近年来，由于人为和自然原因，排入湖(库)的氮、 磷等营养物质不断增加，导致中国湖(库)中的水体环境现状令人堪忧，富营养化情况愈加严重^[1]. 作为水体污染的指示生物，很多水生植物尤其是沉水植物用于水体修复已有较多的研究^[2]. 苦草(Vallisneria natans)由于其生态适应性广，具有较强的吸污能力和耐污性，常被作为主要选用品种^[3].

虽然氯霉素具有很强的副作用，但是多年来人们对其重视程度一直不高，直到最近几年才注意到其副作用和危害. 欧洲和美国等国家都已禁止在食用动物尤其是水产养殖中使用氯霉素^[4,5]，我国虽然也已禁止使用，但由于其价格低廉、 药效显著，因此氯霉素作为一种外用药和饲料添加剂仍在普遍使用，在枯季和洪季河水中氯霉素的含量范围为54~187 ng ·L^-1 和11~266 ng ·L^-1，检出率达100％^[6]. 近年来，我国出口的水果和水产品屡屡被查出含有氯霉素，这除了与氯霉素的直接使用有关外，也与氯霉素的环境污染有一定关系.

焦少俊等^[7]研究了四环素对苦草生长的影响，Moore等^[8]研究了富营养化和光照对大叶藻的联合作用，Wang等^[9]研究了不同磷浓度下对菹草的生长和生理生化指标的影响，表明了菹草新芽对磷胁迫很敏感，高浓度磷的胁迫会导致菹草的衰退. 然而，有关不同营养化水体中氮磷营养盐水平和氯霉素对苦草的联合作用的研究却鲜有报道. 水体中氮、 磷浓度影响沉水植物的生长，残留的氯霉素也会对生态系统产生一定效应，研究二者的联合作用对于保护水体中沉水植物的污染环境的生物修复以及对包括氯霉素在内的抗生素的管理等均具有重要意义.

SOD作为防御活性氧的第一道防线，主要作用是催化O₂^-·转化为H₂O₂，保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用^[10]. POD的作用是催化H₂O₂分解成H₂O和O₂，它主要位于细胞质、 细胞壁、 液泡和细胞外空间，具有消除过氧化氢和酚类、 胺类毒性的双重作用^[11]. 本研究在实验室模拟条件下，通过测定苦草叶片中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力以及丙二醛(MDA)、 可溶性蛋白、 叶绿素的含量来揭示不同营养化水平和氯霉素浓度复合水体中苦草的生理生化响应，以期为水生植物系统的保护和对抗生素的管理提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 实验材料与预培养

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)购自阿拉丁工业公司(中国)，纯度为98%； 苦草[Vallisneria natans(Lour.)Hara]，俗名面条草、 扁担草、 水韭菜等，属水鳖科(Hydrocharitaceae)苦草属(Vallisneria L.)多年生沉水植物，为我国最常见的沉水植物之一，可从水体中吸收大量营养盐. 实验所用苦草购于宿迁花卉市场，经初步鉴定后清洗干净，置于5 L的玻璃烧杯中，用不含氮、 磷的霍格兰稀释培养液预培养7 d. 1.2 实验设计

预培养结束后，选取株高10~15 cm、 生长状况良好且生物量接近的4株苦草种植在5 L的玻璃烧杯中，用经过盐酸浸泡24 h后清洗至中性的3~4 mm石英砂固定，每个烧杯中装4 L不含氮、 磷的霍格兰稀释培养液. 用NaNO₃ 和NH₄Cl 做氮源、 NaH₂PO₄做磷源，配制3种N、 P 浓度. N、 P浓度设置参照湖水富营养化标准设定，分别表示中营养化、 富营养化和超富营养化水体. 氯霉素用无水乙醇助溶，查阅文献知枯季和洪季河水中氯霉素的含量范围为54~187 ng ·L^-1 和11~266 ng ·L^-1[12]，故根据实际水体中的平均含量设置氯霉素浓度梯度为：0、 0.05、 0.1和0.2 μg ·L^-1，设计正交试验如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 不同营养水体和氯霉素浓度的正交试验 Table 1 Experiment design of different concentrations of nitrogen, phosphorus and chloramphenicol 氯霉素浓度 /μg·L-1 营养水体 中营养组 (N 0.2 mg·L-1, P 0.025 mg·L-1) 富营养组 (N 0.8 mg·L-1, P 0.1 mg·L-1) 超富营养组 (N 4.0 mg·L-1, P 0.5 mg·L-1) 0(CK) T1 T2 T3 0.05 T4 T5 T6 0.1 T7 T8 T9 0.2 T10 T11 T12 1) 表中用不同编号来表示不同营养组和不同浓度氯霉素的联合作用，如T1表示中营养组和0 μg·L-1氯霉素的联合作用，文中0 μg·L-1氯霉素组用CK表示

