2. 中国科学院大学,北京 100049;
3. 上海应用技术学院生态技术与工程学院,上海 201400
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201400, China
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类广泛存在于土壤环境中的持久性有毒污染物,难降解、 毒性强、 具有积累效应,能够危害人类身体健康和整个生态系统安全[1,2]. 进入土壤的PAHs会发生老化锁定,生物有效性显著降低[3,4],从而限制生物修复效果. 微生物固定化技术(immobilized microorganism,IM)能够通过维持微生物快速增殖、 保持微生物活性[5, 6, 7, 8]和改变PAHs赋存状态提高修复效率,在有机污染土壤修复中得到广泛应用,但载体材料对土壤中PAHs迁移转化的影响机制尚不清楚.
载体材料的性质是影响固定化微生物活性、 稳定性及污染物去除效果的重要因素. 在污染土壤原位修复过程中,载体材料加入后即成为土壤一部分,不考虑载体材料的回收,所以对载体材料环境友好性要求更高. 近年来玉米芯、 秸秆等农副产品作为固定化载体因其易于获取、 经济、 可降解、 无二次污染等优点而备受关注[8, 9, 10]. 目前,将玉米芯等农副产品作为吸附材料去除水体中重金属的方法已得到较为深入的研究[11, 12, 13]. 另外,已有研究报道利用酸、 碱等对玉米芯进行改性以提高其吸附性能,制备多孔活性炭去除水体中纤维素、 阿拉特津等有机污染物[14, 15, 16, 17, 18],但是利用农副产品作为固定化材料修复PAHs污染土壤的报道很少[19,20]. 农副产品作为固定化载体在使用过程中会发生腐解并产生大量的腐解产物,这些产物在整个修复过程中可能发挥重要作用,但是目前针对可降解载体腐解产物在老化土壤修复过程中的作用的相关研究很少.
本研究以芘为目标污染物,以玉米芯(粒径2~6 mm)作为固定化载体材料,通过吸附-解吸动力学研究固定化材料腐解产物加入后对老化120 d人为污染土壤中芘解吸的影响,探索可降解载体及其腐解产物影响老化土壤中PAHs解吸的作用机制,以期为进一步阐述固定化菌剂修复污染土壤的机制提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 土壤样品与试剂 1.1.1 试剂与仪器
芘(德国Fluka公司,纯度>97%); 丙酮(分析纯,沈阳经济技术开发区试剂厂); 二氯甲烷(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司); 甲醇(色谱纯,山东禺王实业总公司化工厂); XAD-2树脂(北京康林科技有限责任公司). 蓝盖瓶(德国DURAN SCHOTT); 低速自动平衡离心机(型号DT5-2,北京时代北利离心机有限公司); HZQ-C空气恒温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); 高效液相色谱仪(1200series,美国安捷伦科技公司). 1.1.2 清洁土壤
清洁土壤采自中国科学院沈阳生态实验站0~20 cm表层农田土壤,草甸棕壤土. 土壤样品经风干后过2 mm筛,室温下保存. 土壤理化性质见表 1,具体分析方法见文献[21]. 多环芳烃未检出.
![]() | 表 1 清洁土壤物理化学性质 Table 1 Physicochemical characteristics of the clean soil |
供试玉米芯来自中国科学院沈阳应用生态研究所实验站,风干后粉碎过筛,获得粒径为2~6 mm玉米芯颗粒备用. 1.2 实验过程 1.2.1 芘污染土壤的制备
称取20 mg芘溶于丙酮,定容至200 mL,制备出0.1 mg ·mL-1芘丙酮储备液. 取20 mL储备液,用丙酮稀释后(固液比为5 ∶2,即100g土壤加入40 mL丙酮稀释液)拌入装有100 g风干的清洁土壤中,每15 min搅拌一次,充分混匀,风干后置于棕色瓶中0~4℃ 避光保存,以获得0~4℃下老化120 d、 初始浓度为20mg ·kg-1的芘污染土壤. 参照文献[26]中方法,风干后测其芘的浓度为20.62mg ·kg-1,记为芘污染土壤初始浓度,以符号S0表示; 120 d时测其芘的浓度为13.31mg ·kg-1,记为老化120 d芘污染土壤化学可提取量(预实验表明,老化120 d后土壤中PAHs的化学可提取量处于稳定状态). 1.2.2 背景溶液
解吸实验在背景液中进行,背景液为pH=7,0.01mol ·L-1 CaCl2和200mg ·L-1 NaN3的混合溶液. CaCl2是为了模拟土壤的离子浓度,NaN3是为了避免土壤中微生物的作用. 1.2.3 腐解产物的获取
(1)固定化菌剂制备
将从石油污染土壤分离、 驯化、 选育出的高效降解菌毛霉(Mucor sp.)移植于琼脂斜面上,28℃下纯化培养5 d. 将孢子移植于液体培养基中,恒温振荡(28℃,130~140 r ·min-1)培养5 d得到孢子悬浊液,孢子密度为6×108 mL-1. 将孢子悬浊液按10%的接种量置于200 g固体化增殖培养基中搅拌均匀,即制成玉米芯固定化菌剂[22].
