近年来，随着工农业的发展，以各种形式存在的天然有机物及某些人工合成的有机污染物排放与日俱增. 它们作为农药和医药的重要原料和中间体，在生产中应用广泛，并以未经适当处理的废水、 垃圾废气和废渣等多种形式进入环境造成污染. 1,2,4-三氯苯(1,2,4-trichlorobenzene，1,2,4-TCB)是典型持久性有机污染物，脂溶性高且不易降解，主要用于纺织及电化学工业^[1]，对眼睛有一定刺激作用，长时间、 高浓度接触会引起神经衰弱、 慢性肝肾毒性等，并具有潜在的“三致”作用^{[2, 3]}. 硝基苯(nitrobenzene)作为芳烃类化合物，是制造炸药、 杀虫剂、 燃料及药物等的重要原料，在生产和消费过程中必然有部分进入水环境中，不仅会引起水质感官性状的严重恶化，且对水生生物具有一定毒性，并进一步对人类健康造成直接或间接危害^[4]. 毒死蜱(chlopyrifos)是硫代磷酸酯类常用杀虫剂，具有触杀、 胃毒和熏蒸作用，可用于防治多种害虫，但同时也会对农田环境及有益生物产生影响. 毒死蜱对蚯蚓和土壤微生物的毒性较低，但对鸟类、 鱼类、 蛙类等均属高等毒性^[5]. 研究上述污染物的生态毒性，对于制定相关安全阈值、 水生生态环境的风险评估以及突发事件的处理具有重要意义.

霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)隶属于环节动物门(Annelida)、 水丝蚓属(Limnodrilus)，广泛存在于河流、 湖泊，对环境适应能力较强，是淡水水生食物链的重要一环，是我国河流中重要的底栖动物和淡水生态系统的优势种，对水生生物生态系统物质循环有较大影响，已作为指示生物应用于水体污染研究，也是鱼虾的天然饵料^{[6, 7]}. 嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) 隶属于原生动物门(Protozoa)、 四膜虫属(Tetrahymena)，是一种淡水中常见的单细胞真核原生动物,不仅生长周期短，而且对很多毒物的反应比其他高等生物更敏感、 直接，已成为环境和药学领域毒性研究的理想材料,并被用来进行水质监测^[8]. 目前四膜虫的急性毒性研究主要针对部分纳米材料^{[9, 10]}、 重金属^[11]以及有机污染物^{[12, 13]}. 两者均为我国常见淡水生物，是水体生物监测的重要指示动物.

本研究以霍甫水丝蚓和嗜热四膜虫这两种本土水生物种作为受试生物，通过急性毒性实验探讨上述3种典型有机污染物的毒性效应，补充1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱的基础毒性数据，并进行安全评价，以期为制定相关安全阈值、 开展水生态风险评估提供科学根据，为我国水质基准研究提供一定参考. 1 材料与方法 1.1 实验材料

霍甫水丝蚓(L. hoffmeisteri)购自济南鱼虫花鸟市场，在 15~25℃条件下，培养于(60×25×20)cm³的流水式鱼缸中，鱼缸底部铺5 cm左右底泥，加入一定量的曝气水，实验前于(25±2)℃条件下培养1周以上. 挑选 2.0~3.0 cm 健康活泼幼体，放入装有曝气水的直径 90 mm、 高 45 mm 结晶皿中，盖上表面皿，在22℃、 自然光照的人工气候培养箱中清肠 24 h，清肠后仍然健康的霍甫水丝蚓作为正式实验动物.

嗜热四膜虫(T. thermophila)由南京大学环境学院重点实验室提供. 四膜虫培养基为胰蛋白胨15 g，酵母粉5 g，葡萄糖1 g，超纯水1000 mL，自然pH下121℃灭菌20 min，冷却备用. 实验时分装于250 mL锥形瓶中各100 mL，以4%接种量接种，接种密度为每毫升1×10⁴~2×10⁴个细胞，28℃静置培养约48 h至对数生长期后用于实验.

