环境科学  2015, Vol. 36 Issue (8): 3038-3044   PDF    
引用本文
焦海华, 潘建刚, 徐圣君, 白志辉, 王栋, 黄占斌. 原位生物修复提高多环芳烃污染土壤农用安全性[J]. 环境科学, 2015, 36(8): 3038-3044.
JIAO Hai-hua, PAN Jian-gang, XU Sheng-jun, BAI Zhi-hui, WANG Dong, HUANG Zhan-bin. Improving Agricultural Safety of Soils Contaminated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by In Situ Bioremediation[J]. Environmental Science, 2015, 36(8): 3038-3044.
原位生物修复提高多环芳烃污染土壤农用安全性
焦海华1,2,3, 潘建刚4, 徐圣君3, 白志辉2 , 王栋5, 黄占斌3     
1. 长治学院生物科学与技术系, 长治 046011;
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院, 北京 100083;
4. 内蒙古科技大学生物工程与技术研究所, 包头 014010;
5. 无锡中科活力生物技术有限公司, 宜兴 214200
收稿日期: 2014-07-04; 修订日期: 2015-05-11.
基金项目： 国家高技术研究发展计划(863)项目(2013AA06A205); 中国科学院重点部署项目(KZZD-EW-09-3); 中国科学院环境生物技术重点实验室开放基金项目(EBT2013A001)
作者简介：焦海华(1968~),女,博士,副教授,主要研究方向为环境污染生物修复技术,E-mail:jiaohaihua68@163.com
通讯联系人,白志辉, 黄占斌,E-mail:zhbai@rcees.ac.cn;zbhuang2003@163.com
摘要：为了减少多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)在作物体内的富集,降低食源性PAHs对人类的潜在风险,提高PAHs污染土壤的农用安全性,在受到PAHs污染的麦田中施用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroide)菌剂(RS)进行原位修复. 以叶面喷施(B)和根部喷施(D) 50倍稀释的RS两种方式处理,以喷施等量清水的处理为对照(A),不做任何处理的麦田为空白(CK),从小麦苗期开始处理,到小麦成熟期测定了土壤和小麦籽粒中PAHs含量以及根际土壤微生物群落结构的变化,探讨了施用RS对PAHs污染土壤的强化修复作用. 结果表明,施加RS的B区、D区与空白(CK)区相比,标识土壤微生物的磷脂脂肪酸(PLFAs)种类均有29.6%变异率; 土壤PAHs的去除率分别提高了1.59倍和1.68倍; 富集因子分别降低了58.9%和62.2%; 50穗小麦籽粒的干重分别提高了8.95%和12.5%. RS的施用改变了土壤微生物群落结构,活化了土壤微生物的代谢活性,从而加快了土壤PAHs的降解; 同时,RS的施用也降低了PAHs在小麦籽粒的富集量,提高了小麦的产量,显示出RS在提高PAHs污染土壤的农用安全性方面具有应用潜力.
关键词： 类球红细菌     微生物菌剂     多环芳烃     污染土壤     原位生物修复    
Improving Agricultural Safety of Soils Contaminated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by In Situ Bioremediation
JIAO Hai-hua1,2,3, PAN Jian-gang4, XU Sheng-jun3, BAI Zhi-hui2, WANG Dong5, HUANG Zhan-bin3     
1. Department of Biological Sciences and Technology, Changzhi University, Changzhi 046011, China;
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology-Beijing, Beijing 100083, China;
4. Institute of Bioengineering & Technology, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China;
5. Wuxi Zhongkehuoli Biotechnology Co., Ltd., Yixing 214200, China
Abstract: In order to reduce the risk of enrichment of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in crops, reduce the potential hazards of food-sourced PAHs to human and increase the agricultural safety of PAHs contaminated soils, the bio-augmented removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) was investigated through in situ remediation by introducing Rhodobacter sphaeroides (RS) into the agricultural soil contaminated by PAHs. The 50-times diluted RS was sprayed on leaf surface (in area B) or irrigated to roots (in area D). The treatment of spraying water of the equal amount was taken as the control (A) and the wheat field without any treatment as the blank (CK). Treatments were conducted since wheat seeding. Soil and wheat samples were collected in the mature period to analyze the changes of community structure of the soil microorganisms and the concentration of PAHs in soils and investigate the strengthening and restoration effects of RS on PAHs contaminated soils. Compared to the CK area, the areas B and D revealed that the variation ratio of phospholipid fatty acids (PLFAs) that were the biomarker of soil microorganisms was 29.6%, and the ratio of total PAHs removed was increased 1.59 times and 1.68 times, respectively. The dry weight of wheat grain of 50 spikes was increased by 8.95% and 12.5%, respectively, and the enrichment factor of total PAHs was decreased by 58.9% and 62.2% respectively in the wheat grains. All the results suggested that RS reduced enrichment of PAHs in wheat grains and increased wheat yield, which had great exploitation and utilization potentiality in repairing and improving the agricultural safety of the soils contaminated with PHAs.
Key words: Rhodobacter sphaeroides     microbial agent     polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)     contaminated soil     in situ bioremediation    

