ANAMMOX是近年来兴起的具有较好经济效能和较高脱氮效能的生物脱氮工艺，与传统的脱氮工艺相比具有需氧量低、 运行费用低和不需外加碳源等优点，从产生至今受到了国内外研究者的广泛关注^{[1, 2, 3]}，其在垃圾渗滤液^{[4, 5]}、 蚀刻液废水^[6]、 猪场废水^{[7, 8]}、 城镇污水^[9]、 污泥消化液上清液^[10]等高氨氮废水中得到了广泛研究.

炼油、 炼焦、 石油化工等行业生产废水是一类低C/N比、 高氨氮的工业废水，用传统工艺处理成本较高且很难达标，而用ANAMMOX工艺就能够很好地解决这类问题. 但苯酚作为一种常见的有机物是该类废水中不可避免的成分，会对微生物产生抑制作用^{[11, 12, 13]}，若要用厌氧氨氧化工艺处理该类废水，需要研究苯酚对ANAMMOX菌的影响. 目前虽然有研究者在小试的条件下将ANAMMOX工艺应用于焦化废水等含苯酚废水处理^{[14, 15]}，但关于苯酚对ANAMMOX菌的影响的相关报道较少.

本文研究了不同浓度的苯酚对ANAMMOX污泥脱氮效能及污泥形态的影响并对其影响过程进行初步探究，以期为ANAMMOX工艺应用于高氨氮含酚废水提供一些借鉴.

实验运行装置采用100 mL和250 mL规格的血清瓶，螺旋盖密封. 装置运行条件： 血清瓶放在恒温气浴振荡箱中，温度为33℃恒定； 转速为125 r ·min^-1； 进水pH值为7.8-8.2，通过0.25mol ·L^-1的HCl调节控制； 进出水方式为全进全出. 反应前用高纯氮气对装置曝气30 min，将水中的溶解氧除去.

接种的污泥是实验室稳定运行4 a的具有较高活性的ANAMMOX颗粒污泥，颜色为红色，MLVSS/MLSS为0.42.

实验废水采用模拟废水，主要成分为NH₄Cl(NH₄⁺-N 100 mg ·L^-1)、 NaNO₂(NO₂^--N 130 mg ·L^-1)、 NaHCO₃ 2 000 mg ·L^-1、 KH₂PO₄ 27 mg ·L^-1、 CaCl₂ ·2H₂O 136 mg ·L^-1、 MgSO₄ ·7H₂O 200 mg ·L^-1. 微量元素浓缩液Ⅰ成分为: EDTA 5 000 mg ·L^-1，FeSO₄ 5 000 mg ·L^-1； 微量元素浓缩液Ⅱ成分为: EDTA 5 000 mg ·L^-1，ZnSO₄ ·7H₂O 430 mg ·L^-1，CoCl₂ ·6H₂O 240 mg ·L^-1，MnCl₂·4H₂O 990 mg ·L^-1，NaMoO₄ ·2H₂O 220 mg ·L^-1，NiCl₂ ·6H₂O 190 mg ·L^-1，NaSeO₄ ·10H₂O 210 mg ·L^-1，H₃BO₄ 14 mg ·L^-1. 其中微量元素Ⅰ投加量为1 mL ·L^-1，微量元素Ⅱ投加量为1.25 mL ·L^-1. 苯酚储备液浓度为50 g ·L^-1.

为使接种污泥的脱氮性能相近，提高实验准确度，将含水的ANAMMOX污泥进行泥水分离，然后将分离后的颗粒污泥等分为18份，每份约2 g，分别置于18个100 mL的血清瓶中. 32℃恒温气浴振荡器连续培养15 h之后，根据脱氮效能将18个瓶子由高到低排列，采用取平均数法，将脱氮效能最好的4个和最差的4个去掉，选用中间去除效果接近的10个(去除率差值不大于5%)，以进一步保证污泥得到等分.

对剩余的10个血清瓶进行序号标记并加入不同浓度的苯酚溶液，使其浓度分别为0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800和1 000 mg ·L^-1. 经过15 h培养反应后，测定进、 出水pH、 NH₄⁺-N、 NO₂^--N、 NO₃^--N和苯酚值，评估苯酚浓度对ANAMMOX污泥脱氮性能的影响. 以上实验重复2次.