1,2,4-TCB，硝基苯和毒死蜱均购自百灵威科技有限公司(分析纯)，用二甲基亚砜(DMSO)配制成一定浓度的储备液，实验时根据需要进行稀释. 稀释用水为去氯自来水(曝气48 h). 1.2 实验方法 1.2.1 霍甫水丝蚓急性毒性测定

将挑选洗净清肠后的霍甫水丝蚓随机放入盛有100 mL试液的90 mm×45 mm结晶皿中，每皿20条，同时用表面皿盖好. 采用半静态实验研究1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱毒性，每24 h更换受试液，实验期间不喂食，持续 96 h，分别于24、48、72 和96 h观察霍甫水丝蚓中毒症状和死亡情况，然后计算LC₅₀，并将死亡个体及时取出. 霍甫水丝蚓的死亡标准为：身体泛白，失去伸缩能力，用解剖针碰触无反应. 1.2.2 嗜热四膜虫急性毒性测定

取嗜热四膜虫培养液9 mL分装至15 mL比色管中，根据预实验的结果加入1 mL不同浓度的受试化合物，按等差或等比间距设置7个以上的浓度梯度，使培养体系中1,2,4-三氯苯、 硝基苯、 毒死蜱的最终浓度为5、 10、 15、 20、 25、 30、 35和40 mg ·L^-1； 40、 60、 80、 100、 120、 140和160 mg ·L^-1； 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32和64 mg ·L^-1，同时设置空白组进行对照，并将最大浓度组DMSO 设为阴性对照，所用的DMSO最大添加比例不超过5‰. 每个浓度3个平行，分别于24、 48、 72 和96 h进行细胞计数，计算EC₅₀，实验重复3次. 1.3 数据处理

各实验至少设3个平行，取其平均值和标准差采用SPSS 16.0软件进行统计分析，根据概率单位图解法分别计算两种水生生物24、 48、 72和96 h的EC₅₀、 LC₅₀及其95%置信区间值. 安全浓度SC和最大容许浓度MPC评价采用下列2种公式求得^[14]：

SC=0.1×LC₅₀(EC₅₀)

MPC=0.01×LC₅₀(EC₅₀)

1,2,4-TCB对霍甫水丝蚓和嗜热四膜虫的急性毒性结果如表 1所示，在实验过程中，空白对照组和助溶剂(DMSO)对照组的水丝蚓及四膜虫均未出现行为异常或者死亡. 从中可知，染毒24 h后，1,2,4-三氯苯对四膜虫及水丝蚓的24 h-EC₅₀/LC₅₀分别为21.56 mg ·L^-1和71.88 mg ·L^-1，随时间推移嗜热四膜虫的EC₅₀先减小后增大，但增大的趋势并不显著，至72 h达最小值14.13 mg ·L^-1，霍甫水丝蚓的EC₅₀呈现减小趋势，在96 h达到最小值30.3 mg ·L^-1，即有机污染物的毒性作用逐渐增强. 由表 1可见，1,2,4-TCB对嗜热四膜虫的毒性作用相对较强.

表 1(Table 1)

表 1 1,2,4-TCB对霍甫水丝蚓和嗜热四膜虫的急性毒性 Table 1 Acute toxicity of 1,2,4-TCB on L. hoffmeisteri and T. thermophila 水生生物 时间/h 回归方程 R2 EC50/LC50/mg·L-1 95%置信区间 /mg·L-1 24 y=3.783x-2.024 0.957 71.88 65.40~79.00 霍甫水丝蚓 48 y=4.684x -2.992 0.980 50.83 47.11~54.84 72 y=8.534x-7.958 0.982 32.98 31.55~34.51 96 y=10.036x-9.868 0.950 30.3 29.13~31.51 24 y=2.940x-1.175 0.989 21.56 21.13~27.85 嗜热四膜虫 48 y=1.649x+1.569 0.982 17.06 16.88~17.23 72 y=5.011x-0.763 0.980 14.13 14.01~14.24 96 y=4.465x-0.325 0.992 15.58 15.17~16.03