表 1 不同营养水体和氯霉素浓度的正交试验 Table 1 Experiment design of different concentrations of nitrogen, phosphorus and chloramphenicol

将种有苦草的烧杯置于恒温恒湿植物培养室中，光照强度3100 lx，湿度为36.4%，温度25℃±2℃，光暗时间比为12 ∶12. 每个浓度组设置2个平行，一天换一次水以保持水体中氮、 磷和氯霉素浓度相对不变，第7 d取苦草叶片用于分析. 1.3 生理生化指标测定

冲洗干净的苦草叶片用于测定可溶性蛋白、 过氧化物酶(POD)、 超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和叶绿素等生理生化指标. 其中可溶性蛋白、 POD、 SOD和MDA均用南京建成生物技术工程有限公司研制的试剂盒进行测定，用热乙醇法^[13]测定叶绿素的含量.

实验结果表示为平均数±标准误差(Mean±SD)，用SPSS 19.0统计软件和ANOVA法对各种数据进行显著性差异分析，当P＜0.05时表示具有显著性差异，P>0.05时表示不具有显著性差异. 2 结果与分析 2.1 苦草可溶性蛋白含量的变化

图 1表示的是苦草可溶性蛋白含量的变化. 从中可见，同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草可溶性蛋白含量的影响不同，随氯霉素浓度的增加，中营养组中可溶性蛋白含量先上升后下降，上升趋势显著； 富营养组中可溶性蛋白含量呈上升趋势且变化显著(P＜0.05)； 超富营养组中，随氯霉素浓度的增加可溶性蛋白含量先下降后上升，变化较显著.

图 1

Fig. 1

图 1 苦草可溶性蛋白含量的变化 Fig. 1 Changes of soluble protein content of V. natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草可溶性蛋白的影响，在低氯霉素浓度(CK和0.05 μg ·L^-1)时，随营养程度增加，可溶性蛋白含量先下降后上升，CK组中可溶性蛋白含量变化较显著，0.05 μg ·L^-1组中可溶性蛋白含量变化不显著； 高氯霉素浓度(0.1 μg ·L^-1和0.2 μg ·L^-1)时，随营养程度增加，可溶性蛋白含量先上升后下降，0.1 μg ·L^-1组中可溶性蛋白含量变化不显著，而0.2 μg ·L^-1组中可溶性蛋白含量变化显著. 对比不同氮磷的影响和不同氮磷与不同氯霉素的联合作用，发现富营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用对苦草可溶性蛋白含量影响最显著，其浓度为同一营养组中CK组的2.38倍.

不同填充色的条形柱表示不同的氯霉素浓度组，字母区分显著性差异，其中，相同字母表示不具有显著性差异(P＜0.05)，而不同字母则表示有显著性差异(P＜0.05)，下同 2.2 苦草POD活力的变化

图 2表示的是苦草POD活力的变化. 从中可见，同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草POD活力的影响不同，其中，中营养组中，氯霉素浓度为0.05 μg ·L^-1时POD活力受到抑制； 富营养组中，随氯霉素浓度增加，POD活力显著性下降； 超富营养组中，随氯霉素浓度增加，POD活力呈现先增大后减小的显著变化.

图 2

Fig. 2

图 2 苦草POD活力的变化 Fig. 2 Changes ofPOD of V. natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草POD活力的影响，随富营养程度增加，CK组中POD活力先增大后减小且变化极显著(P＜0.01)； 0.05 μg ·L^-1组中POD活力无明显变化； 0.1 μg ·L^-1组中POD活力先减小后增大且变化显著； 0.2 μg ·L^-1组中POD活力显著性减小.