采用相同的方法选取性状相似的污泥约2 g装于250 mL的血清瓶中进行长期影响实验. 初始运行周期设定为1 d，等脱氮效能稳定后逐步提高进水苯酚浓度,直至出现脱氮效能明显下降，当ANAMMOX污泥脱氮效能处于稳定抑制状态后，停止投加苯酚，研究其恢复情况来判断抑制的可逆性.

方法均参照文献^[16]. NH₄⁺-N:纳氏试剂分光光度法； NO₂^--N: N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法； NO₃^--N： 紫外分光光度法； pH:哈纳pH211型酸度计； 苯酚： 4-氨基安替比林直接光度法； MLSS 和MLVSS: 重量法； TN： 实验环境为无机环境，因此以NH₄⁺-N、 NO₂^--N和NO₃^--N三者之和表示TN.

保持进水NH₄⁺-N浓度100 mg ·L^-1、 NO₂^--N浓度130 mg ·L^-1左右,经过15 h反应后,结果如图 1所示，随着水中苯酚浓度的增加，出水NH₄⁺-N、 NO₂^--N浓度出现明显的变化. 不加苯酚的作为对照，其出水NH₄⁺-N、 NO₂^--N浓度分别为22.67 mg ·L^-1、 62.60 mg ·L^-1，NH₄⁺-N的去除率为78.1%，TN去除率为56.7%. 当进水苯酚浓度为100 mg ·L^-1时出水NH₄⁺-N、 NO₂^--N浓度分别为65.7 mg ·L^-1、 93.11 mg ·L^-1，NH₄⁺-N的去除率为34.3%，TN的去除率为24.8%，ANAMMOX污泥活性受到抑制. 随着苯酚浓度增加其抑制更加明显，当苯酚浓度大于600 mg ·L^-1时，ANAMMOX污泥活性受到严重抑制，出水NH₄⁺-N、 NO₂^--N浓度分别在90 mg ·L^-1、 118 mg ·L^-1左右，NH₄⁺-N、 TN的去除率分别只有6%、 10%左右. 但此时TN去除率高于NH₄⁺-N去除率，说明体系中TN的损失不仅仅由ANAMMOX反应引起的，还存在其他途径，而从图 1中可知体系中苯酚有降解，因此推测TN的损失与苯酚的降解有关，体系中可能存在着某种降解苯酚的微生物.

图 1

Fig. 1

图 1 短期内厌氧氨氧化污泥脱氮效能随苯酚浓度的变化 Fig. 1 Variation of nitrogen removal efficiency on ANAMMOX with phenol concentration in short-time

李祥等^[17]在做Cu离子对ANAMMOX的影响时把过程分为3个阶段： 活性刺激阶段、 稳定阶段和抑制阶段. 而本实验在做苯酚对ANAMMOX污泥活性影响时，随着苯酚的加入，NH₄⁺-N和NO₂^--N的去除率一直呈现下降趋势，并没有出现活性刺激阶段和稳定阶段，只有1个阶段，即抑制阶段. 分析原因可能是因为部分微量重金属是微生物维持生命活动所需的营养物质，也是酶的活化剂，少量加入时可以促进微生物生长^[18]. 彭厦等^[19]在研究铁离子对ANAMMOX反应器脱氮效能影响时表明，当进水铁离子浓度由0.04 mmol ·L^-1提高到0.06 mmol ·L^-1时，NH₄⁺-N的去除率明显升高，并达到相对稳定状态； 当进水铁离子浓度提升为0.08 mmol ·L^-1时，NH₄⁺-N的去除率进一步提高. 而铁离子也正是ANAMMOX反应所需的微量元素之一. 但本实验中所加的苯酚在工业上常用作抑菌剂，主要通过使微生物细胞内的原生质蛋白发生凝固或变性而起到杀菌作用，通常0.2%苯酚即有抑菌作用，苯酚浓度大于1%时能杀死一般细菌. 本实验所加苯酚浓度为100-1 000 mg ·L^-1(含量在0.01%-0.1%之间)，加入后不会立即杀死微生物，所以可以长期观察苯酚对微生物的影响. 郁丹等^[20]研究表明，在厌氧反应中加入100 mg ·L^-1苯酚时就对反应产生了影响，当反应器中的苯酚浓度大于400 mg ·L^-1时，苯酚已经对厌氧颗粒污泥表现出一定的毒性. 本实验中当进水苯酚含量为100 mg ·L^-1时，NH₄⁺-N和TN的去除率均低于未加苯酚的的50%，表明苯酚在短期内对ANAMMOX菌的活性产生了严重的抑制； 而当苯酚浓度大于600 mg ·L^-1时，ANAMMOX菌处于完全抑制状态. Yang等^[21]在研究苯酚和Cu离子联合对ANAMMOX污泥活性影响时表明，两者联合的毒性主要依赖于苯酚浓度，当苯酚浓度为75 mg ·L^-1时，污泥活性保留百分比只有48.7%，此时抑制率已经超过一半. 综上，苯酚对厌氧污泥存在毒性，本实验在研究苯酚对ANAMMOX污泥活性短期影响时只存在抑制阶段.