固体化增殖培养基:向2~6 mm的玉米芯颗粒中浇入生石灰水溶液,浸透拌匀,盖上薄膜闷24 h,然后与其他材料混合均匀,按质量分数计,其中2%蔗糖,15%麸皮,2%豆粉,0.06% KH2PO4,0.15% MgSO4 ·7H2O,0.5%(NH4)2HPO4,1.0%~1.5%生石灰,80%玉米芯,然后加入1.5~2倍水分,调节pH=8.0,于1.0132×105 Pa压力下灭菌2次,每次30 min.
(2)腐解产物的获得
玉米芯固定化菌剂腐解后可分为非水溶性腐解产物和水溶性腐解产物. 非水溶性腐解产物即腐解过程中不溶于水的部分(主要为玉米芯颗粒),水溶性部分为腐解产物中溶于水的部分,可通过离心获取上清液得到.
将固定化菌剂置于28℃恒温箱中培养,调节含水量在菌剂饱和持水量的60%左右. 根据含水量变化定期补充灭菌蒸馏水. 分别在1 d、 120 d采样,将固定化菌剂移入离心管,4000 r ·min-1离心10 min. 收集上清液即为水溶性腐解产物; 挑取腐解的玉米芯用超纯水冲洗,作为非水溶性腐解产物,冷冻干燥后0~4℃保存备用.
(3)腐解产物性质的测定
主要分析非水溶性和水溶性腐解产物的化学组成. 腐解玉米芯化学组成成分的分析方法参照植物物质化学组成近似系统分析法[23]; 水溶性有机碳的测定参照文献[24]的方法. 1.2.4 土壤芘解吸的实验
(1)非水溶性腐解产物辅助解吸实验
称取3 g芘污染土放入50 mL蓝盖瓶中,加入20 mL制备好的背景溶液. 同时,加入1 g非水溶性腐解产物(腐解1 d或120 d的玉米芯),对照实验组CK1中加入等量未腐解玉米芯代替腐解玉米芯,调节土壤悬液pH与土壤pH一致,密封,在25℃恒温避光条件下振荡(振速150 r ·min-1),分别在1、 2、 4、 7、 15 d定期取样.
(2)水溶性腐解产物辅助解吸实验
由于芘在水溶液中溶解度(133μg ·L-1)较低,采用XAD-2树脂辅助土壤芘解吸来反映水溶性腐解产物对土壤芘解吸的影响.
XAD-2树脂的预处理:参照文献[25]的方法(略有改进):用甲醇浸润来去除XAD-2中的空气、 痕量化合物和防腐剂. 24 h内不断地换洗. 然后用0.01mol ·L-1 CaCl2和200mg ·L-1 NaN3的混合水溶液替换甲醇冲洗10次以完全去除甲醇,最后储存在0.01mol ·L-1 CaCl2溶液中. 实验时将过多的氯化钙倒去,取足够量的树脂放在烘箱中,80℃烘干6 h. 用二氯甲烷浸泡过的钢丝网(孔径:80目)筛选树脂,收集不能透过钢丝网的树脂颗粒待用.
土壤芘解吸实验:称取3 g芘污染土放入50 mL蓝盖瓶中,加入10 mL背景溶液. 同时,加入10 mL水溶性腐解产物(1 d或120 d样品),然后加入包有200 mg XAD-2树脂的钢丝网,对照实验组CK2中加10 mL蒸馏水代替水溶性腐解产物,调节土壤悬液pH与土壤pH一致. 密封,在25℃恒温避光条件下振荡(振速150 r ·min-1),分别在1、 2、 4、 7、 15 d定期取出样品. 1.2.5 腐解玉米芯/XAD-2树脂对土壤芘的吸附作用
提取测定辅助解吸过程中玉米芯/XAD-2树脂中芘的吸附量,用以研究两者对土壤中芘的吸附过程. 1.2.6 芘的提取与测定
(1)玉米芯/XAD-2树脂吸附芘的提取
将取出的非水溶性腐解产物(腐解玉米芯)/XAD-2树脂放入蓝盖瓶中,加20 mL二氯甲烷,采用振荡-超声提取法,先在振荡器上避光振荡24 h(25℃,150 r ·min-1),再超声提取2 h,水温控制在25~35℃. 然后将溶液移入小烧杯中,氮气吹干,2 mL甲醇定容,定容后的溶液过0.22 μm有机滤膜,待测. 测定结果做为玉米芯/XAD-2树脂对老化土壤中芘的吸附量.
