2015, Vol. 36
2. 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403
2. Institute for Agro-Product Quality Standards and Testing Technologies, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China
洛克沙胂(Roxarsone,Rox，3-硝基-4-羟基苯胂酸)是一种常用的有机胂饲料添加剂. 当洛克沙胂作为饲料添加剂被猪、 鸡等摄入后，在胃肠道吸收较少，大部分未经转化即经粪便和尿液排出体外，畜禽粪便作为有机肥被广泛运用于肥沃土壤地或者灌溉蔬菜，继而进入土壤、 水域等环境中，转变为毒性更大的无机形态砷，并吸附和蓄积在土壤中[1, 2, 3]. 土壤中的砷可通过土壤-植物系统迁移，并最终经食物链进入人体[4]. 研究表明洛克沙胂随畜禽粪便进入土壤后可较快地迁徙淋溶[5]，还有研究发现畜禽粪便中砷有71%~75%为水溶性[6]. 砷及其制剂对土壤微生物结构有一定的毒性作用，并且对土壤微生物和土壤酶活均能产生一定的不良影响[7]. 同时土壤中的砷可在微生物的还原作用下释放[8,9]. 目前，对施用含洛克沙胂的畜禽粪便对植物砷含量的影响研究较少，无机砷或有机胂化合物对植物均有强烈的生理效应. 为了探明洛克沙胂在青菜及土壤中的降解、 迁移转化及残留特性，本研究通过田间试验模拟畜禽粪便中残留的饲料源有机胂添加剂(洛克沙胂)对土壤的污染、 土壤中砷向蔬菜中的迁移转化情况以及土壤中含砷水平对于土壤中微生物结构的影响，以期为蔬菜生长的安全性评价提供一定的科学依据. 1 材料与方法 1.1 材料
供试土壤位于上海市浦东新区普南园艺场常规大棚，土壤的理化性质： pH 6.54，有机质2.69 g ·kg-1，速效N 209 mg ·kg-1，速效P 167 mg ·kg-1，速效K 178 mg ·kg-1.
洛克沙胂原料药：湖北兴银河化工有限公司，纯度 98.0%. 洛克沙胂标准品：北京北纳创联生物技术研究院，纯度99.0%. 砷标准液：国家标准物质中心.
主要仪器：AFS-930型双道原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)； Waters 2690 HPLC(美国Waters 公司)； Waters 2487紫外检测器(美国Waters 公司)； Symmetry ShieldTM RP 18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm，美国Waters公司)； 超声清洗机； 涡旋机； 离心机； 回旋振荡器； 旋转蒸发仪等.
主要试剂：高氯酸、 硝酸、 硼氢化钾、 氢氧化钠、 盐酸、 磷酸、 甲醇(色谱纯)、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 甲酸(色谱纯)、 超纯水、 硫脲、 抗坏血酸，以上试剂未说明的均是分析纯试剂. 青菜品种为上海青. 1.2 方法 1.2.1 含洛克沙胂有机肥的配制
将800 mg洛克沙胂原料药溶于500 mL无水乙醇中，将其喷洒于8 kg已风干过2 mm筛的空白有机肥中，搅拌均匀，待乙醇蒸发后，再将有机肥过2 mm筛，制成含100 mg ·kg-1洛克沙胂的有机肥. 1.2.2 试验方案的设计
供试蔬菜为青菜，试验于2013年10月22日开始，并于2013年12月6日收获，种植期共45 d. 田间试验共设5个处理组，施加配制的有机肥的量分别为CK(0 kg ·hm-2)、 T1(1000 kg ·hm-2)、 T2(2000 kg ·hm-2)、 T3(5000 kg ·hm-2)、 T4(10000 kg ·hm-2)，随机区组排列，每个处理组3个重复，每个区组分别种植大小均匀的30棵青菜幼苗，共15个区组，有机肥一次性施入，翻耕. 分别在含洛克沙胂有机肥处理后的0、 15、 30、 45 d于每个区组中随机采集3棵青菜植株，一次共取15棵青菜，以及根层土壤(表层3~4 cm的混合土壤). 青菜样品先用自来水冲洗，然后用去离子水冲洗干净后擦干，分别取青菜的根部和地上部分，并称其鲜重，然后再将其置于烘箱中60℃烘干，粉碎后，用原子荧光法(AFS)测定其中的总砷含量； 土壤样品风干后，挑去残渣和石子，粉碎过100目筛，用原子荧光测定其中的总砷和无机砷含量，以及用高效液相色谱法(HPLC)测定其中的洛克沙胂含量. 1.2.3 原子荧光法测定青菜中总砷以及土壤中总砷和无机砷的含量
AFS测定条件：光电倍增管负高压250 V； 灯电流60 mA； 原子化器温度200℃； 原子化器高度8 mm； 载气流量400 mL ·min-1； 屏蔽气流量800 mL ·min-1. 总砷：称取0.200 g土壤样品以及1.000 g蔬菜样品于150 mL的锥形瓶中，分别加入混酸(硝酸 ∶高氯酸=5 ∶1，体积比)10 mL、 15 mL冷硝化过夜，次日于电热板上硝化，用去离子水过滤定容至25 mL，加入50 g ·L-1硫脲-抗坏血酸5 mL还原，供HG-AFS测定.
