳和全氮含量是影响土壤细菌群落结构的主要因子. 多样性指数分析(香农指数和均匀度指数)显示种植水稻的土壤细菌多样性最高,显著高于水旱轮作和旱地土壤. 可见,种植方式的改变对土壤群落组成和数量造成了深刻的影响,而水稻种植是亚热带红壤可持续利用的一种有效方式,其更有利于土壤有机质的累积,土壤肥力及微生物多样性均较高.
关键词： 土壤微生物     种植方式     16S rRNA基因     群落结构     多样性     T-RFLP    
Effects of Different Plantation Type on the Abundance and Diversity of Soil Microbes in Subtropical Red Soils
SHEN Bing-jie1,2, ZHU Zhen-ke2, YUAN Hong-zhao2, GE Ti-da2, WANG Jiu-rong2, CHEN Ming-li1 , WU Xiao-fu1, WU Jin-shui2    
1. College of Environmental Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
Abstract: Soil microbe plays an important role in carbon cycling, however, the effect of land use on soil microbe remain unclear.In present study, soil samples were collected from a long-term field experiment (Pantang Agroecosystem) in subtropical China (established in 1989), including paddy-rice (PR), upland-crop (UC), and paddy rice-upland crop rotation (PU) on soil bacterial (bacteria and Archaea) community structures.The effects of long-term different land uses were determined using terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)and quantitative PCR(RT-PCR)of the 16S rRNA gene.The abundance of soil microbial 16S rRNA genes ranged from 2.5×109-1.5×1010 copies·g-1 dry soil.Compared with the PR, UP and UC led to a significant reduction in 16S rRNA genes abundance (P＜0.05).The soil microbial communities were dominated by bacteria such as Proteobacteria (76 and 90 and 327 bp;relative abundance of 47%-53%) and Chloroflexi (65 bp;relative abundance of 10%-12%).RDA statistical analyses demonstrated that there were significant differences in the microbial community composition in PR, UC, and PU treated soils.Soil organic carbon and total nitrogen content were the most highly statistically significant factors which positively influenced the soil microbial population.Taken together, our findings prove the long-term different land uses significantly influence the microbial diversity and community structure.The rice planting is an effective way of sustainable utilization of subtropical red soil, and it is more advantageous to the accumulation of soil organic matter, soil fertility and microbial diversity.
Key words: soil microbes     plantation type     16S rRNA gene     community structure     diversity     T-RFLP    


我国红壤丘陵面积约54.11×104 km2，位于亚热带季风湿润气候区,人口稠密,水热资源丰富. 但丘陵区耕作容易发生水土流失，发展适宜的农田耕作模式对于该区农业可持续发展有着重要意义. 以前的研究多集中于不同耕作方式对土壤肥力及物理结构的影响[1, 2]，而针对不同种植方式下，土壤微生物种群差异的研究还很少. 土壤微生物是土壤重要的活体成分，是驱动土壤C、 N、 P等元素生物地球化学循环的引擎[3]，在养分运转、 有机质形成和分解、 土壤结构维持、 温室气体产生[4, 5]等方面的调节发挥着重要作用. 同时，土壤微生物数量和群落结构受多种因素的影响，如水分、 土壤质地、 植被类型、 施肥等管理制度等[6, 7, 8]. 特别是，由于种植方式的改变，作物种类和根系分泌物、 水分管理等不同，导致土壤微生物群落结构和功能发生改变，进而对微生物介导的土壤碳过程(如固定、 矿化等)产生影响[9].

土壤微生物群落其数量巨大、 种类繁多，传统分离培养的方法难以反映土壤微生物群落的结构、 多样性及其作用机制[10]. 20世纪90年代后期，随着PCR、 DNA测序、 T-RFLP和实时荧光定量PCR(Real Time PCR)等分子生物技术引入土壤微生物研究中，为生态系统微生物数量、 群落结构及其多样性的研究开辟了一个全新的研究手段，而越来越多的研究采用这项技术揭示农田土壤微生物群落多样性及丰度特点[11]. 本研究采用T-RFLP与Real-time PCR技术相结合的方法研究亚热带红壤丘陵区稻田、 水旱轮作和旱地土壤微生物群落结构及其多样性和数量，通过探讨不同种植方式下土壤细菌数量、 群落结构及其多样性的变化及其主要影响因子，以期为该地区提高土壤肥力、 合理利用土地资源提供数据支撑和科学依据.

