2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)作为防腐剂、 杀菌剂、 防霉剂^{[1, 2]}广泛应用于各类制造业，导致大面积土壤、 地表水、 地下水受到了氯代有机物的污染^{[3, 4, 5]}，在污水厂剩余污泥中亦有发现^[6]. 因其高毒性，持久性和致癌性，2,4,6-TCP被美国、 中国等国家列入优先控制污染物^{[7, 8]}.

多氯酚很难在好氧条件下降解，而在氧化还原电位低的厌氧环境中，在相应酶的作用下进行厌氧还原脱氯，代谢速率较高^[7]，且厌氧脱氯的原理与应用对于修复土壤或地下水更具现实意义，受到研究者的重视. 通过富集活性污泥可获得厌氧降解2,4,6-TCP的混合微生物^[9]，氯取代基被脱除后，生物毒性大大降低^{[10, 11]}，再通过好氧处理，可实现彻底矿化. 对于复杂的氯代化合物，其矿化过程具有步骤性，每步生成的产物往往越来越不容易脱氯^[17]，且脱氯菌与其他厌氧细菌形成复杂的互养关系而受到制约^{[18, 19]}，相关研究有待进一步深入. 目前已从土壤、 地下水中分离鉴定出多种氯酚降解菌^{[12, 13, 14, 15, 16]}，这些微生物以有机物作为电子供体，有机氯代物作为电子受体进行呼吸代谢作用. 其中，Dehalococcoides ethenogenes、 Dehalobacter restrictus等通过还原脱氯酶进行脱氯呼吸(chlororespiration)，另外，异化铁还原菌(dissimilatory iron reduction bacteria)的脱氯作用近年来成为研究热点^{[13, 14]}，如Gobacter、 Shewanella、 Desulfitobacterium等，这些微生物可同时进行Fe(Ⅲ)还原与脱氯呼吸. 在不同的微生物及环境条件下，厌氧脱氯转化过程受到影响，并显著影响脱氯速率. 因此深入研究2,4,6-TCP在厌氧污泥群中的代谢特性和影响因素对于实现2,4,6-TCP彻底矿化，深入还原脱氯机制具有重要的意义.

本研究通过驯化活性污泥富集2,4,6-TCP还原脱氯污泥，探索厌氧条件下驯化污泥对2,4,6-TCP还原脱氯途径、 代谢特征和影响因素，探讨相关机制，以期为加速还原脱氯的方法、 实现多氯酚的彻底矿化及实际应用提供理论基础.

研究中所采用的培养基含有以下物质： ①主要营养物质(×10^-2 g ·L^-1): KCl(0.15)，KH₂PO(1.36)，NH₄Cl(2.68)； ②微量元素(×10^-3 g ·L^-1): CoCl₂ ·6H₂O(0.024)，ZnCl₂(0.075)，H₃BO₃(0.019)，NiCl₂ ·6H₂O(0.024)，Na₂Mo₄ ·2H₂O(0.024)，FeCl₂ ·4H₂O(1.344)，MnSO₄ ·4H₂O(0.026)，MgSO₄ ·7H₂O(1.556)，CaCl₂ ·2H₂O(2.336)，CuSO₄ ·5H₂O(0.009)，AlK(SO₄)₂ ·12H₂O(3.446)； ③ 维生素(×10^-3 mg ·L^-1)^[20]: 生物素(20)，叶酸(20)，维生素B₆(100)，维生素B1(50)，维生素B₁₂(1)，对氨基苯甲酸(50)，泛酸(50)，维生素B6(100)，硫辛酸(50)； ④酵母浸膏: 0.002%. 其余物质根据实验内容另行添加.

污泥取自上海市长桥污水处理厂二沉池回流污泥，其中未测得氯酚类物质. 驯化前，将污泥淘洗3次，接种至可密封厌氧瓶内，添加1.1节所述营养物质. 添加乳酸钠(20 mmol ·L^-1)、 2,4,6-TCP(50 μmol ·L^-1)，所有物质添加完毕后定容至1 L，氮气吹脱20 min密封，置于恒温磁力搅拌器(IKA RET/RCT Basic，德国)上，内置磁力搅拌子，30℃条件培养，定期更换培养液. 培养液加入前经高纯N₂吹脱20 min，更换时以N₂保护，维护反应所需的厌氧条件. 定期检测酚类物质浓度变化，直至驯化完成.

