一体式脱氮装置是依据分散型生活污水面源广、 收集难等^[1,2]特点发展起来的一种污水处理新技术，该技术充分考虑空间布置，将分置的污水处理单元集约化，形成一体式反应器^[3,4]以达到处理设施低造价、 易维护、 节约用地的目的^[3,4]，从而加快分散型污水就地处理的进程. 分散型生活污水处理过程中常采用生物脱氮工艺^{[4, 5, 6, 7]}，但目前，生物脱氮处理过程中尤其在我国广大北方冬春季节，水温难以保持在适宜微生物硝化(20~30℃)、 反硝化的温度范围内(20~40℃)，生物脱氮反应器面临难启动、 脱氮效率低的困难，因此，设计一种一体式生物脱氮反应器能够在冬季低温(8~15℃)时期迅速启动、 稳定运行和高效脱氮具有实际意义.

基于上述背景，本研究开发了四区一体式反应器^[8]用于分散型污水处理，尤其适用于冬季低温环境. 该反应器将好氧生物膜区-缓冲微氧区-反硝化缺氧区-泥水分离澄清区四区共存一体，采用立式设计，利用曝气上升流、 重力作用及反应器内的水流推动力进行基质交换，污泥及硝化液无动力回流，以达到设备结构简单、 节约用地、 运行耗能低、 高效脱氮和去除有机物的目的. 启动研究在冬季(水温8~15℃)进行，采用梯度缩短水力停留时间HRT，以期减缓HRT冲击负荷对系统影响的同时刺激微生物增殖生长，进而丰富微生物种群数量并且调节微生物低活性的状态； 利用荧光原位杂交FISH(fluorescence in situ hybridization)技术对氨氧化细菌(AOB)、 亚硝酸盐氧化菌(NOB)数量进行分析^[9,10]，从分子生物学角度真实地反映出反应器内硝化细菌的数量和结构的时空变化，探索微生物菌群结构与硝化作用的内在关系，以期为最终实现冬季低温条件下四区一体式生物脱氮反应装置的快速、 高效、 稳定、 低耗能启动提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 原水水质、 接种污泥

实验用水取自北京工业大学西区教工家属楼化粪池上清液,该上清液经水泵至实验室室外无保温设施的水箱，其ρ (COD)为260.4~513.1mg ·L^-1，ρ (NH₄⁺-N) 为87.82~115.52 mg ·L^-1，ρ (TN) 为91.14~116.52 mg ·L^-1，平均C/N为3.75. 接种污泥取自某市政污水处理厂二沉池回流污泥，接种后反应器初始MLSS为2 031 mg ·L^-1. 1.2 实验装置及运行

系统如图 1所示，主要包括原水箱、 进水蠕动泵、 气泵及四区一体式生物脱氮反应器. 生物脱氮反应器由敞口的好氧生物膜区A、 过渡微氧区B、 反硝化缺氧区C、 泥水分离澄清区D四部分组成，各部分尺寸及参数如表 1所示. A区底部设有进水管及微孔曝气头，考虑到水流推动力及污水水质特点进水管设计在曝气头上部，中间悬挂两片Bio-fix填料. C区中部设置搅拌桨，搅拌速度为20~30 r ·min^-1，搅拌器在第32 d启用.

图 1

Fig. 1

1.原水箱;2.进水蠕动泵;3.进水管;4.生物脱氮反应器;5.气泵;6.玻璃转子流量计;7.输气管;8.微孔曝气头;9.亲水填料;10.搅拌机;11.搅拌桨;12.斜管;13.排泥阀门;14.出水口;A.好氧生物膜区;B.过渡微氧区;C.反硝化缺氧区;D.泥水分离澄清区 图 1 四区一体式生物脱氮系统 Fig. 1 Four-zone integrated biological nitrogen removal system

表 1(Table 1)

表 1 反应器各区尺寸参数 Table 1 Characteristics of the reactor 规格 区域 直径/mm 高度/mm 有效容积/L A 160 850 17 B 300 950 61 C 400 550 22 D 500 700 85