无机砷：土壤中无机砷采用6 mol ·L-1的盐酸超声提取，以盐酸为介质定容，硫脲-抗坏血酸还原，供HG-AFS测定，具体操作见王长芹等[10]使用的方法. 饲料中无机砷采用6 mol ·L-1的盐酸 70℃水浴18 h，HG-AFS测定，具体操作见DB34/T 1035-2009[11]. 1.2.4 高效液相色谱法测定土壤中的洛克沙胂
色谱条件:色谱柱为Symmetry ShieldTMRP 18柱； 流动相为含0.1%甲酸的0.05 mol ·L-1磷酸二氢钾 ∶甲醇=95 ∶5(体积比)； 检测波长为266 nm； 柱温为40℃； 进样量为20 μL； 流速为1.0 mL ·min-1.
土壤中洛克沙胂采用0.10 mol ·L-1 NaH2PO4 ∶0.10 mol ·L-1H3PO4=9 ∶1(体积比)10.00 mL作为提取剂，涡旋2 min，于60℃下超声提取30 min，取出冷却，于4500 r ·min-1离心10 min，转移上清液于另一离心管中，残渣再加入10.00 mL提取剂重复上述操作1 次，合并上清液，将上清液倒入带有5.00 mL刻度的旋转蒸发玻璃器皿中，于旋转蒸发仪上55℃旋转蒸发至干，用纯水涡旋超声复溶并定容至3.00 mL，过0.22 μm 微孔滤膜过滤，进行HPLC检测. 1.2.5 土壤中微生物的测定
采用稀释平板计数法测定土壤中细菌、 霉菌、 放线菌的数量. 细菌、 霉菌和放线菌分别采用营养琼脂、 孟加拉红以及高氏Ⅰ号培养基培养. 1.2.6 统计分析
采用SPSS 17.0 for Windows软件进行数据分析和差异显著性检验，数据结果以“平均值±标准差”表示，采用 Excel 2010软件作图. 2 结果与分析 2.1 含洛克沙胂有机肥的施用对青菜产量的影响
在青菜种植45 d后收获，分别对各处理组全部青菜样品进行称重. 由表 1可知，经洛克沙胂处理后，青菜的产量受到显著的影响，减产在15%~32%. 当向土壤中添加洛克沙胂的量逐步递增时，青菜产量先急剧下降，再缓慢升高，于T1处理组处达最低值3400.17 kg ·hm-2. 表明施加洛克沙胂可抑制青菜的生长，然而随着施加洛克沙胂的量的提高，其对青菜生长的抑制作用逐渐降低.
 | 表 1 洛克沙胂对青菜产量的影响 1) Table 1 Impact on yield of Brassica chinensis treated with Rox |
由表 2可知，青菜砷含量随着洛克沙胂施加量的增加逐渐升高，并且T3、 T4处理组与其他处理组差异性显著(P<0.05)，青菜砷含量最高可达2 mg ·kg-1，表明青菜对砷具有一定的富集作用，这与芸苔属植物对重金属有较明显的吸收累积现象[12,13]相一致.