间歇实验按照以下步骤进行： ①配制培养基: 按1.1节所述配方以去离子水配制基本营养物培养基，分装至100 mL厌氧瓶内，高纯氮气吹脱20 min密封，121℃灭菌后待用. 实验时，根据实验内容，N₂保护下分别添加各类物质： 乳酸钠(10 mmol ·L^-1或20 mmol ·L^-1)； 2,4,6-TCP、 2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)、 4-氯苯酚(4-CP)、 苯酚，添加浓度为40-80 μmol ·L^-1； 柠檬酸三铁(FeC₆H₅O₇，1、 5、 10 mmol ·L^-1)、 腐殖质模式物蒽醌-2，7-双磺酸钠(2，7-AQDS，1、 5、 10 mmol ·L^-1). 所有实验均为3组平行，结果取平均值，所有物质添加完毕后接种驯化污泥. ②污泥接种: 取出适量驯化污泥，无氧条件下淘洗，置于混匀器(GS-10)上，N₂保护条件下利用注射器抽取10 mL，接种至100 mL厌氧瓶内，以去离子无氧水定容至50 mL. ③ 置于恒温培养箱(HZQ-X160)内振荡培养，定时取样检测. ④取样: N₂保护下，利用无菌注射器抽取液体样品，利用微滤膜(0.45 μm)过滤待测. 以Agilent 1100高效液相色谱仪(波长282 nm的紫外荧光器，ZORBAXSB-C18反相色谱柱)检测液相2,4,6-TCP、 2,4-DCP、 4-CP和苯酚浓度，流动相为甲醇水溶液，体积比为甲醇 ∶水(含1%醋酸)=80 ∶20，温度为25℃，流动速率为1mL ·min^-1，检出限0.1mg ·L^-1，加标回收率>98%. 采用Cervantes等^[21]描述的方法于450 nm波长处用UNICO 1200 型分光光度计测定其还原态AH₂QDS 的吸光度. 采用ICS-1000离子色谱测定液相总Fe(Ⅱ)浓度，样品量50 μL，分离柱IonPac CS5A+CG5A，流速1.2mL ·min^-1，柱后与PAR反应(530 nm). 采用Multi N/C UV HS 型TOC仪(NDIR检测器)测定样品中的总有机碳(TOC)，样品量500 μL，检测限0.05mg ·L^-1.

蒽醌-2，7-双磺酸钠，分析纯，购于东京化成工业株式会社； 2,4,6-三氯苯酚、 2,4-二氯苯酚、 4-氯苯酚、 柠檬酸铁等其他药剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司； 高纯氮气购于上海南汇化工轻工有限公司.

驯化初期，2,4,6-TCP需30 d实现初始性降解，驯化至90 d时，2,4,6-TCP 24 h内转化率达到100%，此时认为污泥驯化完成. 9个月的实验中，100%转化2,4,6-TCP一般耗时为9-24 h. 厌氧条件下，大多数氯酚都可通过还原脱氯过程逐步脱氯，降低毒性. 已有研究显示^[22]，2,4,6-TCP厌氧脱氯的中间产物可能有2,4-DCP、 4-氯酚、 苯酚，苯酚开环转化为苯甲酸进而通过厌氧产甲烷作用生成CH₄和CO₂. 本研究中，产物经HPLC检测有2,4-DCP、 4-CP、 苯酚，有少量CH₄和CO₂产生(未做准确测定)，2,4,6-TCP降解曲线及中间产物变化见图 1. 其中，初始浓度为66 μmol ·L^-1的2,4,6-TCP 24 h内转化率为100%. 2,4-DCP浓度较低，多批次的实验中2,4-DCP浓度一般在0-4.22 μmol ·L^-1，4-CP会逐渐累积，少量转化为苯酚. 9个月多批次实验中，2,4,6-TCP始终未实现最终性降解，终产物为4-CP和少量苯酚，这与相关研究相符^{[19, 22, 23, 24, 25, 26, 27]}，TOC在这一过程中降解率较低(＜20%)，可见，单独厌氧降解可实现快速脱氯，但难以实现2,4,6-TCP及有机物的的彻底矿化. 与已有研究相比(见表 1)，驯化污泥具有快速转化2,4,6-TCP的能力，这说明通过本实验的驯化方法可富集大量厌氧脱氯细菌. 厌氧降解残留物主要包含4-CP、 苯酚和有机物，通过好氧污泥(未驯化)处理后，残留的4-CP(反应初始浓度33 μmol ·L^-1)2 h后无检出，6 h TOC去除率>90%，无酚类物质和苯系物检出. 因此，加速2,4,6-TCP的厌氧脱氯是实现其彻底矿化的关键，深入研究厌氧脱氯的影响因素和相关机制具有重要的意义.