表 1 反应器各区尺寸参数 Table 1 Characteristics of the reactor

原水经进水蠕动泵抽吸进入A区底部，曝气产生的上升气体带动液体向上流动，流经Bio-fix填料，发生同时硝化反硝化作用，后自A区顶部溢流进入B区，在重力作用下进入C区，缺氧环境下进行反硝化脱氮，泥水混合物在水流推动作用下流向D区，在D区经斜管沉淀实现泥水分离，经过D区澄清作用后，出水. 在D区处被分离的污泥返回C区，部分C区活性污泥在搅拌器和曝气装置协同作用下进入A区，实现污泥回流. 1.3 生物填料

实验中采用的生物填料Bio-fix (BX)为亲水性丙烯酸树脂纤维，其比表面积为113.8 mm² ·mm^-3,具有高孔隙率和比表面积，能够吸附大量微生物固着生长. 此外，BX稳定的立体网络结构有利于水、 气、 泥三相在填料中自由流动，有效防止污泥堵塞结块. 1.4 系统的启动

反应器采用直接挂膜法，经7 d间歇闷曝培养后启动实验开始，当反应器对有机物、 氨氮的去除率稳定在90%、 对TN去除率50%以上持续2周后认为启动完成，历时42 d. 启动过程参数见表 2，启动阶段无污泥排放.

表 2(Table 2)

表 2 启动过程参数 Table 2 Parameters of reactor in winter start-up 项目 12-01~12-07 (phaseⅠ) 12-08~12-14 (phaseⅡ) 12-15~12-21 (phaseⅢ) 12-22~01-11 (phaseⅣ) A区 2.5±0.1 2.5±0.1 2.5±0.1 2.2±0.1 DO/mg·L -1 B区 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 C区 <0.0 <0.0 <0.0 <0.0 D区 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 T/℃ 8~15 8~15 8~15 8~15 HRT/h A区 24 12 6 4.75 反应器 55 27.5 13.8 9.2

表 2 启动过程参数 Table 2 Parameters of reactor in winter start-up

COD采用5B -3型快速测定仪，NH₄⁺-N、 NO₂^--N、 NO₃^--N、 TN、 MLSS采用标准方法测定^[11]，DO值、 温度采用WTW DO溶氧仪测定. 1.6 分子荧光原位杂交技术

FISH实验步骤及计数方法参照张岩等^[12]的方法. 实验所用寡核苷探针^[13]如表 3所示. AOB、 NOB数量各占真细菌比例按公式(1)、(2)计算：

表 3(Table 3)

表 3 FISH分析中采用的寡核苷酸探针 Table 3 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes used 探针 序列(5′-3′) 目标菌 荧光标记 甲酰胺/% EUB338 GCTGCCTCCCGAGGAT Most bacteria 5′-cy3 55 NSO190 CGATCCCTGCTTTTCTCC β-Proteobacteria AOB 5′-FITC 55 NIT3 CCTGTGCTCCATGCTAAG Nitrobacteria 5′-HEX 40

表 3 FISH分析中采用的寡核苷酸探针 Table 3 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes used

反应器在冬季低温状态下进行了启动，水温 8~15℃种泥接种于反应器经过7 d闷曝后，A区填料表面附着褐色生物膜，此时填料生物量为0.017g ·cm^-2，反应器MLSS为2 031 mg ·L^-1，表征挂膜成功进入启动阶段. 为了使微生物由启动初期的适应新环境至快速增殖以达到快速高效启动，采用了梯度缩减HRT的方式，启动过程COD去除效果如图 2所示. 初始设定A区HRT为24 h，运行一周后COD去除率由80.35%逐渐上升至86.28%，出水质量浓度由51.17 mg ·L^-1减低为46.65 mg ·L^-1，微生物在逐渐适应新环境； 第8 d缩短HRT至12 h，COD去除率上升至90%，出水质量浓度降至40 mg ·L^-1，第15 d进一步缩短HRT至6 h，COD去除率继续升高为92.37%，出水质量浓度降至30.1 mg ·L^-1； 为提高系统的去除负荷，第22 d缩短HRT至4.75 h，并连续运行3周，COD平均去除率及出水平均质量浓度分别为92.11%、 30.41 mg ·L^-1，达到《中华人民共和国污水综合排放标准》一级A标准. 此时反应器内MLSS增加至2709 mg ·L^-1，A区固着生长的生物量增加至0.037g ·cm^-2，形成一定厚度的生物膜.