长期实验苯酚浓度采用从低浓度开始逐渐增加的方式进行，保持进水NH₄⁺-N浓度100 mg ·L^-1、 NO₂^--N浓度130 mg ·L^-1左右不变，结果如图 2所示. 反应运行初期(0-28 d)，当进水苯酚浓度由 60 mg ·L^-1 逐步升高到100 mg ·L^-1 时，ANAMMOX污泥对 NH₄⁺-N、 NO₂^--N的去除率起初有所下降，但运行稳定后又逐渐提高，基本保持在99%以上，NO₃^--N生成量呈现稳定趋势. 这与短期结果不同，说明低浓度苯酚对ANAMMOX菌有一个驯化的过程，当反应周期延长，ANAMMOX污泥逐渐适应了苯酚的环境，其抑制被减弱. 以后苯酚浓度以100 mg ·L^-1为一个梯度，每提升一个梯度，NH₄⁺-N、 TN的去除率都会出现先下降后上升的趋势. 但随着梯度的增加，抑制更加明显，稳定后的NH₄⁺-N最终去除率都会比上一个阶段低. 当苯酚浓度提升至1 000 mg ·L^-1时，NH₄⁺-N的最终去除率降低到10%以下，TN的去除率也只有27%左右，此时ANAMMOX污泥受到了严重的抑制. 然而，NO₂^--N和NO₃^--N的变化趋势与NH₄⁺-N不太一样，虽然也是先下降后升高，但当苯酚浓度大于200 mg ·L^-1时，反应稳定后出水NO₂^--N和NO₃^--N均为0 mg ·L^-1，NO₂^--N的其去除率达到了100%，生成的NO₃^--N也被完全降解. 当苯酚浓度为400 mg ·L^-1后期时，NO₂^--N的去除率始终保持在100%，产物中没有检测到NO₃^--N. Zhu等^[22]研究了厌氧反应器中苯酚和硝酸盐的同步去除情况，将苯酚作为唯一电子供体，硝酸盐作为唯一电子受体. 研究结果表明，经过110 d的驯化后，当进水苯酚和硝酸盐分别为600 mg ·L^-1和430 mg ·L^-1，HRT为20.75 h，出水苯酚和硝酸盐的去除率分别为95.5%和96.75%. 其结果表明，苯酚可以与硝酸盐发生反硝化反应，导致硝态氮的减少. 本实验中出水NO₂^--N和NO₃^--N减少正是由于苯酚的加入导致了反应体系内发生了反硝化反应导致的. 当苯酚浓度提高至1 000 mg ·L^-1时，NO₂^--N的去除率再次受到影响，其去除率降为46.5%，出水也可以检测到有NO₃^--N的生成，说明高浓度苯酚对反硝化反应也会产生影响. 在反应器运行至95 d时，将进出苯酚浓度降为0 mg ·L^-1，观察ANAMMOX污泥恢复情况. 经过18 d的恢复培养，NH₄⁺-N的去除率逐步回升至99%以上，而NO₂^--N的去除率基本稳定在64%-65%之间，此时NH₄⁺-N与NO₂^--N之间的转化关系发生了变化.长期结果说明高浓度苯酚对ANAMMOX菌产生了严重的抑制，且短期内很难恢复到原来的状态.