表 1 1,2,4-TCB对霍甫水丝蚓和嗜热四膜虫的急性毒性 Table 1 Acute toxicity of 1,2,4-TCB on L. hoffmeisteri and T. thermophila

硝基苯对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性数据见表 2. 随着污染物浓度增加和时间延长，硝基苯对水丝蚓的毒性明显增强，死亡率也呈明显上升趋势，并在96 h达到最小值285.76 mg ·L^-1； 硝基苯对嗜热四膜虫的毒性作用在72 h达到最小值103.49 mg ·L^-1，96 h-EC₅₀增加了35.49%，呈现先减小后增大的趋势，在72 h达到最小值103.49 mg ·L^-1，结果表明，硝基苯对嗜热四膜虫的毒性作用高于霍甫水丝蚓.

表 2(Table 2)

表 2 硝基苯对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性 Table 2 Acute toxicity of nitrobenzene on T. thermophila and L. hoffmeisteri 水生生物 时间/h 回归方程 R2 EC50/LC50/mg·L-1 95%置信区间/mg·L-1 24 y=7.471x-14.149 0.961 365.59 349.50~382.43 霍甫水丝蚓 48 y=7.531x-14.005 0.968 333.43 318.86~348.66 72 y=8.450x-16.074 0.990 311.89 299.92~324.34 96 y=8.015x-14.686 0.947 285.76 274.16~297.85 24 y=2.940x-1.1746 0.964 125.87 125.47~126.07 嗜热四膜虫 48 y=1.649x+1.5693 0.983 120.18 119.45~120.67 72 y=1.549x+1.8779 0.987 103.49 103.22~103.69 96 y=3.209x-1.8883 0.991 140.22 103.99~140.47

表 2 硝基苯对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性 Table 2 Acute toxicity of nitrobenzene on T. thermophila and L. hoffmeisteri

表 3显示了毒死蜱对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性数据，随着污染物毒性作用时间的延长，硝基苯对霍甫水丝蚓的毒性明显增强，并在96 h-LC₅₀达到最小值5.5 mg ·L^-1； 毒死蜱对嗜热四膜虫的毒性作用呈现减小后增大的趋势，在48~96 h产生了一定的波动，并在96 h-EC₅₀达到最小值14.69 mg ·L^-1，结果表明，毒死蜱对霍甫水丝蚓的毒性作用高于嗜热四膜虫.

表 3(Table 3)

表 3 毒死蜱对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性 Table 3 Acute toxicity of chlopyrifos on T. thermophila and L. hoffmeisteri 水生生物 时间/h 回归方程 R2 EC50/LC50/mg·L-1 95%置信区间/mg·L-1 24 y=4.158x+0.970 0.970 9.31 8.55~10.15 霍甫水丝蚓 48 y=3.445x-1.830 0.964 8.32 7.54~9.17 72 y=3.663x-2.010 0.984 6.55 5.97~7.18 96 y=4.239x+1.863 0.975 5.50 5.08~5.95 24 y=0.806x+3.686 0.982 42.68 42.17~43.00 嗜热四膜虫 48 y=0.785x+4.0464 0.993 16.37 15.98~16.66 72 y=0.556x+4.2756 0.984 20.13 19.82~20.49 96 y=0.615x+4.2819 0.973 14.69 14.32~14.89

表 3 毒死蜱对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫的急性毒性 Table 3 Acute toxicity of chlopyrifos on T. thermophila and L. hoffmeisteri

根据文献^[15]中对鱼类毒性分级标准，3种污染物对霍甫水丝蚓有不同的毒性作用，其中1,2,4-TCB对霍甫水丝蚓表现为中等毒性，硝基苯对其表现为低等毒性，而毒死蜱则表现为高等毒性，且3种污染物对霍甫水丝蚓毒性大小依次为：毒死蜱>1,2,4-TCB>硝基苯； 3种污染物对嗜热四膜虫的毒性顺序依次为：1,2,4-TCB>毒死蜱>硝基苯. 3 讨论 3.1 3种有机污染物的毒性比较 3.1.1 1,2,4-TCB对水生生物急性毒性比较