图 1

Fig. 1

图 1 污泥厌氧/好氧降解2,4,6-三氯酚及中间产物变化 Fig. 1 Degradation of 2,4,6-TCP by anaerobic/aerobic sludge and the change of intermediate products

表 1 (Table 1)

表 1 驯化的厌氧污泥或富集培养物降解2,4,6-TCP速率及产物比较 Table 1 Degradation rate and products of 2,4,6-trichlorophenol by acclimated sludge and enrichment culture 污泥来源 反应类型 TCP初始浓度 /μmol ·L-1 电子供体/浓度 /mmol ·L-1 降解时间 (降解率) 终产物 文献 厌氧固定床 连续 90 — 100 h 4-CP [25] 富集培养物 间歇 85 乳酸/10 15 d 2,4-DCP,4-CP [23] 驯化污泥 间歇 25 蔗糖/9(g ·L-1) 12h 4-CP [22] Desulfitobacterium strains强化的膨胀床颗粒污泥 连续 250-760 COD/8(g ·L-1) 25 h(HRT) 4-CP [26] 驯化颗粒污泥 间歇 152 乳酸/10 144 h(80%) 4-CP、 苯酚 [27] 富集培养物(Clostridium -like species为主) 间歇 20 甲酸/— 15 d(77%) 4-CP [19] 驯化污泥 间歇 40-80 乳酸/20 9-24 h 4-CP、 苯酚 本研究 1) 此表所摘文献为代表性文献，并通过重新计算以统一单位； 如非特别说明，初始性降解率均为100%； 降解时间或降解速率为获得的最短时间或最高速率，“—”表示文献中未说明

表 1 驯化的厌氧污泥或富集培养物降解2,4,6-TCP速率及产物比较 Table 1 Degradation rate and products of 2,4,6-trichlorophenol by acclimated sludge and enrichment culture

根据Lffler等^[28]的理论，乳酸钠为氯代有机物提供电子，通过微生物的呼吸链传递给氯代有机物使其还原脱氯，这一过程产生的能量被微生物转化为ATP. 根据空间位阻效应理论，2,4,6-TCP先是逐个脱去邻位的氯，然后再脱去对位氯. 而本体系中，在降解初始4-CP浓度即增加，2,4-DCP一直有检出，但浓度一直很低，且未发现累积过程，推断存在2,4,6-TCP同时脱去两个邻位的氯的途经^[29]. 同时，本实验中，2,4-DCP在体系中的出现说明存在2,4,6-TCP经由2,4-DCP中间体进而脱氯生成4-CP这一途径. 上述两种途径可能同时发生，因此推测转化途径见图 2.

图 2

Fig. 2

图 2 2,4,6-三氯酚厌氧/好氧降解途径及电子数变化 Fig. 2 Possible pathway of anaerobic/aerobic degradation for 2,4,6-trichlorophenol and the change of electron number 实线箭头： 厌氧途径； 虚线箭头： 好氧途径

研究中以乳酸钠为电子供体，接种驯化污泥，分别添加2,4,6-TCP及其厌氧降解的中间产物2,4-DCP、 4-CP和苯酚及基本营养物质，于100 mL厌氧瓶内进行间歇培养实验(具体方法见1.3节)，考察各中间产物的降解特性. 结果发现，33 h驯化污泥对含邻位氯氯酚(2,4,6-TCP、 2,4-DCP，初始浓度为84.1 μmol ·L^-1、 45.3 μmol ·L^-1)的初始性降解为100%，产物主要为4-CP(图 3)； 对位氯酚(4-CP，初始浓度为45.7 μmol ·L^-1)降解率为22%，产物为少量苯酚； 而苯酚(初始浓度68.4 μmol ·L^-1)基本未降解.