| 表 2 不同阶段青菜不同部位砷含量 /mg ·kg-1 Table 2 As content in different parts of Brassica chinensis in different stages/mg ·kg-1 |
各处理组青菜中总砷含量均随着种植时间的延长呈现先升高后下降的趋势，于30 d时，含量达到最高. 表明青菜在短期内可从土壤中富集砷，但种植时间过长时，青菜中的砷也可能会向土壤中迁移或发生降解. 土壤中也存在一些元素可与砷发生拮抗作用，使土壤中砷的形态发生转化[14].
随着有机肥施加量的升高，青菜根部砷含量变化与青菜整体砷含量变化趋势高度一致，而地上部分砷含量差异不大，并且随着种植时间的延长，各处理组地上部分砷含量逐步下降，最低仅为0.1 mg ·kg-1. 这表明青菜根部为砷主要蓄积部位，难以向上迁移，而青菜地上部分短期内从土壤中富集的砷随着时间的延长会逐渐发生向下迁移. 黄连喜等[15]研究也表明鸡粪中的洛克沙胂对蔬菜生长具有一定影响，但对不同品种蔬菜有不同的体现，且鸡粪中的洛克沙胂均能提高蔬菜对砷的吸收及累积. 2.3 洛克沙胂的施用对土壤中总砷及无机砷含量的影响
由表 3可知，随着洛克沙胂施加量的增加，土壤中总砷含量逐步升高，最高处理组土壤中砷含量均已超过12 mg ·kg-1，并未超出国家规定的一级土壤标准(15 mg ·kg-1). 随着种植时间的延长，各处理组土壤总砷含量呈现先升高再下降的趋势，在30 d时，达到最高值，最高为12.94 mg ·kg-1. 可能是洛克沙胂在土壤中的迁移能力较强，土壤中吸附的洛克沙胂可通过灌溉、 地表径流等因素的影响而发生渗透、 淋溶等现象，迁移至土壤深部，从而造成表层土壤总砷含量随着种植时间的延长而降低.
| 表 3 不同阶段土壤中总砷和无机砷含量 /mg ·kg-1 Table 3 Total arsenic and inorganic arsenic in the soil at different stages/mg ·kg-1 |
各处理组土壤无机砷含量随着种植时间的延长呈现先升高再稳定的趋势，占总砷含量由69%升至95%以上. 在30 d内，各处理组之间土壤无机砷含量无明显差异(P>0.05)，45 d后，T3、 T4与其他各组差异性显著(P<0.05)，这可能与有机肥中洛克沙胂进入土壤后，随着时间的延长，一部分以原形的形态存在，另一部分逐步转化成无机砷有关. 2.4 洛克沙胂施用后，土壤中总砷含量和青菜中总砷含量的相关性
将青菜砷含量与土壤砷含量、 青菜砷含量与青菜砷富集系数以及土壤总砷含量与青菜砷富集系数作相关性分析，由图 1可知，青菜砷含量与土壤总砷含量之间存在一定的相关性，随着土壤总砷含量的升高青菜中砷含量也随之升高； 由图 2、 3可知，青菜砷富集系数与其砷含量之间呈显著正相关，相关系数R2=0.99，同时，与土壤砷含量也呈一定的正相关. 这与文献[16, 17]的研究结果一致.
 | 图 1 土壤总砷含量与青菜砷含量的相关性 Fig. 1 Correlation between total soil As content and vegetable As content |
 | 图 2 青菜砷含量与青菜中砷富集系数的相关性 Fig. 2 Correlation between total As content and BCF of vegetables |
 | 图 3 土壤总砷含量与青菜中砷富集系数的相关性 Fig. 3 Correlation between the total As content in soil and the BCF of vegetables |
从图 4可知，洛克沙胂在种植青菜的土壤中的消除比较缓慢，添加含洛克沙胂有机肥量较高的处理组(T3、 T4)在45 d后土壤中依然有洛克沙胂残留，分别为19.11 mg ·m-3和47.32 mg ·m-3. 仅低浓度处理组(T1、 T2)土壤中洛克沙胂在青菜种植15 d后低于仪器的检出限. T4处理组的青菜在生长到30 d后，土壤中洛克沙胂的含量下降速率减缓，渐趋于稳定，45 d后降解率为52.7%. T3处理组土壤中洛克沙胂降解速率缓慢，在种植时间达45 d时，土壤中有仍残留，降解率为61.8%. 这与张雨梅等[18]的研究结果一致. 土壤中添加的洛克沙胂可能一部分转化成无机砷和简单形态的有机胂，一部分通过地表渗漏和淋溶而迁移至深层土壤.