图 2

Fig. 2

图 2 长期实验苯酚浓度对厌氧氨氧化脱氮效能的影响 Fig. 2 Effect of nitrogen removal efficiency on ANAMMOX with phenol concentration in long-time

刚开始接种的ANAMMOX污泥，如图 3(a)所示，颜色呈红色. Strous等^[23]研究表明，氨氧化细菌细胞内含有大量血红素，当污泥颜色较红时表明ANAMMOX污泥活性很好. 随着苯酚的加入，反应到46 d后，反应器内出现絮状物，污泥体积和颜色开始发生变化，红色的污泥表层开始变为黑色絮状，如图 3(b)所示，此时苯酚对污泥产生了抑制^[14]. 随着苯酚浓度的增加，黑色絮状向内扩增，表层的絮状开始脱落，到第94 d，污泥只有核心的一点还呈现颗粒状，但颜色仍为红色，说明此时ANAMMOX污泥仍然具有活性，如图 3(c)所示. 第95 d停止投加苯酚，改为加常规的营养液，经过18 d的修复后，污泥表层的黑色絮体逐渐变为红色，污泥颜色部分恢复,如图 3(d)所示. 此时NH₄⁺-N的去除率得到恢复，但污泥量减少，部分微生物死亡，由于ANAMMOX菌时代周期较长(11 d)，所以短期恢复无法使微生物量快速增加. 整个过程中，随着NH₄⁺-N去除率的变化污泥颜色会发生变化，因此可以将污泥的颜色作为视觉上评判ANAMMOX污泥活性受抑制程度的一个依据. 然而恢复后ρ(NO₂^--N)_去除/ρ(NH₄⁺-N)_去除/ρ(NO₃^--N)_生成平均值为1 ∶0.86 ∶0.2，与氨氧化理论化学计量比为1 ∶1.32 ∶0.26有很大差别. 猜测原因可能是当苯酚存在时反硝化细菌和ANAMMOX细菌竞争NO₂^--N，从而使ANAMMOX细菌在利用较少NO₂^--N时就可以发生反应，或者有新的微生物如自养细菌生成，可以直接降解NH₄⁺-N. 但具体原因需要进一步去研究.

图 3

Fig. 3

图 3 苯酚浓度对厌氧氨氧化活性污泥形态的影响 Fig. 3 Morphology of ANAMMOX of activated sludge inhibition by phenol

长期实验结果表明，当苯酚浓度大于200 mg ·L^-1时，体系中NH₄⁺-N的去除率在下降，ANAMMOX菌的能力在减弱，而NO₂^--N的去除率不但没有下降反而升高，甚至达100%，说明反应体系中存在着可以降解NO₂^--N的反应. Toh等^[24]在用ANAMMOX工艺处理焦化废水的研究中证实了ANAMMOX体系中存在反硝化菌，而赖杨岚等^[25]研究结果进一步表明，ANAMMOX菌能与反硝化菌共存，反应器可实现ANAMMOX与反硝化的协同作用. 因此在ANAMMOX体系中加入苯酚有可能发生以苯酚为有机碳源的反硝化反应，猜测NO₂^--N的过量去除与苯酚有关. 本实验中反应体系中NO₂^--N的减少量与苯酚的降解量如图 4(a)所示，随着苯酚浓度的增加，体系中苯酚的降解量在增大，而此时NO₂^--N的去除量也相应增大，说明NO₂^--N的过量去除确实是由于苯酚导致的，且苯酚作为有机碳源参与了反应，也就是反硝化反应. 当苯酚浓度高于500 mg ·L^-1时，由于体系中基质(NO₂^--N和NO₃^--N)有限，所以苯酚的降解量处于平稳状态，此时反硝化菌的能力也达到稳定.