1 材料与方法 1.1 供试土壤与采样

长期土地利用方式定位监测试验位于湖南省桃源县盘塘镇(111°28′-111°35′E，29°10′-29°38′N)，属于中亚热带北缘的红壤丘陵区，年均温16.8℃，年均降雨量1400 mm，成土母质为第四纪红土. 该长期土地利用方式定位监测试验始于1989年，开始前的主要种植方式为稻田(双季稻，耕作历史>100 a). 本研究于2010年3月，采集长期定位试验中的稻田(PR)、 水旱轮作(PU)和旱地(UC)这3种不同种植方式土壤样品. 每个大田处理平分成3个小区采样，小区面积为33.3 m2，采用5点取样法取表层0-15 cm土壤并混匀. 一部分土壤样品(约200 g)用液氮冷冻后-80℃保存，供分子生物学研究，另一部分土壤样品供常规分析，土壤样品的基本理化性状见表 1.

表 1 采样点基本情况与土壤基本理化性质1) Table 1 Basic situation of the sampling and the physiochemical properties of the soils
1.2 土壤微生物总DNA的提取

参照Porteous等[12]的方法，采用SDS-GITC-PEG法，并作适当修改. 对每个处理3个重复土壤样品分别进行DNA提取，共9个土壤样品DNA样品所提取的土壤总DNA的浓度和纯度用紫外分光光度计测定(Nanodrop,PeqLab,Germany).

1.3 T-RFLP分析

根据不同种植方式下细菌T-RFLP图谱的差异研究种植方式对土壤微生物群落结构的影响[13]. 通用细菌16S rRNA基因上游799 f[14]： 5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′，下游引物1492r[15]： 5′-GYTACCTTGTTACGACTT-3′(上海英骏生物技术有限公司合成)，其中正向引物5′端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记，扩增目标片段长度为700 bp左右. 50 μL的PCR反应体系及扩增条件见文献[15]，扩增的PCR产物用PCR纯化试剂盒(天根，中国)纯化，方法按说明进行. 纯化后的产物用HhaⅠ(TaKaRa)消化，反应体系50 μL，限制性内切酶20 U，10×buffer 5 μL，DNA 300 ng，ddH2O补水至50 μL. 37℃下酶切反应2 h，65℃下酶水浴10 min终止酶切反应. 酶切产物送至上海桑尼生物技术有限公司进行自动测序分析(Model 373A,Applied Biosystems,Weiterstadt,Germany).

T-RFLP图谱中每一个限制性片段(T-RF)作为一个OTU(operational taxonomic unit)，T-RFs片段大小±1 bp是同一个OTU，其丰度按照Lukow的方法计算[16]，相对误差不差过10%. T-RFLP图谱中限制性片段(T-RF)范围在50-550 bp，荧光值阈值超过100 RFU，在平行试验的图谱中重复再现的峰纳入统计分析，片段相对丰度超过总T-RFs丰度的10%定义为该样品微生物的优势种群. 根据图谱中OTU的数目对土壤微生物种群多样性进行分析，包括香农指数(Shannon diversity,H′)和均匀度指数(evenness index,E′). 香农指数计算公式为：

式中，P为同一种OTU的克隆数占总克隆数的比例. 以香农指数的计算结果为基础，均匀度指数的公式为：

式中,Hmax=lnS，式中，S为不同OTU的种类数[13]. 登录网站http://trflp. limnology. wisc.edu/index. jsp对T-RFs进行定性分析.

1.4 Real-Time PCR

用实时荧光定量PCR对不同种植方式土壤微生物(16S rRNA 基因)的丰度进行分析[17]. 反应体系和程序同1.3节. 已知种属的质粒DNA经紫外吸收定量法 (D260)检测浓度后，将其进行10倍梯度稀释，形成103-108 拷贝 ·μL-1，作为标准样品. 扩增反应体系及程序按(TaKaRa)试剂盒操作说明书进行两步法SYBR I荧光定量PCR扩增. 土壤微生物DNA样品需稀释20倍(约5 ng ·μL-1)后作为模板，进行定量分析，反应程序和体系反应体系同上，所有土壤样品均做3次重复. 荧光定量实时PCR分析仪： ABI 7900(Foster City,CA,USA).

1.5 统计分析与作图

所有测定结果均为3 次重复的平均值，不同种植方式下的土壤理化性质、 细菌群落组成(T-RFs)、 多样性指数、 微生物数量等数据处理和统计分析及作图采用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0. 处理间差异显著性用One-way ANOVA(单因素方差分析)检验，多重比较采用Duncan法. 利用Canoca for windows 4.5软件冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)种植方式改变下土壤理化性状对细菌群落(T-RFs)的影响，并用Canodraw软件作图.