这表明不同营养化水体中氮磷和氯霉素的联合作用对苦草中POD活力影响显著，对比不同氮磷的影响和氮磷与氯霉素的联合作用，发现富营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用对苦草POD活力有极显著抑制，其活力降为同一营养组中CK组的33.84%. 2.3 苦草SOD活力的变化

图 3表示的是苦草SOD活力的变化. 从中可见，同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草SOD活力的影响，都是随氯霉素浓度增加，SOD活力均呈减小趋势. 其中，中营养组中，从0.1 μg ·L^-1组到0.2 μg ·L^-1组减小极显著(P＜0.01)； 富营养组中，从CK组到0.05 μg ·L^-1组变化极显著； 超富营养组中SOD活力变化不显著.

图 3

Fig. 3

图 3 苦草SOD活力的变化 Fig. 3 Changes ofSOD of V. natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草SOD活力的影响，CK组中随营养程度增大，SOD活力先上升后下降但变化不显著； 0.05 μg ·L^-1组和0.1 μg ·L^-1组中SOD活力随营养程度增大，SOD活力先减小后增大，其中，0.05 μg ·L^-1组变化显著而0.1μg ·L^-1组无显著变化； 0.2 μg ·L^-1组中SOD活力持续增大且显著变化.

这表明不同营养程度氮磷对苦草的单独作用不显著，然而氮磷和氯霉素的联合作用显著，且随着二者浓度同时增大，联合作用的影响减小，中营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用对苦草SOD的抑制作用最大，其活力为同一营养组中CK组的28.59%. 2.4 苦草MDA含量的变化

图 4表示的是苦草MDA含量的变化. 从中可见，同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草MDA含量的影响不同，随氯霉素浓度增加，中营养组和超富营养组中MDA的含量都是先减少后增多，且都是从0.1 μg ·L^-1组到0.2 μg ·L^-1组显著性增大，但是减小趋势不显著； 富营养组中MDA含量则是先增多后减少，呈显著性变化.

图 4

Fig. 4

图 4 苦草MDA含量的变化 Fig. 4 Changes of MDA of V.natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草MDA含量的影响，CK组和0.2 μg ·L^-1组中MDA含量均是先减少后增多，但是CK组变化不显著而0.2 μg ·L^-1组变化显著； 0.05 μg ·L^-1组和0.1 μg ·L^-1组中MDA含量都是先增多后减少，0.05μg ·L^-1组增大趋势不显著而减少趋势显著，而0.1 μg ·L^-1则增多趋势显著而减少趋势不显著.

和SOD活力影响相似，单独的氮磷浓度对苦草MDA含量影响不显著，但是联合作用对苦草MDA含量影响显著. 2.5 苦草叶绿素含量的变化

图 5表示的是苦草叶绿素a含量的变化. 根据图 5可看出叶绿素a(Chla)含量的变化情况：同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草Chla含量的影响不同，随氯霉素浓度增加，中营养组中Chla含量先增大后减小且变化极显著(P＜0.01)； 富营养组中Chla含量先减小后增大且变化极显著； 超富营养组中呈增加趋势且变化显著.

图 5

Fig. 5

图 5 苦草叶绿素a含量的变化 Fig. 5 Changes of Chla of V.natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草Chla含量的影响，CK组和0.2 μg ·L^-1组都是先增大后减小且变化显著，而0.05 μg ·L^-1组中Chla含量持续减小且变化显著，0.1 μg ·L^-1组中Chla含量则是先减小后增大且变化显著.

图 6表示的是苦草叶绿素b含量的变化，其反映了叶绿素b(Chlb)含量的变化趋势和Chla含量的变化趋势一样，但是其变化程度较Chla大.