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是人类生产活动(包括石油生产、 贮运、 炼制加工及煤、

木材、 石油等化石燃料不完全料燃烧)等过程中产生的一类持久性有机污染物[1]. 根据国际癌症研究协会(International Agency for Research on Cancer,IARC)已公布的致癌性化学物质名单，PAHs是种类最多的一类致癌性物质[2]. 随着经济的发展，PAHs引起的环境污染问题日益严重. 土壤中的PAHs主要来源于大气的干湿沉降、 地表径流以及废水灌溉等. 其中，约90%的PAHs滞留在土壤耕作层[3]，通过挥发、 吸附、 氧化等物理化学行为影响植物生长，并能通过迁移、 转化、 浓缩等生物行为在植物体不同组织中富集，影响农产的品质，最终通过食物链进入人体危害人体健康[4,5]. 罗晓栋等[6]报道了多种蔬菜体内PAHs含量均高于污染土壤中含量，焦杏春等[7]报道水稻对多环芳烃具有吸附积累作用. Wang等[8]分析了洋葱、 甜菜、 西红柿及其生长土壤中PAHs含量，发现PAHs在蔬菜皮中具有较高的富集量. 潘勇军等[9]研究发现，樟树各器官中PAHs的含量依次为：树皮>籽实>树根>树枝>树叶>树干. 由于土地资源的缺乏，目前，全球范围内仍有大面积受PAHs中、 低度污染的土地用作农田栽培粮食与蔬菜作物[10,11]，因此，开展提高此类污染土壤农用安全性技术研究具有重要的应用与开发价值.

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides,RS)是一类光合细菌，有多种代谢方式，具有适应环境的不同代谢途径：如在黑暗厌氧条件下通过丙酮酸-甲酸裂解酶系实现物质代谢过程； 光照条件下能利用固氮酶与脱氢酶的不同机制降解有机物； 在有氧时能进行好氧生长，在无氧有光条件下，能进行缺氧光合生长； 在无氧黑暗环境中，能借助替代性电子受体(如二甲亚砜)进行厌氧呼吸等[12]. 因此，RS的应用性研究引起了人们的关注. 如徐铮奎[13]研究了有关RS的代谢产物在农业生产中的开发与应用； 赵凯等[14]探讨了RS对敌敌畏降解速率的影响，但关于RS在PAHs污染土壤修复中的应用还未见报道.