研究表明长时间、 高浓度暴露下，1,2,4-TCB会引起动物肝、 肾毒性，也可能损害甲状腺^[16]，并具有潜在的“三致”作用^{[17, 18, 19]}. 目前1,2,4-TCB对我国水生生物毒性效应研究较少，陈粉丽等^[20]研究了1,2,4-TCB对斑马鱼(Danio rerio)胚胎的急性毒性效应，显示胚胎发育终止的24 h-EC₅₀为21.31 mg ·L^-1； Zhang等^[21]研究结果表明，28℃时1,2,4-TCB对四膜虫的48 h-IC₅₀为21.0 mg ·L^-1. 本研究中嗜热四膜虫对1,2,4-TCB的毒性响应值48 h-EC₅₀为17.06 mg ·L^-1，与之前研究结果相符. 霍甫水丝蚓对1,2,4-TCB的48 h-LC₅₀为50.83 mg ·L^-1，相较于四膜虫耐受性较强. 3.1.2 硝基苯对水生生物急性毒性比较

2005年松花江水污染事件发生后，硝基苯成为环境工作者的研究热点. 周群芳等^[22]研究发现硝基苯对日本青鳉(Oryzias latipes)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的48 h-LC₅₀分别为141.4 mg ·L^-1和133.0 mg ·L^-1，较本研究硝基苯对嗜热四膜虫的毒性效应(48 h-EC₅₀为120.18 mg ·L^-1)的结果相似； 刘祎男等^[23]报道了硝基苯对霍甫水丝蚓的48 h-LC₅₀为116.61 mg ·L^-1，与本研究48 h-LC₅₀值(333.43 mg ·L^-1)相差较大，可能与实验条件及受试生物个体差异有关. 3.1.3 毒死蜱对水生生物急性毒性比较

毒死蜱由于在环境中易降解，半衰期短^[24]，因此取代了高毒难降解的农药，得到广泛的应用. 本研究中毒死蜱对嗜热四膜虫和霍甫水丝蚓的96 h-LC₅₀分别为14.69 mg ·L^-1和5.50 mg ·L^-1，高于草鱼(C. idellus)0.05 mg ·L^{-1 [25]}，大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)193.20 μg ·L^{-1 [26]}，斑马鱼(D. rerio)0.52 mg ·L^{-1 [27]}，鲤鱼(Carp)苗0.58 mg ·L^{-1 [28]}和锦鲫(Brocade carp)1.40 mg ·L^-1[25]，说明嗜热四膜虫及霍甫水丝蚓对毒死蜱的耐受能力相对较强. 3.2 两种水生生物毒性比较

随污染物浓度增加和时间延长，霍甫水丝蚓的毒性效应明显增强，呈剂量-效应关系，与氨氮^[7]及重金属、 氯酚的毒性作用相似，重金属Hg²⁺、 Cr⁶⁺和Pb²⁺ 对霍甫水丝蚓的96 h-LC₅₀分别为0.16、 4.25和76.24 mg ·L^-1，3种氯酚类物质2,4-DCP、 2,4,6-TCP和PCP对霍甫水丝蚓的96 h-LC₅₀分别为20.73、 7.86和2.42，其中重金属中Hg²⁺对霍甫水丝蚓表现为极高毒性，Cr⁶⁺、 2,4,6-TCP、 毒死蜱和PCP对其表现为高等毒性，而Pb²⁺、 2,4-DCP和1,2,4-TCB对霍甫水丝蚓表现为中等毒性，硝基苯对霍甫水丝蚓表现为低等毒性. 9种污染物质对霍甫水丝蚓毒性大小依次为：Hg²⁺>PCP>Cr⁶⁺>毒死蜱>2,4,6-TCP>2,4-DCP>1,2,4-TCB>Pb²⁺>硝基苯^[6]，霍甫水丝蚓具有重要的指示作用.