图 3

Fig. 3

图 3 驯化污泥对中间代谢产物的降解 Fig. 3 Degradation of intermediate products by acclimated sludge

Mohn等^[30]发现对位氯在厌氧环境难以脱氯，4-CP分子结构的稳定性使得在酶作用下氯原子难以被亲核取代. 当邻位和对位或间位共存时，邻位优先脱氯，因为该路径具有较小的氧化还原电势. 本研究中仅添加4-CP，无竞争存在，电子供体充足，无产物抑制，说明驯化污泥的对位氯降解功能有限，具有明显的底物专一性. Li等^[23]的研究显示，一些脱氯菌的种属对含对位氯的氯酚的降解止步于4-CP. 根据不同氯取代位置，厌氧脱氯一般需要不同的菌群或催化酶. Kim等^[31]发现，降解2,4,6-TCP的Pseudomonas solanacearum TCP114和降解4-CP的Pseudomonas testosteroni CPW301不仅有严格的底物专一性，且2,4,6-TCP对4-CP降解菌产生毒性，两类细菌难以共存. 因此，本研究的驯化污泥以脱邻位氯降解菌为优势，尽管驯化过程4-CP一直存在，但未富集出降解4-CP的优势种群. 苯酚在本体系几乎不降解，分析也是上述原因. 这一结果有重要的意义，在2,4,6-TCP的厌氧降解中，4-CP和苯酚的最终性转化成为限制步骤. 因此，探明2,4,6-TCP和4-CP降解菌的生态关系、 强化微生物脱对位氯功能，是今后的研究重点.

在已分离出的厌氧脱氯菌中发现^{[13, 16, 33]}很多种属(Clostridim beijerinckii Z1-9、 Desulfuromonas chlorethenica、 Geobacter Sulfurreducens、 Klebsiella pneumoniae strain L17、 Anaeromyxobacter dehalogenans strain 2CP-C)被证实在脱氯呼吸时伴随三价铁[Fe(Ⅲ)]的还原，一些电子介体显著影响脱氯代谢^[29]. 这类微生物分布广泛，在不同的科、 属中均有发现，是生态环境中重要的微生物群体. 其功能多样，除Fe(Ⅲ)，可将电子传递给不同的电子受体(如腐殖质). 研究中采用间歇实验，以乳酸钠为电子供体，以Fe(Ⅲ)(柠檬酸三铁)和腐殖质模式物蒽醌-2，7-双磺酸钠(2，7-AQDS)作为电子介体考察二者对驯化污泥降解2,4,6-TCP的影响(具体方法见1.3节)，另分别以Fe(Ⅲ)和AQDS为唯一电子受体考察未经驯化的污泥和驯化污泥对二者的还原能力，结果如下.

由图 4可见，同对照组(未经驯化的接种污泥)相比，驯化的污泥可快速将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，这说明污泥富集了一定数量的铁还原菌. 由图 5可见，随Fe(Ⅲ)浓度的增加，2,4,6-TCP的降解速率逐渐加快，Fe(Ⅲ)浓度为1 mmol时即可明显强化2,4,6-TCP的降解，浓度为10 mmol ·L^-1时，24 h实现100%转化，与对照样相比缩短了9 h. Fe(Ⅲ)一方面可作为酶的激活剂促进代谢速率，另一方面可在一些微生物的作用下，作为呼吸链的电子受体接受降解有机物释放的电子^[32]，再将电子传递给氯酚，加速脱氯过程中的电子传递. 铁元素并未被微生物同化，这一过程发生在细胞外，因此其机制与“脱氯呼吸”不同，这种代谢方式又称”胞外呼吸”. 能够进行上述方式进行呼吸代谢的微生物称异化铁还原菌. 驯化污泥不仅可以还原脱氯，还具有还原Fe(Ⅲ)的功能，且Fe(Ⅲ)的存在强化了系统的脱氯，因此驯化污泥中应富集了异化铁还原菌的相关种属. 当含氯有机物存在时，Fe(Ⅲ)起到电子转运的功能. 而提高Fe(Ⅲ)的电子转运效率是强化还原脱氯的关键之一，因此深入研究异化铁还原菌及在污泥中的地位、 功能对强化还原脱氯有重要的意义.