本研究采用田间试验的方式，选取全球种植与食用最广泛的粮食作物之一小麦(Triticum aestivuml)，以叶面喷施(B)和根部喷施(D)这2种方式，在PAHs污染土壤种植小麦过程中添加RS，探讨RS施用对土壤PAHs的降解、 小麦籽粒中PAHs的积累以及小麦生长等方面的影响，以期为提高PAHs污染土壤农用安全性和污染土壤修复提供参考. 1 材料与方法 1.1 供试材料

试验农田位于北京市西南城郊污灌区农田，曾用石油化工厂排水灌溉多年，现已改用清水污灌. 年均降雨量600~700 mm，集中7~8月； 年均气温12℃； 机械播种与人工管理相结合的耕作方式； 种植方式，一年两熟，小麦与玉米轮番种植. 该区土壤类型属于褐土，其中，土壤中有机质含量为(12.8±0.2) g ·kg-1，总氮含量为(1.56±0.02) g ·kg-1，土壤的pH为8.29±0.2、 电导率(EC)为(260±25) μS ·cm-1； 土壤中检出12种PAHs，PAHs平均值为(790±54) μg ·kg-1，其中，茐的含量最高[(370±6) μg ·kg-1]； 其次为菲[(120±5)μg ·kg-1]. 根据Maliszewska-Kordybach等[15]建立的标准，即土壤中16PAHs的总量小于200 μg ·kg-1则可认为是未被污染，200~600 μg ·kg-1之间为轻度污染，600~1000 μg ·kg-1为中度污染，大于1000 μg ·kg-1为重污染[15]. 该农田的PAHs污染属于中度污染.

供试小麦品种为“麦石12号”的冬小麦； 类球红细菌菌剂是液体菌剂，活菌数>1.98×109个 ·mL-1，菌剂制备参照文献[16]的方法. 1.2 研究方法 1.2.1 试验设计与样品采集

试验田共1.32 hm2，分4个区(每区0.33 hm2). 试验处理：秋季播种，第2年6月初收获. 田间管理方式(包括浇水、 施肥、 除草、 喷洒农药等事宜)，照常进行，不受本试验影响. 在此基础上设置试验区：不施用菌剂正常田间管理的空白区(CK)、 喷施菌剂区(B)、 根施菌剂区(D)(菌剂和水比为1 ∶50稀释)和喷水对照区(A)，A区喷施水量与B、 D区稀释菌剂用水等量. 设置A区是为了排除因菌剂施用过程中增加水量的影响. 整个生长期，每2周施用1次RS，每次施用量为50 L ·hm-2，共施用6次. 样品采集分别在播种前和小麦成熟后采用网格布点法采集耕作层土样(0~25 cm)及其对应的小麦样品(土样每区10个，小麦每区500穗)，装入自封袋运回实验室，然后混合均匀，挑出土壤样品中的石子，植物碎片等杂物. 小麦样品脱除外稃获取籽粒. 样品置于通风橱自然干燥(土壤微生物磷脂脂肪酸测定采用鲜土)； 土壤样品利用瓷质研钵研磨，小麦籽粒用多功能粉碎机进行粉碎，过100目的金属筛. 土壤样品全部过筛. 小麦籽粒经反复粉碎、 过筛，过筛的部分约占籽粒总重量的85%~90%时为止，记为麦粉(或面粉)，剩余的不能过筛的部分记为麸皮，约占总重量的10%~15%. 1.2.2 土壤与植物体内PAHs含量的测定方法

采用EPA超声振荡提取方法提取土壤和植物样品中PAHs，利用气相色谱-质谱(GC-MS，6890/5973，Agilent公司)分析样品[17]，以U.S. Environmental Protection Agency (U.S.EPA) 优先控制的16种PAHs(U.S.16EPA)包括：萘(naphthalene)，苊烯(acenaphthylene)，苊(acenaphthene),芴(fluorine)，菲(phenanthrene)，蒽(anthracene)，荧蒽(fluoranthene)，芘(pyrene)，苯并[а]蒽(Benz[а]anthracene)，(Chrysene)，苯并[b]荧蒽(Benzo[b]fluoranthene)，苯并[k]荧蒽(Benzo [k]fluoranthene)，苯并[а]芘(Benzo[а]pyrsene),二苯并[а,h]蒽(Dibenz [а,h]anthracene)，苯并[g,h,i]芘(Benzo[g,h,i]perylene)，茚并[1,2,3-cd]芘(Indeno[1,2,3-cd]pyrene)购买于Bellefonte，PA,USA，不同浓度的混合溶液作为标样，采用外标法分析. 1.2.3 土壤微生物的测定方法