图 2

Fig. 2

图 2 冬季启动过程COD浓度变化 Fig. 2 Revolution of COD concentration in winter start-up

低温启动过程NH₄⁺-N去除变化如图 3所示. 启动1~7 d NH₄⁺-N去除率波动较大，当运行一周至第14 d时去除率由78.16%升高到99.46%，呈明显的上升趋势；

15~28 d平均去除率达99.00%，说明本系统即使在冬季低温启动，氨氧化过程仍然可以较快地达到较高的水平. 但在29~32 d 氨氮去除率下降至92.11%，生物膜表面附着大量黏稠状物质，该物质可能与异养菌有关^[14]，此时A区DO为3.0 mg ·L^-1，采取开启搅拌器措施，测得A区DO降低为2.3mg ·L^-1，异养菌得到有效去除，氨氧化率迅速恢复至98.49%. 分析原因可能是由于生物膜因异养菌大量繁殖，造成O₂传递受阻，硝化细菌活性受到抑制，开启搅拌机后不仅使A区悬浮微生物浓度增加，而且增加了O₂的传递速度，促使氨氧化作用恢复至高效. 启动末期氨氮平均去除率达到99.21%，出水浓度<0.1 mg ·L^-1，优于《中华人民共和国污水综合排放标准》一级A排放标准.

图 3

Fig. 3

图 3 冬季启动过程NH4+-N浓度变化 Fig. 3 Revolution of NH4+-N concentration in winter start-up

NH₄⁺-N进水负荷与去除负荷呈明显的直线相关关系，线性相关系数R²=0.991 7，当NH₄⁺-N进水负荷达0.516kg ·(m³ ·d)^-1时，去除负荷为0.513 kg ·(m³ ·d)^-1，远大于同类型其他工艺0.1kg ·(m³ ·d)^-1左右的水平^[15]. 分析认为反应器较高的NH₄⁺-N处理能力不仅来自于悬浮污泥中的硝化菌的贡献，更与A区具有高孔隙率及比表面积、 立体网络结构的亲水性填料密切相关，硝化细菌(AOB和NOB)具有强烈的亲和依附固体介质生长的特性，A区硝化细菌可以依附生物填料生长和繁殖，不再因其世代时间较长而受制于HRT造成硝化细菌流失； 此外，正如You等^[16]发现生物膜-活性污泥复合系统中氨氧化细菌数量是单一活性污泥系统3倍，即使处于低温环境反应器内污泥负荷仍处于较低水平. 2.3 低温启动过程NO₂^--N累积变化

启动过程NO₂^--N累积变化如图 4所示. Ⅲ、 Ⅳ阶段稳定运行期间NO₂^--N质量浓度<0.5 mg ·L^-1. NO₂^--N累积发生在phaseⅠ微生物低温适应期以及phaseⅣ异养菌大量繁殖时，据相关研究发现NOB的比增殖速率μ低于AOB^[17]，处于12~14℃的NOB增殖较慢，系统容易发生NO₂^--N的累积，此外，AOB、 NOB的氧饱和系数存在差异^{[17, 18, 19]}，分别为0.2~0.4 mg ·L^-1和1.2~1.5 mg ·L^-1，低DO环境使得NOB细菌合成和启动亚硝酸盐氧化酶及电子传递体系受到严重抑制，NOB数量和活性处于较低水平，造成NO₂^--N累积. 分析认为，phaseⅠ发生的NO₂^--N的累积是可能是由于NOB繁殖速度慢于AOB造成的，这与邹海明等^[20]的研究结果具有一致性，此外，反应器内AOB、 NOB的顺次生长也可能

导致亚氮累积； phaseⅣ是由于异养菌大量繁殖造成低DO的微环境，使得NOB的活性降低所致. 当NOB在HRT梯度刺激下富集生长适应低温环境后，NO₂^--N迅速被氧化，通过运行调节后系统内的NOB在低温环境下表现出高效的亚硝酸盐氧化能力.