图 6

Fig. 6

图 6 苦草叶绿素b含量的变化 Fig. 6 Changes of Chlb of V.natans

图 7表示的是苦草类胡萝卜素含量的变化，其表明了类胡萝卜素(car)含量的变化情况：同一营养组中不同氯霉素浓度对苦草car含量的影响不同，随氯霉素浓度增加，3个营养组中car含量的变化趋势都是先增大后减小，其中中营养组和超富营养组中car含量的变化趋势显著，富营养组中car含量的增大趋势不显著而减小趋势显著.

图 7

Fig. 7

图 7 苦草类胡萝卜素含量的变化 Fig. 7 Changes of carotenoid of V.natans

同一氯霉素浓度不同营养程度对苦草car含量的影响，CK组和0.2 μg ·L^-1组中car的含量都是先 增大后减小，增大趋势显著但减小趋势不显著；0.05 μg ·L^-1组中car含量持续增加且趋势较显著，0.1 μg ·L^-1组中car含量持续减少且变化极显著. 2.6 交互作用分析

交互作用影响是指多个变量不同水平相互搭配后对观测变量产生的影响，例如：当变量A从水平A₁变为A₂，观测变量值在控制变量B的B₁水平上增加了，而在B₂水平上却减少了，与控制变量B取B₁或取B₂有关，同理变量B变化时观测变量值与控制变量A的取值有关，则表示两控制变量有交互作用，否则，不具有交互作用^[14].

根据这一原理，利用SPSS 19.0对上述指标进行了交互作用分析，P值结果如表 2所示，其中P>0.05表示不具有显著性交互作用，P＜0.05表示具有显著性交互作用.

表 2(Table 2)

表 2 不同指标的交互作用 Table 2 Interaction effect of different parameters 项目 可溶性蛋白 POD SOD MDA Chla Chlb car P值 0.03 0.07 0.01 0.01 0.01 0.02 0.01

表 2 不同指标的交互作用 Table 2 Interaction effect of different parameters

从表 2中可以看出，除了POD之外，其他指标均有显著性交互作用，也就是说，不同氮磷和氯霉素浓度对除了POD以外的其他指标的联合作用很显著. 3 讨论

机体内产生的氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物从而损伤细胞. 过量的活性氧可能导致代谢紊乱，包括光合作用效率下降、 蛋白质和糖含量减少，从而引起植物生物量的减少甚至死亡，植物叶片中的可溶性蛋白大多是参与各种代谢的酶类，因此可溶性蛋白的含量被广泛用作衡量叶片衰亡的指标^[15]. 同一氯霉素浓度不同营养程度，在低氯霉素浓度(CK和0.05 μg ·L^-1)时，随营养程度增加，可溶性蛋白含量先下降后上升，说明酶活性的提高可能源于酶原的加工、 激活，而不是存在于翻译与转录等基础上^[16].

植物体中含有大量过氧化物酶体，是活性较高的一种酶，它与呼吸作用、 光合作用及生长素的氧化等都有关系^[11]. Sanderson等^[17]采用QSARs和现有的水生生态毒理学实验数据，对226种抗生素的生态危害性进行了评价，结果表明：预测有1/5的抗生素对藻类非常毒. Dayton等^[18]的研究表明氯霉素会抑制细胞生长以及SOD的相关物质的合成，Liu等^[19]的研究表明芦苇草叶片中的SOD活力随抗生素浓度增大而下降，这与本研究中SOD活力随氯霉素浓度增大而减小的现象相吻合. 而抗氧化酶活性的变化与污染物的浓度具有相关性，在其耐受限度内，随污染物浓度增加，SOD和POD活力增加，但超过了其耐性阈值，则会抑制应激反应，导致POD和SOD活力下降^[20]，这解释了本研究中出现POD活力先增大后减小的现象. 对于SOD活力的影响，不同营养程度氮磷对苦草的单独作用不显著，然而氮磷和氯霉素的联合作用显著，且随着二者浓度同时增大，联合作用的影响减小，这可能是氯霉素和氮磷之间存在着拮抗作用，从交互作用分析中也可以做出该推论. 开始时苦草受到氯霉素的抑制作用导致体内SOD活力先下降，后来由于拮抗作用，氯霉素的抑制作用减小，SOD活力出现了上升的现象.