图 4

Fig. 4

图 4 驯化污泥还原Fe(Ⅲ) Fig. 4 Reductive of Fe(Ⅲ) by acclimated sludge 空心图例表示相应的对照组

图 5

Fig. 5

图 5 Fe(Ⅲ)对驯化污泥降解2,4,6-三氯酚影响 Fig. 5 Effects of Fe(Ⅲ) on 2,4,6-trichlorophenol degradation by acclimated sludge

由图 6可见，乳酸钠为电子供体AQDS为唯一电子受体时，驯化污泥可快速将AQDS还原为AH₂QDS，24 h的还原率均可达到80%以上，而未经驯化的污泥AQDS还原能力有限，还原率均不到30%. 这进一步说明污泥中富集了一定数量的异化铁还原微生物，并通过胞外电子传递的方式，以乳酸钠为电子供体将电子传递给氧化态的AQDS，生成还原态的AH₂QDS. 完成电子传递的是AQDS分子内的醌基，醌基接受氢后转化为氢醌，因此这一过程又称醌呼吸，醌呼吸是异化铁还原菌代谢特性之一. 而同时添加AQDS和2,4,6-TCP时发现，AQDS明显加快了2,4,6-TCP的脱氯，24 h降解率为90.4%，而对照样为69.1%，见图 7(10 mmol ·L^-1、 5 mmol ·L^-1 2，7-AQDS对HPCL出峰有干扰，数据未列出). AQDS不仅可在厌氧环境中充当有机物矿化的电子受体，而且可在异化铁还原菌和可还原态物质(重金属、 有机污染物、 染料等)之间充当电子穿梭体，促进这些物质的还原^{[33, 34]}. 本研究进一步证明，AQDS可强化2,4,6-TCP还原脱氯，其原理可能是AQDS的介导作用加速了电子在微生物和有机氯之间的传递，目前尚无明确的结论，需进一步研究.

图 6

Fig. 6

图 6 驯化污泥还原转化AQDS Fig. 6 Reductive of AQDS by acclimated sludge

图 7

Fig. 7

图 7 AQDS对驯化污泥降解2,4,6-三氯酚影响 Fig. 7 Effects of AQDS on 2,4,6-trichlorophenol degradation by acclimated sludge

驯化污泥可在不同的条件下由不同的脱氯机制主导，其中，一些微生物通过还原脱氯酶进行脱氯呼吸作用； 异化铁还原菌在无电子介体时，进行直接脱氯作用. 当有电子介体时，则通过电子介体的介导作用，实现有机氯的还原. 电子介体为Fe(Ⅲ)时，部分微生物则同步进行异化铁还原脱氯，为AQDS时，则进行醌呼吸脱氯，其本质均为胞外呼吸电子传递的代谢作用，且脱氯作用在电子介体的作用下得到强化，其电子传递途径为： 有机物→异化铁还原菌→电子介体→有机氯，污泥的脱氯途径见图 8. 因此，深入研究微生物之间相互联系、 相互促进及介导机制等是今后亟待解决的问题.

图 8

Fig. 8

图 8 驯化污泥还原脱氯途径 Fig. 8 Pathway of reductive dechlorination by acclimated sludge

(1)厌氧条件下，以乳酸钠为电子供体，2,4,6-TCP为电子受体驯化活性污泥，可实现2,4,6-TCP快速初始性降解，9-24 h内40-80 μmol ·L^-1 TCP可100%转化，中间产物有2,4-DCP，终产物主要为4-CP及苯酚.

(2)驯化污泥以脱邻位氯降解菌为优势种群，可同时脱除2,4,6-TCP和2,4-DCP的邻位氯，单独降解4-CP和苯酚时，代谢速率慢，转化率低，具有明显的底物专一性.

(3)驯化污泥降解2,4,6-TCP残留物经好氧污泥处理可实现快速彻底矿化，好氧条件下，残留的4-CP(33 μmol ·L^-1)2 h实现100%去除.

(4)驯化污泥可将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，并具有较强的腐殖质(AQDS)还原能力，说明驯化污泥富集了异化铁还原菌.

(5)电子介体Fe(Ⅲ)和AQDS可强化2,4,6-TCP转化速率，在电子介体的介导作用下，厌氧污泥可同时进行胞外呼吸实现脱氯.