图 4

Fig. 4

图 4 冬季启动过程NO2--N浓度变化 Fig. 4 Revolution of NO2--N concentration in winter start-up

启动过程硝酸盐浓度变化及TN去除如图 5所示. PhaseⅠTN去除率仅为31.26%，一方面受硝化作用影响，另一方面A区生物膜反硝化作用以及C区缺氧反硝化作用均处于较弱状态； PhaseⅡ、 PhaseⅢ以及PhaseⅣ前期,随着启动时间的增加,TN平均去除率由34.00%升高至60.53%，反硝化作用显著增强，TN进水质量浓度由94.56mg ·L^-1，A、 B、 C区出水TN(主要是NO₃^--N)分别为55.73、 50.02、 37.32mg ·L^-1，由此可见，TN的大量去除不在C区缺氧区、 而主要发生在A区，A区观察到显著加厚的生物膜内部已形成良好的缺氧/厌氧环境，同时硝化反硝化效果增强，位于工艺末端的厌氧C区则因碳源不足未能充分发挥其脱氮作用. PhaseⅣ中期出现了TN去除率降低的现象，分析原因，其与A区硝化率降低有关，在PhaseⅣ后期，在开启搅拌器硝化作用恢复后，TN去除率升高至63.00%.

图 5

Fig. 5

图 5 冬季启动过程TN浓度变化 Fig. 5 Revolution of TN concentration in winter start-up

微生物脱氮效果受温度影响较大，反硝化细菌的适宜温度为20~40℃. 高景峰等^[21]发现活性污泥系统中15℃的反硝化速率仅是25℃的1/2，郑兰香等^[22]对生物膜系统的研究发现13℃时的反硝化速率是22℃的0.63倍，生物膜对温度的敏感度比活性污泥小^[23]. 本实验在冬季12月启动，实时水温为8~15℃，启动末期TN去除率达到63.00%，生物膜生物量由0.017g ·cm^-2增加至0.037g ·cm^-2，分析认为，增厚的生物膜有助于扩大膜内反硝化细生存空间和活动范围，实现膜内反硝化细菌富集生长，从而增强低温环境下反硝化作用效果. 此外，由于系统进水为低碳氮比废水，该种废水脱氮较困难，实验在无外加碳源环境下，反应器TN去除负荷为0.332kg ·(m³ ·d)^-1，高于其他^[15,24]同类型反应器，后期可通过调节进水方式合理分配碳源进而提高反应器整体脱氮效率. 2.5 低温启动过程生物膜硝化细菌数量及结构的动态变化

硝化作用是脱氮过程的重要环节. AOB、 NOB细菌作为驱动该反应的关键微生物，其在反应器中存在的数量直接影响硝化作用的强度和硝化速率^[25]. 实验利用FISH技术对种泥、 第10 d、 第40 d A区填料生物膜内硝化细菌(AOB、 NOB)及真细菌(EUB)的数量进行了研究，结果如图 6及表 4所示. 启动过程中随着运行时间的增加AOB、 NOB、 EUB数量明显增加，启动到40 d三者数量分别是种泥的5.82倍、 6.14倍、 2.23倍； 硝化细菌占总菌比例由6.12%上升至16.38%，成为生物膜的优势菌群. 分析认为，A区NH₄⁺-N浓度较高，能够为AOB、 NOB提供充足的营养物质，且设置在该区的亲水性填料为硝化细菌富集生长提供有利条件，从而使得在40 d硝化细菌数量增加并成为优势菌群.