MDA 是多不饱和脂肪酸氧化的二级终产物，并已用于表征脂质过氧化的程度. 测定MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度，MDA的测定常和SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度^{[21, 22]}. 本研究中单独的氮磷浓度对苦草MDA含量影响不显著，但是联合作用对苦草MDA含量影响普遍较显著，证明联合作用下，苦草细胞受自由基攻击较严重.

植物叶片的叶绿素是与其光合能力相关的重要生理指标，叶绿素a和b是吸收和传递光能的主要色素^{[21, 22]}. 研究结果显示，Chlb比Chla敏感，而car最不敏感，这和Brain等^[23]的研究一致，表明了尽管叶绿素没有细胞生长指标敏感，但是叶绿素是除了细胞分裂外能很好地补充说明细胞受到的损害的指标. 宋玉芝等^[3]的研究表明氮、 磷营养盐浓度与光合体系具有相关性，随着氮磷浓度增大，苦草叶绿素含量先增大，到一定浓度后，氮、 磷浓度的增加使叶绿素含量减少，这和本研究的结果相一致，证明了超富营养程度水体中氮磷浓度已对叶绿素含量产生了抑制. 同时，氮磷和氯霉素的联合作用对叶绿素含量也有显著性影响，表明了联合作用下对细胞也有显著性影响.

多种毒物共存时联合毒性的作用机制是非常复杂的，受多种因素的影响，除了污染物的理化性质外，污染物的浓度起了至关重要的作用. 污染物与污染物之间、 污染物与生物体内各种组分之间都有可能发生不同的交互作用，导致不同的生态毒理效应^{[24, 25]}. 综合分析实验结果，适宜的氮、 磷营养盐浓度有利于提高苦草的抗逆性，更有利于苦草的生长，过高或过低的氮、 磷营养盐浓度不利于苦草长期健康的生长. 其中，富营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用下，苦草可溶性蛋白含量的增加为同一营养组中CK组的2.38倍，POD活力降为同一营养组中CK组的33.84%，反映了在该浓度下的联合作用对可溶性蛋白含量和POD活力影响最显著； 而中营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用对苦草SOD的抑制作用最大，其活力为同一营养组中CK组的28.59%，证明了在高浓度氯霉素的存在下对苦草生理影响显著. 随氯霉素浓度增加，中营养组、 富营养组、 超富营养组中除SOD活力的变化趋势一致外，其他的生理生化指标的变化趋势都不尽相同，这表明不同浓度的氮磷和氯霉素浓度对苦草的联合作用可能存在差异，两者之间存在的复合作用可能因浓度不同而有所变化. 对比不同氮磷的影响和氮磷与氯霉素的联合作用，不同营养化水体中氮磷和氯霉素对苦草的联合作用都较单独的氮磷影响显著，说明水体中氯霉素的存在会增强富营养水体对苦草的不利影响. 然而，超富营养组和0.1 μg ·L^-1氯霉素的联合作用相比而言不显著，这可能是超富营养组中氮磷浓度和0.1 μg ·L^-1氯霉素产生了一定程度的拮抗作用，从而导致影响不显著，这还需要进一步的研究进行验证.

本研究只是在实验室条件下模拟自然水体中氮磷和氯霉素的联合作用，还需要野外实验的验证. 水体中抗生素的残留不仅对微生物有影响，而且对水生植物也存在着潜在的风险，这是需要重视的一个问题. 4 结论

(1)在富营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用下，苦草可溶性蛋白含量显著增加，其浓度为同一营养组中CK组的2.38倍； 而在富营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用下对苦草POD活力有极显著抑制，其活力降为同一营养组中CK组的33.84%.

(2)对于SOD活力和MDA含量而言，不同营养程度氮磷对苦草的单独作用不显著，然而氮磷和氯霉素的联合作用显著. 随着二者浓度同时增大，联合作用对SOD活力的影响减小，中营养组和0.2 μg ·L^-1氯霉素的联合作用对苦草SOD的抑制作用最大，其活力为同一营养组中CK组的28.59%.

(3)超富营养程度水体中氮磷浓度已对叶绿素含量产生了抑制，且氮磷和氯霉素的联合作用对叶绿素含量也有显著性影响.