参照Bligh等[18]的方法提取土壤微生物磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids,PLFAs)，PLFAs的分析与命名参照文献[19, 20]的分析与命名方法. 1.2.4 数据处理

利用NEST 5.0图谱库，根据标样的保留时间和峰面积，对PAHs的GC-MS测定结果进行定性与定量分析. PAH含量用μg ·kg-1表示. 文中所列数据均为3次重复的平均值±标准误差. 利用EXCEL、 SPSS 17.0软件对数据进行方差等处理分析. 土壤中PAHs的去除率=(开始浓度-残留浓度)/开始浓度×100%

生物富集因子=植物体内污染物的浓度/土壤中污染物的浓度 2 结果与分析 2.1 RS对土壤PAHs去除率的影响

初始时不同处理分区土壤中检测到相同的12种EPA优先控制的PAHs. 在小麦成熟期，不同处理区土壤PAHs种类的变化情况见图 1(a). 对照区(CK)中检测到与初始土壤中相同类型的污染物12种、 A检测到11种、 B区和D区均检测到8种. 与CK相比施加RS的区域，PAHs的类型减少了4种，A区PAHs减少了1种. 小麦成熟期，不同处理区土壤PAHs总量的变化情况如图 1(b). CK区和A区PAHs的去除率分别为13.1%和18.6%； B区和D区的去除率分别为33.9%、 35.1%. 表明施加RS的B区和D区土壤PAHs去除率明显高于对照区，而且，根施与喷施这2种处理方式差别不大.

(a)土壤中PAHs种类的变化情况； (b)土壤中PAHs的去除率 图 1 不同处理方式对土壤中PAHs的影响 Fig. 1 Effect of different treatments on the total PAHs in soils
2.2 RS对土壤微生物群落结构的影响

根土壤微生物PLFAs的提取样品，利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析，以B区土壤微生物PFLAs图谱为例(图 2)，其中，横坐标代表各PLFAs在气相色谱中出现特征峰的时间，纵坐标表示各种PLFAs的峰值.

图 2 小麦成熟期土壤微生物磷脂脂肪酸气相色谱图 (以B区为例) Fig. 2 Chromatogram profiles of phospholipids fatty acids of microbial community in soil samples in the mature period (area B)

将气相色谱图-质谱图信息进行量化，转化成数据形式. 根据文献[21, 22]，饱和脂肪酸(SAT)如C14:0、 C15:0、 C16:0、 C17:0、 C18:0标识细菌； 末端支链型脂肪酸(TBSAT)如i13:0、 i15:0、 i17:0、 i18:0、 a12:0、 a14:0、 a16:0、 a18:0等标识革兰氏阳性细菌(G+)； 单不饱和脂肪酸(MONO)如16:1ω7t、 18:1ω3c和环丙基脂肪酸(CYCLO)如cy16:0、 cy18:0标识革兰氏阴性细菌(G-)，是环境胁迫存在时经常出现的菌类； MONO如18:1ω9t、 18:1ω10c和多不饱和脂肪酸(PUFA)如18:2ω6,9、 18:2ω3,9、 18:2ω7,10标识真菌； 中间支链型磷脂脂肪酸(MBSAT)如10Me17:0、 8Me18:0等标识放线菌. 特征PLFAs的相对含量，以该PLFAs的提取量占总量的百分比(%)表示，分析结果如表 1.