图 6

Fig. 6

a1~a3:种泥;b1~b3:第10 d泥样;c1~c3:第40 d泥样 图 6 种泥和生物膜第10 d泥样及第40 d泥样 FISH图像 Fig. 6 FISH image of seed sludge and biofilm in the tenth day and the forty day

表 4(Table 4)

表 4 冬季启动过程硝化细菌数量变化 Table 4 Revolution of nitrobacteria in winter start-up 项目 种泥 生物膜 第10 d泥样 生物膜 第40 d泥样 N(AOB)/cell·mg -1 0.33×10 8 0.49×10 8 1.92×10 8 N(NOB )/cell·mg -1 0.21×10 8 0.23×10 8 1.29×10 8 N(EUB)/cell·mg -1 0.88×10 9 0.97×10 9 1.96×10 9 %AOB/% 3.74 5.08 9.78 %NOB/% 2.38 2.37 6.58 %(AOB+NOB)/EUB/% 6.12 7.45 16.38 AOB/NOB 1.57 2.14 1.47

表 4 冬季启动过程硝化细菌数量变化 Table 4 Revolution of nitrobacteria in winter start-up

硝化反应依靠AOB、 NOB两者的相互协作、 共同完成，二者的数量及比值结构直接关系到硝化反应的进程. 启动至第10 d AOB、 NOB数量分别是种泥的1.48倍、 1.10倍，AOB比NOB数量增幅更大，分析原因可能是由于低温条件下NOB自身增殖速率低于AOB，以及AOB较NOB具有更低的氧饱和系数^[18]，AOB可较快地适应环境进行增殖，而NOB需要一定的适应期； 当启动至第40 d，AOB、 NOB数量分别是第10 d的3.92倍、 5.61倍，可见经过40 d启动运行AOB、 NOB获得高效繁殖和富集生长，尤其是适应期较长的NOB，由低数量劣势状态转变为生物膜的优势菌群. 分析种泥、 第10 d以及第40 d的AOB/NOB值，结合图 3及图 4，可以看出，在第10 d前后，出现了NO₂^--N的积累峰，此时AOB/NOB值为2.14，与种泥及第40 d相比比值较大，说明NOB的数量远小于AOB，NOB不能及时代谢AOB的产物NO₂^--N，导致亚硝氮的累积，可以认为较少数量的NOB细菌以及较大的AOB/NOB比值是造成NO₂^--N累积的主要原因，这与Kim等^[26]研究具有一致性. 与第10 d相比，第40 d的NH₄⁺-N转化为NO₃^--N的硝化率为97.52%，出水NO₂^--N质量浓度为0.51mg ·L^-1，说明AOB产物NO₂^--N能够被足够量的NOB氧化为NO₃^--N，完成硝化进程，此时的AOB/NOB值为1.47，低于第10 d的比值2.14，接近于种泥1.57，没有NO₂^--N的累积，AOB、 NOB的数量结构获得优化，且AOB、 NOB数量分别是第10 d的3.92倍、 5.61倍，可以推断较高的硝化率与AOB、 NOB的数量及其数量结构密切相关. 实验中采用的亲水性填料，为AOB和NOB提供良好的增殖环境，即使在冬季低温下启动仍然获得了较高的硝化菌增殖速率及系统硝化率，保证了硝化出水水质，为后期反硝化作用提供充足的基质供应. 3 结论

(1)四区一体式生物脱氮反应器能够稳定高效的脱氮及去除有机物，设计合理.

(2)冬季水温8~15℃下经42 d梯度缩短HRT方法成功完成反应器启动实验. 启动末期获得稳定的COD、 NH₄⁺-N、 TN去除率，分别为92.11%、 99.21%、 61.63%.

(3)启动末期生物膜内AOB、 NOB、 EUB数量分别为1.92×10⁸、 1.29×10⁸和1.96×10⁹cell ·mg^-1，是种泥的5.82倍、 6.14倍、 2.23倍，硝化细菌占总菌量由6.12%上升至16.38%，成为生物膜的优势菌群.

(4)启动末期硝化率由初期78.49%上升至97.52%，AOB/NOB值优化至1.47，反应器内富集生长的AOB、 NOB及合适的AOB/NOB比值是确保硝化出水水质的重要保障.