 | 图 4 土壤中Rox的降解 Fig. 4 Degradation of Rox in soil |
马一冬等[19]研究表明，未灭菌的土壤比灭菌的土壤对土壤中洛克沙胂的降解速率快得多，表明土壤微生物对洛克沙胂的降解起着重要的作用，同时洛克沙胂也会影响土壤微生物种群的结构. 如表 4所示，土壤中细菌的总数随着处理组施加含洛克沙胂有机肥量的升高而升高，于T4处理组达最高为156×105 个 ·g-1，并且在T2处理组土壤细菌总数升高明显，相较于T1处上升了61.04%，各处理组之间差异性显著(P<0.05)，表明洛克沙胂在一定浓度内能够促进土壤细菌的增长. 土壤中霉菌和放线菌的总数均随着含洛克沙胂有机肥的施加量先升高后下降，均在T2处理组总数降至最低，分别为39×103 个 ·g-1和34×104 个 ·g-1，与其他处理组有明显差异(P<0.05)，这表明低浓度的洛克沙胂进入土壤后会对霉菌和放线菌产生一定的抑制作用，而高浓度的洛克沙胂能够减缓抑制并有一定的促进作用. 可能是由于洛克沙胂含量的提高可在一定程度上增强霉菌和放线菌的耐受性，导致适应菌数量的增加和活性的增强来抵制不良影响.
| 表 4 各处理组土壤中三大菌群数量的变化 Table 4 Changes of the amount of microbial in soils |
当土壤中施加低浓度的洛克沙胂时，能够抑制青菜的生长而降低青菜的产量，在有机肥施加量为10000 kg ·hm-2范围内，青菜植株和土壤中的砷含量均随着有机肥施加量的升高而逐步升高，均随着种植时间的延长，砷含量先升高再下降，并于30 d时，T4处理组砷含量达到最高，青菜为2 mg ·kg-1，土壤为12.94 mg ·kg-1.
土壤中洛克沙胂于30 d后降解速率减缓，渐趋于稳定. 土壤中洛克沙胂能够促进细菌总数的增加，而低浓度的洛克沙胂进入土壤后会对霉菌和放线菌产生一定的抑制作用，高浓度的洛克沙胂又能促进土壤霉菌和放线菌数量的增长.
由于洛克沙胂在土壤中的降解较慢，在长期使用畜禽粪便施肥的地区，土壤中砷含量会明显升高[20, 21, 22]，由青菜中砷水平的测定结果可知，在洛克沙胂污染的土壤中生长的青菜对土壤中洛克沙胂有明显的吸收累积，长期在饲料中添加洛克沙胂可能会使农作物产品中砷具有超标的风险[23].
4 结论
(1)青菜的根部为砷主要富集部位. 青菜砷含量与土壤总砷含量之间存在一定正相关，青菜砷富集系数与其砷含量之间呈显著正相关.
(2)洛克沙胂施入土壤后，土壤无机砷会随着种植时间的延长而升高. 且洛克沙胂在种植青菜的土壤中的消除比较缓慢.