(2)土壤中残留芘的提取
方法参照文献[26],将取出非水溶性腐解产物/XAD-2树脂的蓝盖瓶中土壤溶液移入50 mL离心管中,4000 r ·min-1离心10 min,倒掉上清液,加入10 mL 10%氯化钠溶液(1.5 g NaCl+10 mL蒸馏水)、 15 mL二氯甲烷和20 mL丙酮,避光振荡提取16 h(25℃,150 r ·min-1),取出离心管,静置30 min,取上清液10 mL于小烧杯中,氮气吹干,2 mL甲醇定容,定容后的溶液过0.22 μm有机滤膜,待测.
(3)芘的测定
高效液相色谱仪为安捷伦1200系列,色谱柱为C-18(ZORBAX Eclipse,柱长25 cm,填料Zorbax,粒径5 μm). 待测样品均使用紫外检测器进行检测,色谱操作条件如下:柱温35℃; 流动相为甲醇,流速0.800 mL ·min-1,进样量10 μL; 芘的检测波长:240 nm. 1.2.7 数据处理
实验数据均采用Excel处理,Origin 8.0作图,SPSS 16.0统计分析,Sigma Plot 10.0模型拟合. 2 结果与分析 2.1 腐解产物的理化性质
非水溶性腐解产物的化学组分主要有:苯醇溶性物质、 水溶性物质、 半纤维素、 纤维素和木质素. 可降解固定化菌剂腐解1 d和120 d时,各化学组分含量列于表 2. 从中分析可知腐解120 d各组分含量与腐解1 d相比,苯醇溶性物质极显著增加,水溶性物质和木质素显著增加,半纤维素极显著降低,纤维素变化不显著(ANOVA方差分析).
![]() | 表 2 非水溶性腐解产物组成成分含量 1) Table 2 Composition of insoluble decomposing products |
研究中常以溶解性有机碳(dissolved organic carbon,DOC)、 溶解性有机氮(dissolved organic nitrogen,DON)、 溶解性有机磷(dissolved organic phosphorus,DOP)等来表征水溶性有机质(dissolved organic matter,DOM). 本实验以DOC表征DOM. DOC在1 d和120 d的各组分含量列于表 3. 从中分析可知,DOC含量极显著增加(ANOVA方差分析).
![]() | 表 3 水溶性腐解产物组成成分含量 1) Table 3 Composition of soluble decomposing products |
![]() | 图 1 固定化载体材料腐解产物作用下土壤中芘的解吸动力学 Fig. 1 Pyrene desorption kinetic curves in soil with the decomposing immobilized material |
投加不同腐解产物后,土壤中芘的解吸率(P)可由下面公式计算:
研究表明,有机污染物在土壤中的解吸根据其与土壤的结合力不同,分为快速和慢速解吸组分,可以采用二项一级解吸动力学模型[27]进行模拟,公式如下所示:
PAHs快速解吸部分可用于描述土壤PAHs的生物有效性,其变化规律可以反映土壤PAHs生物有效性变化[28]. 用Sigma Plot 10.0对加入不同腐解产物后的解吸数据进行拟合,拟合参数列于表 4,图 1为拟合曲线. 模型拟合相关系数R为0.907~0.985,拟合效果良好.
由表 4可以看出,腐解产物的加入在不同程度上增加了土壤中芘的生物有效性. CK1、 CK2对照组解吸过程中,快速解吸分数分别为82.59%、 43.66%. 郭美霞等[26]在对微生物降解前后土壤PAHs生物有效性变化的研究中发现,微生物降解前原位污染土壤中芘的快速解吸分数为70%,低于CK1组,高于CK2组,这可能与土壤类型及污染物种类等有关. 投加腐解120 d、 1 d非水溶性产物组快速解吸分数分别为89.38%、 89.10%,与CK1对照组相比,分别增加了6.97%、 6.51%; 投加120 d、 1 d水溶性产物组快速解吸分数分别为91.07%、 51.27%,而与CK2对照组相比,分别增加了47.41%、 7.61%.