2 结果与分析 2.1 土壤理化性质

长期不同种植方式下土壤理化性质发生了较大分异(表 1)，其中有机碳(SOC)、 总氮(TN)及微生物生物量碳(MBC)表现为稻田土壤(PR)最高，分别是旱地土壤(UC)的2.5、 2.2和4.9倍. 而DOC含量则是UC土壤最高，分别为水旱轮作(PU)和PR土壤的2.0和4.1倍； 水旱轮作土壤pH显著高于其他两种种植方式(表 1).

2.2 不同种植方式对稻田土壤微生物数量的影响

3种不同种植方式土壤16S rRNA基因拷贝数量(以干土计)为2.5×109-1.5×1010 拷贝·g-1(图 1). 其中，PR处理的土壤微生物数量最多，PU处理的土壤次之，而UC处理土壤的微生物数量最少，仅为PR处理的1/6. SPSS统计软件分析结果显示16S rRNA基因数量与土壤有机质和全氮含量有显著的正相关关系(R>0.969，P＜0.05，n=9)，其中与有机质的关系最为密切(R>0.992,P＜0.01，n=9). 3种种植方式下，稻田土壤的有机质含量最高，因此其微生物数量最多.

图 1 不同种植方式土壤微生物16S rRNA基因数量 Fig. 1 16S rDNA gene abundance quantified from the different plantation type soils
2.3 不同种植方式对微生物群落结构的影响

本研究3种不同种植方式土壤细菌16S rRNA基因扩增后的目的片段经过HhaⅠ酶切后，共检测到相对丰度>1%的T-RF 片段12条(图 2). 不同种植方式土壤中均存在4个优势T-RF 片段即T-RFs 65 bp(相对丰度10%-12%)、 76 bp(相对丰度10%-12%)、 90 bp(相对丰度20%-36%)和327 bp T-RF(相对丰度12%-28%). 其中，T-RF 65bp 和76 bp在不同种植方式土壤中均有分布且相对丰度差异不显著(P＜0.05)，而90 bp T-RF在旱地土壤中的相对丰度最高，而327 bp T-RF在稻田土壤中的相对丰度最高(图 1). 这4个限制性片段所代表的细菌类群在3种不同种植方式土壤中的总丰度均都超过50%. 利用网络在线服务(http://trflp. limnology. wisc.edu/index. jsp)查询得知，T-RFs 65 bp与Uncultured Chloroflexi bacterium (绿弯菌)、 T-RFs 76 bp和 90 bp分别与Thiorhodospira sp. (γ-变形菌)和Uncultured Methylococcales bacterium(γ-变形菌)末端片段一致，T-RF 327 bp与Uncultured Burkholderiales bacterium(β-变形菌)末端片段一致. 此外，某些相对数量较少的T-RF片段也受种植方式的影响较大，其中74 bp仅在旱地和水旱轮作处理中出现，而190、 390、 590 bp共3个T-RFs片段在稻田土壤中的丰度较高，其中T-RFs 74 bp与Bradyrhizobium sp. (α-变形菌)其他的条带对应的均是不可培养的功能未知的微生物类群.

图 2 不同种植方式下土壤微生物16S rRNA基因酶切后(HhaⅠ)各限制性片段的相对丰度 Fig. 2 Average relative abundances of microbial 16S rDNA T-RFs with endonuclease HhaⅠ from three plantation type soils

利用Canoco软件RDA分析土壤理化性状对土壤微生物的群落结构的影响(图 3)，可以看出3种不同种植方式土壤微生物群落聚集于不同的区域，且样品重复性也较好，说明不同土地种植方式对土壤微生物群落结构产生了明显影响. 土壤理化性状的改变是影响细菌群落结构的主要原因，其中有机碳和全氮含量对土壤微生物群落结构影响最为显著(P=0.002 by Monte Carlo permutation test； 图 3).

图 3 RDA分析土壤理化性状对土壤微生物的群落结构的影响 Fig. 3 RDA analyses of the T-RFLP profiles of microbial composition from the different plantation type soils
2.4 不同种植方式对微生物群落结构多样性的影响

根据末端限制性片断的数目及其相对峰高值，分别计算了3种不同种植方式的土壤细菌香农指数和均匀度指数. 其中香农指数介于2.60-3.29之间，均匀度指数分别为0.79-0.90. 在3种不同种植方式土壤中，PR处理土壤的微生物多样性指数和均匀度指数最高； 而UC处理的多样性指数和均匀度指数均最低(图 4). 而稻田和水旱轮作土壤的均匀度指数无显著差异，但是均显著大于旱地土壤(P＜0.05).