嗜热四膜虫随污染物浓度增加和时间延长EC₅₀先减小后增大，基本至72 h达到最小值，毒死蜱至96 h达到最小值，即3种有机污染物的毒性作用逐渐增强后减小，与李雅洁等^[8]对氯酚的毒性研究结果相同，可能是由于随着时间的推移，嗜热四膜虫对污染物逐渐产生了耐受性，毒性作用削弱. 然而，仅对96 h以内的毒性作用进行了研究，其毒性作用机制仍需进一步研究. 3.3 基于3种有机污染物急性数据的水质安全评价

目前我国对相关化学品的生物毒性安全性评价研究比较薄弱，还没有制定统一的评价标准，无法确保我国水生态系统的安全. 建立我国水环境安全评价体系对于保护我国生物多样性、 水生态系统稳定和人体健康具有重要意义. 本实验根据3种有机污染物对霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫两种水生生物的急性毒性数据，推导上述3种有机化合物对两种生物的安全浓度和最大容许浓度.

根据霍甫水丝蚓及嗜热四膜虫半致死浓度96 h-LC₅₀及96 h-EC₅₀可以分别得到3种有机污染物对应的SC和MPC见表 4. 从中可知，对受试生物嗜热四膜虫而言，1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱的安全浓度和最大允许浓度分别为1.56、 14.02、 1.47 mg ·L^-1和0.16、 1.40、 0.15 mg ·L^-1，而霍甫水丝蚓1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱的安全浓度和最大允许浓度分别为3.03、 28.58、 0.55 mg ·L^-1和0.30、 2.86、 0.06 mg ·L^-1. 不同受试生物物种对同一种有机物的安全浓度及最大允许浓度不同，为保护水生生物生态安全及水体用途，选择较为敏感的物种进行推导. 将两种水生生物的预测安全浓度进行比较后，1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱的最终安全浓度为1.56、 14.02和0.55 mg ·L^-1，最大允许浓度为0.16、 1.40和0.06 mg ·L^-1.

表 4(Table 4)

表 4 3种典型有机污染物安全性评价 /mg ·L-1 Table 4 Safety assessment of three typical pollutants/mg ·L-1 污染物 嗜热四膜虫 霍甫水丝蚓 美国基准 中国地表水环境 质量标准 SC MPC SC MPC CMC CCC 1,2,4-TCB 1.56 0.16 3.03 0.30 0.020 硝基苯 14.02 1.40 28.58 2.86 3.15 0.88 0.017 毒死蜱 1.47 0.15 0.55 0.06 0.030s

表 4 3种典型有机污染物安全性评价 /mg ·L-1 Table 4 Safety assessment of three typical pollutants/mg ·L-1

通过与中国地表水水环境质量标准比较发现，1,2,4-TCB、 硝基苯和毒死蜱的最大允许浓度大于其对应的中国地表水环境质量标准及美国基准值和标准值. 虽然本研究预测的部分污染物最大允许浓度大于规定的标准限值，但上述污染物在实际水体中水质标准的制定还需要更多水生生物毒理学基础实验数据. 同时，污染物水质标准的制定还要考虑各种其他因素的影响，如水体用途、 水质特征及经济、 社会因素等. 4 结论

(1)随3种污染物浓度增加和时间延长，其对霍甫水丝蚓和嗜热四膜虫的毒性效应明显增强，呈剂量-效应关系.

(2)3种典型污染物对霍甫水丝蚓的毒性评估结果显示，1,2,4-TCB为中等毒性，硝基苯为低等毒性，毒死蜱为高等毒性.

(3)3种污染物对嗜热四膜虫的毒性顺序依次为：1,2,4-三氯苯>毒死蜱>硝基苯.