(3)土壤中洛克沙胂能够促进细菌数量的增长，低浓度的洛克沙胂对霉菌和放线菌有抑制作用，而高浓度的洛克沙胂对其有促进作用.
| [1] | Han F X, Kingery W L, Selim H M, et al. Arsenic solubility and distribution in poultry waste and long-term amended soil[J]. Science of the Total Environment, 2004, 320 (1): 51-61. |
| [2] | Brown B L, Slaughter A D, Schreiber M E. Controls on roxarsone transport in agricultural watersheds[J]. Applied Geochemistry, 2005, 20 (1): 123-133. |
| [3] | 朱怡苹. 有机胂药物在土壤 (沉积物) 中吸附行为研究[D]. 南京: 南京师范大学, 2013. |
| [4] | 胡留杰, 白玲玉, 李莲芳, 等. 土壤中砷的形态和生物有效性研究现状与趋势[J]. 核农学报, 2008, 22 (3): 383-388. |
| [5] | 刘慧岚. 洛克沙胂在土壤中的移动性研究[D]. 扬州: 扬州大学, 2009. |
| [6] | Jackson B P, Bertsch P M, Cabrera M L, et al. Trace element speciation in poultry litter[J]. Journal of Environmental Quality, 2003, 32 (2): 535-540. |
| [7] | Garbarino J R, Rutherford D W, Wershaw R L. Degradation of roxarsone in poultry litter: in the proceedings of Arsenic in the environment workshop[C]. Denver, Colorado: U.S.Geological Survey, 2001. 21-22. |
| [8] | 谢芸芸, 陈天虎, 周跃飞, 等. 微生物-铁氧化物交互作用对黄土中砷活化迁移的影响[J]. 环境科学, 2013, 34 (10): 3940-3944. |
| [9] | 吴锡, 许丽英, 张雪霞, 等. 缺氧条件下土壤砷的形态转化与环境行为研究[J]. 环境科学, 2012, 33 (1): 273-279. |
| [10] | 王长芹, 高洪彩, 公维磊, 等. 土壤中无机砷的超声提取-原子荧光测定法[J]. 环境与健康杂志, 2011, 28 (6): 538-540. |
| [11] | DB34/T 1035-2009, 饲料中总砷和无机砷的测定[S]. |
| [12] | Raskin I, Kumar P B A N, Dushenkov S, et al. Bioconcentration of heavy metals by plants[J]. Current Opinion in Biotechnology, 1994, 5 (3): 285-290. |
| [13] | 王松良, 郑金贵. 13 种小白菜基因型对 Cd、Pb、As 累积特性比较[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2005, 34 (3): 304-308. |
| [14] | 雷鸣, 曾敏, 廖柏寒, 等. 含磷物质对水稻吸收土壤砷的影响[J]. 环境科学, 2014, 35 (8): 3149-3154. |
| [15] | 黄连喜, 何兆桓, 曾芳, 等. 液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用同时测定洛克沙胂及其代谢物[J]. 分析化学, 2010, 38 (9): 1321-1324. |
| [16] | 陈同斌, 宋波, 郑袁明, 等. 北京市蔬菜和菜地土壤砷含量及其健康风险分析[J]. 地理学报, 2006, 61 (3): 297-310. |
| [17] | 蔡保松, 陈同斌, 廖晓勇, 等. 土壤砷污染对蔬菜砷含量及食用安全性的影响[J]. 生态学报, 2004, 24 (4): 711-717. |
| [18] | 张雨梅, 陈冬梅, 马一冬, 等. 洛克沙胂在青菜及土壤中的残留特性[J]. 农业环境科学学报, 2008, 27 (6): 2467-2470. |
| [19] | 马一冬. 洛克沙胂在土壤中降解的初步研究[D]. 扬州: 扬州大学, 2009. |
| [20] | 王付民, 陈杖榴, 孙永学, 等. 有机胂饲料添加剂对猪场周围及农田环境污染的调查研究[J]. 生态学报, 2006, 26 (1): 154-162. |
| [21] | 胡锋, 李辉信, 史玉英, 等. 两种基因型小麦根际土壤生物动态及根际效应[J]. 土壤通报, 1998, 29 (3): 133-135. |
| [22] | 曾希柏, 李莲芳, 白玲玉. 等. 山东寿光农业利用方式对土壤砷累积的影响[J]. 应用生态学报, 2007, 18 (2): 310-316. |
| [23] | 杨文键, 刘夏另. 植物体内砷和硒累积和分布的相互作用[J]. 中国农业科学, 1997, 30 (3): 89-91. |