表 1 不同处理区土壤中微生物PLFAs的特征 /% Table 1 Characteristics of the soil microbial PLFAs in different treatment areas/%

由表 1可知，在小麦成熟期，根际土壤中标识不同微生物类群的磷脂脂肪酸的相对含量具有一定的差异. 其中，PLFAs 类型相似率为70.4%，SAT相对含量在根施菌剂区最低(27.5%)； TBSAT在根施菌剂区最高(38.1%)； MONO、 CYCLO和PUFA在不同处理区相似； MBSAT在根施区最高(7.26%)，在喷施区最低(2.86%). 与对照组相比，可知施加菌剂对土壤微生物群落结构产生一定的影响，施加菌剂的B和D区，标识革兰氏阳性菌的TBSAT相对含量增加，而标识存在环境胁迫的CYCLO和16:1ω7tPLFA类型相对含量降低. 2.3 RS对植物提取与体内富集PAHs的影响

由图 3可知，小麦麸皮对PAHs富集能力大于麦粉，不同处理区麸皮的富集因子分别为：CK区4.04×10-3，A区3.51×10-3，两者差异不大，而在施用RS的B区和D区，富集因子分别为1.52×10-3和1.54×10-3，显著低于CK区和A区(P<0.05)； 麦粉对PAHs的富集能力低于麸皮，富集因 子分别为：CK区1.64×10-3，A区1.99×10-3，两者差异不显著(P>0.05)，施用RS的B区和D区，分别为0.871×10-3和0.543×10-3，显著低于CK区和A区(P<0.05).

图 3 不同处理区PAHs在小麦籽粒的富集情况c Fig. 3 Enrichment of PAHs in the wheat grain in different treatment areas

由图 4可知，在不同处理区，小麦面粉和麸皮中积累的PAHs种类和总量不同. 图 4(a)表明，小麦面粉中积累的PAHs种类：CK区、 A区和B区中均为5种、 D区4种，主要是<4个苯环的PAHs类型，4环以上的PAHs在面粉中均没检测到； PAHs在面粉中积累的总量分别为：CK区1.04 μg ·g-1、 A区0.802 μg ·g-1、 B区0.567 μg ·g-1、 D区0.476 μg ·g-1. 由图 4(b)可知，在不同处理区，小麦麸皮中均检测到5种PAHs，其积累量均高于同区面粉中的量：CK区为3.16 μg ·g-1、 A区为1.50 μg ·g-1、 B区为1.18 μg ·g-1、 D区为1.13 μg ·g-1.

图 4 不同处理方式对小麦籽粒中PAHs积累量的影响 Fig. 4 Effect of different treatments on the bio-accumulation of PAHs in wheat grain
2.4 RS对小麦籽粒重量的影响

成熟期随机选取50穂小麦，脱粒干燥后称重，与对照CK区相比较计算其总重量增长率. 增长率=(样本区50穂小麦籽粒总重量-对照区50穂小麦籽粒总重量)/对照区50穂小麦籽粒总重量×100%

由图 5可知，施加RS提高了小麦产量. 与空白CK区相比，喷施RS区增加了8.95%、 根施区增加了12.5%，喷水对照A区也提高了5.71%.

图 5 不同处理方式对小麦籽粒重量的影响 Fig. 5 Effect of different treatments on the weight of wheat grain
3 讨论

研究结果表明，RS显著影响了土著微生物的群落结构，提高了土壤PAHs的去除率. PAHs在CK区的去除率为13.1%，喷施与根施RS的处理区分别为33.9%、 35.1%. 杨萌青等[23]研究报道大多数植物、 微生物或多个过程联合修复效率多在20%~60%左右，与本研究结果一致. RS的应用主要是影响了土著微生物的代谢活性，增强了土著微生物对PAHs的降解.