图 4

Fig. 4

图 4 苯酚诱发体系内反硝化反应 Fig. 4 Phenol induced denitrification reaction in the system

刘常敬等^[26] 的研究证实了此观点，他们在研究苯酚对ANAMMOX工艺耦合反硝化时发现，在ANAMMOX体系中加入苯酚可以耦合反硝化反应，当苯酚浓度为 0.2 mmol ·L^-1(18.82 mg ·L^-1)时，耦合反硝化效果最好,此时消耗的NH₄⁺-N、 NO₂^--N与生成的NO₃^--N之比为1 ∶1.52 ∶0.11，系统中NO₂^--N与NO₃^--N都相应减少. 本实验中苯酚对NH₄⁺-N、 NO₂^--N和NO₃^--N三者转化比影响见图 4(b)，当进水苯酚浓度低于100 mg ·L^-1时，反应器内ρ(NO₂^--N)_去除/ρ(NH₄⁺-N)_去除平均值为1.265，低于理论值； ρ(NO₃^--N)_生成/ρ(NH₄⁺-N)_去除平均值为0.18，低于理论值，表明此时系统中NH₄⁺-N转化处于被抑制阶段，这与Yang等^[21]研究结果相近. 而当加入苯酚浓度大于200 mg ·L^-1时，ρ(NO₂^--N)_去除/ρ(NH₄⁺-N)_去除逐步提高至1.32并持续升高，最高时达到14.66，表明系统中出现明显的反硝化反应，其所占比例在逐渐提高.

既然体系中存在反硝化反应，那么系统中TN的损失是由ANAMMOX反应造成的还是由反硝化反应造成的，或者说由二者共同造成的呢. 如果是二者共同的结果，那二者之间所占比例又如何. 以ANAMMOX理论计量比(1 ∶1.32 ∶0.26)计算ANAMMOX反应和反硝化反应对体系TN去除的贡献如图 4(c)所示. 计算说明如下.

体系进水NH₄⁺-N为100mg ·L^-1，NO₂^--N为130mg ·L^-1，反应容积V为250 mL，进水TN为：

TN=(100+130)mg ·L^-1·0.25 L

体系中NH₄⁺-N的去除是由ANAMMOX反应引起的，因此以NH₄⁺-N的去除量作为ANAMMOX菌的去除能力. 而ANAMMOX反应每当消耗1 mg NH₄⁺-N时，相应会消耗1.32 mg NO₂^--N，同时生成0.26 mg NO₃^--N. 用NH₄⁺-N去除率计算体系中NH₄⁺-N去除量：

NH₄⁺-N去除量=NH₄⁺-N去除率 ·(100 mg ·L^-1 ·0.25 L)

因此，ANAMMOX反应消耗体系中的TN为：

TN=NH₄⁺-N去除率 ·100 ·(1+1.32-0.26) mg ·L^-1 ·0.25 L

ANAMMOX反应对TN的贡献(A)则为：

A=[NH₄⁺-N去除率 ·100 ·(1+1.32-0.26) mg ·L^-1 ·0.25 L] ·[(100+130)mg ·L^-1 ·0.25 L]^-1

反硝化对TN的贡献(B)则为：

B=TN的去除率-ANAMMOX的贡献

当苯酚浓度≤300 mg ·L^-1时，ANAMMOX反应对TN去除占80%以上，反硝化反应对TN去除占比低于15%，体系内仍以ANAMMOX反应为主导，但ANAMMOX贡献率在不断降低，反硝化贡献率在不断增加； 当苯酚浓度达到400 mg ·L^-1时，二者比例达到对等，分别为37%和36%，此时反硝化细菌开始与氨氧化细菌形成竞争局面. 随后反硝化反应在体系中所占比例超过了ANAMMOX，当苯酚浓度为500 mg ·L^-1时，出水NH₄⁺-N继续升高，但NO₂^--N和NO₃^--N仍为0 mg ·L^-1，且苯酚的降解量处于平稳状态，说明反硝化菌能够利用的基质不足，导致苯酚的降解量维持在稳定阶段，此时反硝化菌能力达到稳定，ANAMMOX反应和反硝化反应对氮去除分别占18%和45%，此时ANAMMOX菌受到了严重的抑制，体系中反硝化细菌适应了苯酚环境，并且已成为优势菌种，TN的去除基本由反硝化实现，反硝化反应在体系中占据主导地位.