图 4 T-RFLP图谱分析不同处理土壤微生物香农指数和均匀度指数 Fig. 4 Shannon index and evenness index based on T-RFLP profiles
3 讨论

土地种植方式、 水分、 施肥等管理以及土壤环境状况对微生物数量、 活性与种群结构有着较大影响. 随着土地种植方式的不同，土壤微生物数量和种群结构及其多样性也必然会存在某种程度的差别[18, 19]. 本研究采用T-RFLP技术，利用通用引物799f-1492r分析了土壤细菌群落结构及其对不同土地利用方式的响应. 研究结果发现土壤优势细菌类群为变形菌，其次为绿弯菌，它们在3种不同种植方式土壤中普遍存在，且两者相对丰度高达60%以上. 与前人的研究结果基本一致，如Jangid等[20]分析了不同类型的耕作土壤细菌种群结构，他们发现变形细菌占统治地位，其所占比例为30.6%-43.2%. 而Ge等[21]研究了长期施肥的农耕土壤细菌多样性，他们也发现包括α-、 β-、 γ-变形细菌占细菌类群的30.5%，为优势群落. 除变形菌外，绿弯菌在农田土壤中也占有绝对优势，这些研究结果丰富了人们对土壤细菌各门类分布情况及规律的认识. 另外，土地种植方式改变对土壤微生物群落结构和多样性产生显著影响，在旱地土壤中α-变形菌和γ-变形菌的相对丰度较高，而稻田土壤中β-变形菌和甲烷菌的相对丰度较高. RDA统计分析显示，微生物群落结构的差异是外界环境条件改变综合因素共同作用的结果，而土壤有机碳和全氮对土壤微生物群落结构影响最为显著. 原稻田土壤改成水旱轮作和旱地土壤后，土壤有机质和全氮含量下降，土壤中β-变形菌大部分类群为异养或者兼性营养菌，有机底物和养分的缺失导致这部分微生物类群的生长受到抑制[22, 23]，另外，土壤有机质及矿物质颗粒共同参与土壤团聚体形成，能为土壤微生物提供良好的栖居环境，调控着土壤微生物群落的代谢功能和结构[24]，因此稻田土壤微生物多样性最高. 相反，种植方式改变后，特别是田间水分管理由原来的淹水改为旱地，微生物介导的土壤呼吸作用增加[25]，不利于土壤有机质的累积. 另外有研究表明土壤的水盐条件对土壤微生物活性有显著影响，其中水分含量与微生物活性呈正相关，盐分含量与微生物活性呈负相关[26, 27, 28]. 稻田改成旱地后土壤水分含量下降，盐分含量相对增加，抑制了土壤微生物活性，其多样性下降.

同样，土壤微生物种群数量也会随着土壤肥力以及土壤环境状况的不同而发生变化[29]. 本研究采用实时荧光定量PCR技术检测了不同种植方式下土壤微生物数量，其中稻田土壤微生物数量最多，高达1.5×1010 拷贝 ·g-1，而旱地土壤最少仅为2.5×109 拷贝 ·g-1. 这3种种植方式下的土壤微生物丰度的差异可能由于不同种植方式由于根系分泌及其脱落物的投入的不同，影响了其土壤有机质含量和肥力条件，从而影响了土壤微生物的活性和数量[30]. 相关性分析也表明土壤微生物数量与土壤有机碳和总氮显著正相关. 稻田土壤有机质含量较高，为微生物的生长和繁衍提供了丰富的碳源和能源，因此稻田土壤微生物数量高于旱地和水旱轮作土壤.

4 结论

稻田、 旱地及水旱轮作种植方式土壤中优势细菌类群为变形菌，其次为绿弯菌. 长期不同土地种植方式下土壤理化性状和肥力水平发生显著分异，并对土壤微生物数量、 群落结构及其多样性产生显著的影响. 稻田改旱地后，土壤有机质、 微生物数量和多样性均有所下降. 对于以上3种种植方式，种植水稻可能更有利于亚热带红壤有机质的累积，维持较高的微生物数量及其种群结构多样性，是亚热带红壤可持续利用的一种有效方式.

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