植物提取与植物富集作用是通过植物生长去除土壤污染物的一种方式. 植物提取率与富集因子的大小是常用的植物修复能力的评价指标，在一定程度上能反映该植物对污染土壤修复作用的潜能. 但是，有害物质在粮食作物内的高富集能力对人类将产生一定的潜在安全危害，因此，关于PAHs污染土壤农用过程中植物对该污染物的吸收与富集作用应引起人们的关注. 一般认为其大小与植物种类、 植物自身的生长代谢状况、 土壤微生物群落结构、 植物-微生物联合等因素有关[24]. 该研究结果表明，施加RS能降低小麦籽粒对PAHs的富集能力. B、 D区与CK区相比，小麦籽粒对PAHs的富集因子分别降低了58.9%和62.2%. 同时表明，植物对PAHs的富集与PAHs类型和植物自身组织也有一定的关系. 不同组织和同一组织对不同类型的PAHs的富集能力也有一定的差异. 其中，麸皮的积累量大于面粉； 苯环数大于4(包括4个)的PAHs在小麦体内均没检测到. 该结果与相关报道有一致性，张晓斌等[25]认为污染物经过土壤生态系统的一系列作用，在土壤和作物各部分都会有残留； Jnsk等[26]报道，通过植物的吸收、 沉积和富集作用，PAHs在植物体中具有积累现象. 关于PAHs在小麦不同组织及相同组织在不同生长时期的富集能力及其富集机制还有待进一步深入研究.

从土壤微生物PLFAs的分析结果可知，施加RS的B、 D区与对照CK区相比，标识土壤微生物的PLFA类型均有29.6%差异率. 其中，标识具有PAHs降解功能的G+菌的PLFA相对含量增加，而标识土壤环境受污染物、 营养或盐分等胁迫的CYCLO和16:1ω7t等类型相对含量降低[27]. 该结果表明，RS对土壤微生物群落结构有一定的影响，并对土壤环境具有一定的改善作用. 有研究认为[28]，由于根的表面能为根际微生物的生长提供更大的生存空间，同时，根的分泌物不断刺激根际微生物的生长，微生物的种类、 数量与代谢活性等逐渐发生改变，在根际周围形成特定的根际微生物群落，从而加速PAHs降解菌的生物代谢降解过程. 添加RS对小麦的生长有促进作用，进而改善了小麦根际微生物的生存环境，加速了根际微生物对污染物的降解，其作用的机制还有待进一步深入探讨.

施加RS的B区、 D区与对照CK区相比，50穂小麦籽粒总重量分别增加8.0%和11.2%； 排除水分条件带来的增加(A区)之外，在施加RS的B、 D区小麦的籽粒重量仍有5.2%~6%的增加. 增加的可能原因可归结为两个方面：① RS自身是一种微生物肥料，可以促进了小麦的生长； ②土壤中污染物的减少，降低了对小麦的生长毒性，从而有利于植物生长. 有研究认为[29, 30, 31]，类球红细菌具有如光合代谢、 无机营养代谢、 好氧和厌氧等广泛的物质代谢与能量代谢方式，能够固定氮分子、 合成四吡咯、 维生素B12、 5-氨基乙酰丙酸(ALA)和辅酶Q10等重要的生物活性物质，如ALA能够提高植物的抗胁迫能力； 辅酶Q10是细胞呼吸与代谢的激活剂，是重要的抗氧化剂和生物非特异性免疫增强剂，因此，RS可以增强植物抗性，促进植物生长，提高生产量.

综上所述，RS在PAHs污染土壤农用过程中具有提高小麦产量、 降低PAHs在小麦籽粒中积累，提高污染土壤农用安全性的作用. 相关机制的探讨还有待进一步深入研究.

4 结论

(1) 施用类球红细菌微生物菌剂提高小麦产量的同时，显著影响了土壤微生物群落结构，强化了土壤PAHs的降解.

(2) 施用类球红细菌微生物菌剂降低了小麦对PAHs的富集能力，减少了PAHs在籽粒中的积累量. 改善了小麦的品质，降低PAHs污染土壤农用的潜在风险.

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