![]() | 表 4 土壤中Pyr解吸动力学模型模拟参数 Table 4 Regression parameters of Pyr desorption from soils fitted with the Desorption kinetics model |
固定化菌剂腐解产物投加到土壤中后,腐解玉米芯/XAD-2树脂对土壤中Pyr的吸附动力学如图 2所示. 纵坐标为ct(mg ·kg-1),即玉米芯/XAD-2树脂t(d)时刻对土壤中芘的吸附量,由腐解玉米芯/XAD-2树脂吸附芘的质量与土壤质量的比值计算得到.
![]() | 图 2 腐解产物加入后对土壤Pyr的吸附动力学 Fig. 2 Pyrene sorption kinetic curves in soil after addition of decomposing products |
玉米芯经腐解后,对芘的吸附量增加; 并且随玉米芯腐解时间的延长,腐解玉米芯的吸附量增加. 达到吸附平衡后,未腐解玉米芯吸附量约0.38mg ·kg-1,腐解1 d和120 d玉米芯的吸附量达到3.56 mg ·kg-1和6.30 mg ·kg-1,分别增大了约9.4、 16.6倍. 腐解120 d玉米芯吸附量是腐解1 d玉米芯吸附量的1.8倍.
加入水溶性腐解产物后,XAD-2树脂的吸附量显著增加. 达到吸附平衡后,不加水溶性腐解产物组XAD-2树脂吸附量为8.48mg ·kg-1,投加腐解1 d和120 d水溶性腐解产物的实验组中XAD-2树脂吸附量分别为13.09mg ·kg-1和25.94mg ·kg-1. 与不加水溶性腐解产物组的XAD-2树脂吸附量相比,腐解1 d、 120 d得到的水溶性产物能够使XAD-2树脂吸附量分别增加1.5和3.1倍. 表明水溶性腐解产物能够促进土壤中芘的解吸,且随着腐解程度的加深,水溶性腐解产物促进土壤中芘解吸的能力也会加强.
为了进一步研究玉米芯/XAD-2树脂作为吸附剂对芘的吸附机制,运用二级吸附动力学模型对玉米芯/XAD-2树脂吸附土壤中芘的结果进行拟合,二级动力学模型公式如下:
吸附剂颗粒表面扩散和吸附剂内部微孔扩散等多个过程,二级动力学方程能很好地描述这种多过程作用下芘的吸附动力学. 用Origin进行拟合,拟合数据列于表 5. 模型拟合相关系数R2在0.835~0.994之间,表明二级吸附动力学模型能很好地拟合吸附量和吸附时间之间的关系,可以用二级动力学方程来预测玉米芯/XAD-2树脂上芘吸附量.
由表 5可以看出,腐解1 d、 120 d玉米芯饱
和吸附容量qe分别为4.08μg ·g-1和5.01μg ·g-1,未腐解玉米芯饱和吸附量仅为0.035μg ·g-1; 添加腐解1 d、 120 d水溶性腐解产物后XAD-2树脂的饱和吸附容量qe分别为70.82μg ·g-1和84.26μg ·g-1,而对照组XAD-2树脂饱和吸附量仅为44.33μg ·g-1. 与实验所得饱和吸附量基本一致. 以上结果表明,腐解后玉米芯的吸附容量显著增加,水溶性腐解产物的存在显著增加了XAD-2树脂对土壤芘的吸附容量.
![]() | 表 5 二级吸附动力学模型参数 Table 5 Parameters of second-order kinetics model |
固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的效果取决于污染物与降解菌的可接触性,PAHs进入土壤后会发生老化[3,4],降低了降解菌与PAHs的接触,从而影响修复效果. 玉米芯作为可降解固定化载体,在使用中会发生腐解并产生大量腐解产物,在整个修复过程中产生不可忽视的影响. 实验结果表明向土壤中投加固定化载体腐解产物后,土壤中芘的解吸率提高,快速解吸分数在不同程度上增加,说明腐解产物可以促进土壤芘的解吸,提高土壤中芘的生物有效性,使芘在土壤中的迁移转化行为增强,提高其与降解菌的接触几率.
