分布在我国东北部的黑土是世界上最大的黑沃土之一，长期耕作^{[1, 2]}，大量使用农药和化肥造成土壤中微生物种群的明显变化^{[3, 4]}，而且不同植物种植也影响土壤化学组成和养分供应，尤其是可利用碳氮的量，最终影响到土壤生物群落. 为了对土壤肥力进行科学评价，研究微生物的量、 多样性及丰度尤为重要^{[5, 6]}. 土壤资源可利用性，尤其是有机质含量和类型与土壤微生物量和微生物多样性具有重要的联系，高肥力土壤中比低肥力中微生物量要高^[7]，而这些因素直接决定着微生物群落各参数的变化. 目前为止绝大多数的研究是基于植物群落，很少把土壤生态系统及微生物代谢活性作为研究对象^[8]. 而对于土壤生态系统，不同季节的微生物如何变化？对土壤微生物群落来说，不同碳源的代谢途径是怎样的，以及影响其活性的因素有哪些？针对这些问题，以黑土为对象进行了研究，采集了吉林省长春市双阳区实验站的黑土，以长期种植水稻的水稻根际土，田间土和从未耕作的空白土为研究对象，以 PLFA 方法^{[9, 10]}和 Biolog 微孔板碳源利用技术对黑土微生物种类和丰度进行分析^{[11, 12]}. 试图揭示不同季节不同耕作条件下土壤细菌群落组成及可培养微生物数量的变化规律^[13]，以期为科学评价典型黑土土壤耕作过程中微生物特征的变化提供参考. 1 材料与方法 1.1 土壤样品的采集和处理

研究地点位于吉林省长春市双阳区农业技术推广站实验区 (125°38′~125°47′E,43°32′~43°45′N，区域内土壤类型以黏化湿润均腐土为主，属典型黑土区)，实验区长期种植水稻10年以上未使用有机肥，耕作区近3年平均每亩施氮肥9 kg. 气候属于典型中温带大陆性季风气候，年平均气温4.5℃，年平均积温2852℃，年均日照时数为2695 h. 于 2013 年分四次采集土壤样品，第一次春季(5月20日)、 第二次夏季 (8月4日)、 第三次秋季 (9月17日)、 第四次冬季 (10月20). 采集土样分别为长期种植水稻的根际土壤，采集时连根拔下整根水稻，在水稻根际抖落的土即为根际土，田间土以及从未耕作土壤(空地)，样地海拔为 211 m. 采用“Z”型五点取样法，采样5点混合，作为1个土壤样品. 采集表层(0~20 cm)新鲜土样，样品一份用于 Biolog 和 PLFA 的测定； 另一份风干过筛测定土壤理化性质. 1.2 实验方法 1.2.1 理化性质分析方法

采用高温外热重铬酸钾氧化－容量法测定有机质，半微量凯氏法测定全氮. 1.2.2 磷脂脂肪酸(PLFAs)分析

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids,PLFA)是活体微生物细胞结构的重要组成部分^[14,15]，可准确地显示环境微生物的类群及生物量的变化^[16,17]，在自然条件下其含量相对稳定，不同类群的微生物含有不同数量和种类的PLFAs，因此PLFAs可以作为微生物生物量和群落结构变化的生物分子尺^[18]. 实验采用修正的Bligh-Dyer方法^[19]，称取6 g(准确至0.01 g)经冷冻干燥处理的新鲜土壤样品提取PLFAs. 分析方法以总碳数：双键数和双键距离分子末端位置命名，t表示反式，c表示顺式，br表示甲基的位置未知，a和i分别表示支链的异型(anteiso)和同型(iso)，10Me 表示甲基团在距分子末端第10 个碳原子上，α和β代表羟基脂肪酸的—OH分别在第2和第3位C原子上，环丙烷脂肪酸用cy 表示.

根据标准数据库和质谱图对检测到的磷脂脂肪酸进行识别，采用十九烷酸脂肪酸甲酯为内标，浓度为33 μg ·mL^-1，计算每种磷脂脂肪酸的相对含量. 进行分析时先将单体PLFAs的摩尔分数进行对数转换. 采用Shannon-Wiener指数(H′)来评价样品微生物群落结构多样性，群落中微生物种类增多代表了群落的复杂程度增高，即H′值愈大，群落所含的信息量愈大. Pielou均匀度指数估计该群落物种分布的均匀度(E).

计算公式为：

可培养微生物数量是反映土壤微生物群落的重要指标,而微生物群落功能多样性(Biolog)反映了微生物群落活性与代谢功能，是表征土壤微生物群落状态与功能的重要指标^[21]. 土壤微生物群落结构与底物利用能力的变化主要受自然环境、 湿度、 作物种植等的影响^[22].

Biolog 方法是使用96孔微孔板^[23,24]，根据不同用途在每个孔中加入不同碳源的微孔板，用于群落多样性分析的是生态板(Eco)，每个板上只有31种碳源，设置了3个重复，另3个为空白直接加双蒸水，以微生物对三大营养物质的代谢途径为基本划分原则，将Biolog EcoPlate^TM 的31 种碳源底物分为五大类: 单糖类及其衍生物； 二糖、 多糖底物； 氨基酸及其衍生物； 脂肪酸和脂类、 代谢中产物和次生代谢物^[25]，如表 1.