短期内苯酚对ANAMMOX污泥活性影响研究表明，随着苯酚浓度的增加，ANAMMOX污泥活性受到的抑制程度在逐渐增大并达到稳定，稳定时NH₄⁺-N的去除率低于10%. 由线性拟合计算得出苯酚对ANAMMOX活性污泥的有效半抑制浓度(IC₅₀)为83.6 mg ·L^-1. 此值低于了苯酚初始投加量100 mg ·L^-1，因此实验一开始设置的苯酚浓度范围过于大，计算得出的IC₅₀准确性需进行验证. 故缩短苯酚浓度范围，重新做了低范围内苯酚的短期实验. 污泥选取及方法与上一次相同，恒温气浴培养15 h. 其拟合曲线如图 5所示，通过线性拟合计算得出IC₅₀为71.57 mg ·L^-1. 因此取71.57 mg ·L^-1作为短期实验的IC₅₀.

图 5

Fig. 5

图 5 短期内厌氧氨氧化污泥脱氮效能随低浓度苯酚变化的拟合曲线 Fig. 5 Fitting curve of the changing in nitrogen removal efficiency on ANAMMOX with low phenol concentration in short-time

由图 2(b)可知，当苯酚浓度为300 mg ·L^-1时，NH₄⁺-N的去除率由99%降低至55%，与Pereira等^[27]长期实验研究结果相近. Yang等^[28]利用活性(以N/VSS计)为(12.4±3.1) mg ·(g ·h)^-1的ANAMMOX颗粒污泥研究苯酚对污泥活性影响，短期实验得到苯酚的IC₅₀为 678.2 mg ·L^-1. 这与本实验的结论有很大出入，分析原因可能有以下2点： ①Yang等的拟合方程采用非竞争性抑制曲线进行拟合，表明该抑制下苯酚不会参与反应，但本实验中苯酚在体系中参与了反应； ②污泥活性不同，Yang等ANAMMOX污泥活性比本课题组高，因此其承受抑制能力较强一些.

常规焦化废水中苯酚含量在50-2 000 mg ·L^-1之间，经过脱酚处理后可低于200 mg ·L^{-1 [29]}. 因此，采用工艺前应先测定一下废水中苯酚含量，若含量低于200 mg ·L^-1时则可直接运用ANAMMOX工艺； 或者将将ANAMMOX工艺用在脱酚后的处理工艺. 但对于高浓度含苯酚废水，可将苯酚作为反硝化反应的有机碳源，并与驯化后的厌氧污泥进行厌氧处理工艺联用.

(1) 短期结果表明，苯酚对ANAMMOX污泥具有抑制作用，随着苯酚浓度的增加，ANAMMOX脱氮效能逐渐降低. 当苯酚浓度大于600 mg ·L^-1时，TN去除率下降并稳定在10%左右，说明抑制达到稳定状态. 短期实验拟合得到苯酚对ANAMMOX半抑制有效浓度(IC₅₀)为71.57 mg ·L^-1.

(2) 长期实验表明，低浓度苯酚对ANAMMOX体系中微生物对有一个驯化的过程，当加入苯酚浓度小于100 mg ·L^-1时，NH₄⁺-N的去除率先下降，反应后都能稳定在99%以上. 当苯酚浓度大于400 mg ·L^-1时，NH₄⁺-N的去除率明显下降，ANAMMOX污泥脱氮效能受到了严重抑制.

(3) 苯酚的加入诱发了ANAMMOX体系中发生反硝化，随着苯酚浓度的增加，反硝化所占相对比例也在增大. 但高浓度苯酚(1 000 mg ·L^-1)对反硝化细菌同样具有抑制作用.

(4) 苯酚对ANAMMOX污泥抑制明显，导致部分污泥死亡，经过18 d恢复后氮素之间的转化计量式发生改变，ρ(NH₄⁺-N)_去除/ρ(NO₂^--N)_去除/ρ(NO₃^--N)_生成为1 ∶0.86 ∶0.2.