吸附动力学曲线和二级动力学拟合数据显示,腐解玉米芯对芘的吸附量显著增加,说明玉米芯可以通过吸附作用影响土壤芘的解吸和迁移. 很多研究表明,吸附量与吸附剂的成分有紧密联系[34,35]. 腐解后玉米芯对土壤中芘的吸附量增加可能与玉米芯腐解后的成分变化有关. 固定化载体玉米芯主要成分为纤维素(32%~36%)、 多缩戊糖(35%~40%)、 木质素(25%)以及少量的灰分[21]. 经腐解后,其固有成分纤维素、 木质素等发生腐殖化,腐解产物苯-醇溶性物质的含量呈下降趋势,即样品中类脂化合物在逐渐被分解; 半纤维素和纤维素含量先上升后下降,而木质素增加[32]. 木质素为芳香族化合物,对PAHs具有很强的吸附能力[33]. 腐解时间长,玉米芯分解或腐殖化程度越高,玉米芯腐殖化程度能影响玉米芯吸附能力. 随着玉米芯腐解的不断进行,腐解产物的酸碱性、 相对分子量与分布以及元素组成等,尤其是腐解组分的极性、 官能团类型以及数量也会发生变化,从而造成腐解产物吸附芘能力的差异[34]. 在玉米芯腐解过程中富里酸转向胡敏酸[32],新形成的胡敏酸氧化度低,羧基含量较低,酚羟基含量较高,随着胡敏酸的进一步氧化,羧基增加,酚羟基减少,总酸度增大,结构趋于复杂[35]. 表明随着腐殖化程度增加,氧化程度和芳香性增强,脂族性降低,分子结构复杂化,对芘的吸附能力增加. 另一方面,随腐解时间的延长,真菌及其胞外酶大量富集在腐解玉米芯表面,菌体中脂类或聚酯类物质能够通过分配作用吸附芘,从而增大腐解玉米芯对芘的吸附能力[36]. 总之,向土壤中投加腐解玉米芯后,会显著影响土壤释放芘的重新分布,改变土壤芘结合位点,使原来吸附在小颗粒土壤的芘吸附在腐解玉米芯上,增加土壤微生物与污染物的接触机会,从而被载体内部和表面的微生物降解[37].
水溶性腐解产物中含有大量DOM,DOM可以提高土壤中PAHs的活性,且可以充当有机污染物的载体,促进它们在土壤和水环境中的迁移和扩散. DOM对土壤PAHs的活化作用已有不少学者进行研究,Hwang等[38]利用13C NMR分析了砂质黏壤土和粉砂壤土DOM的比例,认为由于粉砂壤土DOM含量高,芘的解吸量大于砂质黏壤土. 吴文铸等[39]研究发现,农业土壤DOM对PAHs活化能力显著,增强了其在土壤中的移动性; 猪粪、 污泥和绿肥DOM分别使菲吸附容量降低53.8%、 49.1%和41.7%,且菲在土壤上的吸附量与DOM之间呈负线性相关关系. 向土壤中加入水溶性腐解产物,水溶性腐解产物中所含组分如DOM,减少了土壤中的吸附位点,又与土壤吸附的芘产生竞争,减少了土壤中芘的结合位点,从而促进土壤芘的解吸[39,40]. 另一方面,加入的水溶性腐解产物可以对不可逆吸附的芘起到活化作用,降低解吸过程的活化能,促进芘的解吸[34]. 此外,水溶性腐解产物自身能提供大量的活性吸附位点,同时还可能与芘通过NH—π、 π—π、 分配和疏水作用形成配合物提高芘在溶液中的溶解度[39,41]. 由此可见DOM能够影响土壤对PAHs的吸持能力,能够抑制土壤对PAHs的吸附,增加土壤中PAHs的解吸.
4 结论
加入非水溶性和水溶性腐解产物后,土壤芘的解吸率由20%和40%增大到81.8%~84.5%和89.6%~88.5%,说明腐解产物的存在显著增大了土壤中芘的解吸率. 二相一级解吸动力学模型能够很好地拟合老化土壤中芘的解吸数据. 腐解产物加入后,解吸分数在不同程度上增加,污染土壤中芘的生物有效性在不同程度上增加. 主要原因是非水溶性腐解产物即腐解玉米芯的吸附作用和水溶性腐解产物的促溶、 活化作用. 腐解1 d和120 d玉米芯的吸附量达到3.56mg ·kg-1和6.30mg ·kg-1,分别增大了约9.4、 16.6倍. 加入腐解1、 120 d得到的水溶性腐解产物使XAD-2树脂吸附量分别增加1.5、 3.1倍. 可以用二级动力学方程来预测玉米芯/XAD-2树脂上芘的吸附量,二级吸附动力学模型对实验数据拟相关系数R2在0.835~0.994之间,拟合参数qe与实验所得饱和吸附量基本一致.
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