表 1(Table 1)

表 1 31种碳源分类 Table 1 Classification of 31 kinds of carbon sources 碳源分类 碳源名称 二糖、 多糖底物 D-纤维二糖、 α-D-乳糖、 α-环糊精、 糖原 糖类及其衍生物 β-甲基-D-葡萄苷、 D-木糖、 i-赤藓糖醇、 D-甘露醇、 N-乙酰基-D-葡萄胺、 D-葡萄胺酸、 D-半乳糖酸-γ-内酯、 D-半乳糖醛酸、 脂肪酸和脂类 丙酮酸甲酯、 土温-40、 土温-80、 γ-羟基丁酸、 衣康酸 氨基酸及其衍生物 L-精氨酸、 L-天冬酰胺酸、 L-苯甲基丙氨酸、 L-丝氨酸、 L-苏氨酸、 葡萄糖-L-谷氨酸 代谢中间产物及次生代谢产物 葡萄糖-1-磷酸、 D,L-α-磷酸甘油、 α-丁酮酸、 2-羟基苯甲酸、 4-羟基苯甲酸、 苯基乙胺、 D-苹果酸、 腐胺

表 1 31种碳源分类 Table 1 Classification of 31 kinds of carbon sources

实验方法称取10 g去除了根系和石块的保鲜土壤，加入90 mL灭过菌的去离子水，振荡(150次 ·min^-1) 60 min，然后取混浊液5 mL稀释100倍. 将混浊液静置5 min，用排枪取上清液接种到 Biolog EcoPlate^TM的微孔内，每孔150 μL. 当可培养的微生物生长时，可以通过显色剂的颜色变化而定量，碳源被氧化的量与相应微生物的活性成正比,这些可培养的土壤细菌代谢活性和代谢多样性可以用来评价土壤的密度和功能多样性. 将接种土壤细菌的微平板在培养箱中25℃避光培养，每隔24 h用 Biolog Reader 于590 nm读数(Multiskan MK3 LABSYSTEMS Finland)，孔中的微生物利用其中的碳源发生氧化还原作用，孔中一旦有电子转移四唑染料就会变为紫红色，然后根据颜色反应的深浅读出每孔的光密度值，获得不同孔中碳源被接种微生物所利用的程度. 连续读数10 d左右直到微孔板颜色不再变化为止. 计算是利用 Biolog EcoPlate^TM的单孔颜色平均值(average well color development，AWCD)，首先把含有相同碳源的单孔在590 nm的光密度值取平均值，然后将不同的碳源在590 nm的光密度平均值减去对照孔的光密度平均值，最后把得到的31种碳源的所有平均值求平均值即为平均颜色变化率. 2 结果与分析 2.1 土壤有机质和全氮结果分析

不同水稻生长期样品中有机质和全氮的含量如图 1和2. 结果表明空地中有机质含量最高，其次为田间土，根际土中有机质含量最低，在夏季的样品中有机质含量最高，土壤中全氮的变化趋势与土壤有机质比较相似.

图 1

Fig. 1

图 1 水稻各生长时期土壤中有机质含量 Fig. 1 Organic matter content of different rice cultivation periods in soil

图 2

Fig. 2

图 2 水稻各生长时期土壤中全氮含量 Fig. 2 Total nitrogen content of different rice cultivation periods in soil

实验共检测到从C13～C18之间的23种PLFAs，包括饱和、 单不饱和、 多不饱和、 支链、 环丙烷、 直链等多种类型脂肪酸，各样品所含单体PLFAs个数差别明显，所有阶段未经耕作的空地土中含有的单体PLFAs个数最多，田间土次之，根际土所含的种类最少. 土壤中的微生物的量依次为：空地土>田间土>根际土，在夏季样品中微生物的量最高，冬季的样品中微生物的量最低，春季和秋季的样品中微生物的量差别不是很明显如图 3. 采用Shannon-Wiener指数(H′)来评价土壤微生物群落结构多样性，Pielou均匀度指数来评价微生物的均匀度，结果如表 2.

图 3

Fig. 3

图 3 水稻各生长时期土壤中微生物的量 Fig. 3 Microbial content of different rice cultivation periods in soil

表 2(Table 2)

表 2 各样品多样性指数与均匀度指数比较 Table 2 Comparison of diversity index and Evenness index of the samples 样品 春季 夏季 秋季 冬季 H′ E H′ E H′ E H′ E 根际 0.50 0.725 0.633 0.917 0.563 0.815 0.463 0.67 田间 0.46 0.667 0.693 1.004 0.633 0.917 0.467 0.677 空地 0.563 0.815 0.698 1.011 0.649 0.94 0.519 0.752

表 2 各样品多样性指数与均匀度指数比较 Table 2 Comparison of diversity index and Evenness index of the samples

由表 2显示春季样品空地土壤中微生物的多样性指数为 0.563，是根际和田间土壤的 1.12 和 1.22倍； 夏季样品田间微生物多样性增加比较明显，空地土壤微生物的多样性最丰富为0.698，是根际和田间土壤的1.10和1.0倍，夏季样品中所有土壤的多样性指数和均匀度指数都有所增加，根际、 田间、 空地土壤中微生物多样性差距减小； 秋季和冬季样品中所有的土壤微生物的多样指数和均匀度指数都逐渐减小，但仍是空地最高，秋季空地是0.649，分别是根际和田间土壤的1.15和1.02，冬季空地是0.519，分别是根际和田间土壤的 1.12和1.11倍. 分析表明：土壤微生物群落的Shannon-Wiener 指数和Pielou均匀度指数均表现为空地高于根际和田间土壤，根际土的Shannon-Wiener 指数和Pielou最小. 所有空地、 田间和根际土壤都表现出夏季与其它季节间存在明显差异，差异达显著性水平(P<0.05). 2.3 Biolog结果分析

土壤微生物群落中能利用碳源的微生物的数目和种类与微生物整体活性有关，AWCD可作为该活性的有效指标，反映微生物群落对碳源利用的总体能力^[26]. 由图 4可以看出，在所有样品中土壤微生物 AWCD 的总体变化规律一致，微生物整体活性均表现出随着培养时间的延长而逐渐增加的趋势； 但不同培养时段内的变化幅度有所不同，所有样品接种培养 24 h后AWCD 无明显变化，表明该阶段微生物代谢碳源比较微弱； 但不同时期的样品在继续培养后，AWCD值的变化不同，并且同一时期的样品由于在田间的来源不同快速增长的频率也不一样. 在春季的样品中田间样品AWCD增长速度较快，空白变化最慢； 而在夏季样品中空白样品AWCD增长速度较快，田间和根际在培养120 h后AWCD变化趋势几乎一致. 在秋季采样中仍是空白样品AWCD增长速度较快，田间次之，根际最慢. 冬季采样中根际样品AWCD增长速度较快田间最慢. 全部样品微生物生长步入稳定期时间和AWCD的变化范围不同，时间分别为216、 192、 216、 120 h，范围分别为0.52~0.84、 0.82~1.28、 0.40~0.84、 0.05~0.48，表明春秋季微生物步入稳定期和对碳源的代谢量比较相似、 夏季最大，冬季最小. 土壤微生物群落功能多样性指数则表现为夏季显著高于秋季和春季，而春、 秋两季差异不明显，冬季最低，且空地的Shannon-Wiener指数和Pielou均匀度指数高于田间和根际.

图 4

Fig. 4

图 4 4个季节微生物群落AWCD随着培养时间的变化 Fig. 4 AWCD of microbial community with culture time in four seasons respectively

根据微生物对三大营养物质的代谢途径为基本划分原则，把Biolog EcoPlate^TM 的31 种碳源底物分为五大类: 单糖类及其衍生物，二糖、 多糖底物，氨基酸及其衍生物，脂肪酸和脂类，代谢中产物和次生代谢物^[27]. 下面就不同样品微生物对不同类型的碳源的利用情况来讨论各土壤样品中微生物结构上的差异性，由上讨论可知土壤微生物群落功能多样性表现为夏季最高，因此以夏季为例对不同营养物质的代谢情况进行研究，如图 5所示.

图 5

Fig. 5

图 5 不同样品碳源利用情况比较 Fig. 5 Comparison of carbon utilization of different samples

从图 5可以看出不同土壤样品对碳源的利用情况不同. 其中，对单糖及其衍生物的利用能力的大小为：空地>根际>田间； 对于二糖和多糖的利用能力：空地最大，田间次之，根际较小； 而对于氨基酸底物及其衍生物的利用能力：空地最高，田间和根际相当接近，在192 h后甚至重合，说明一段时间后根际和田间对该种碳源的利用能力相等； 对于脂肪酸和脂类而言：空地、 田间和根际的利用能力比较接近，在192 h后根际样品对该种碳源的利用微高于其它两个样品； 对于代谢产物和次生代谢产物的利用情况：空地最大，田间最小，根际与田间比较接近. 这可以在一定的程度上说明不同类型的土壤在微生物结构上存在一定的差异.

3 讨论

黑土作为中国典型的土壤在自然发育过程中形成了深厚的腐殖质层，含有丰富的有机质和营养物质，但随着黑土的不同程度的开垦，原有土壤的结构发生了明显的变化. 有研究认为黑土的肥力变化可分为活化、 熟化和培肥这3个阶段，这3个阶段主要是黑土有机质的变化，土壤有机质可以作为黑土养分方面的综合质量指标^[28]. 由图 1和图 2可以看出空地中有机质含量最高，其次为田间土，根际土中有机质含量最低，表明随着水稻的种植改变了土壤有机质的含量，根际土中含量最低，由于水稻的长期种植，使土壤的有机质发生了明显的改变. 同样土壤中全氮的变化趋势与土壤有机质比较相似从空地到根际逐渐降低. 在夏季的样品中有机质含量最高，土壤有机质与微生物密切相关，而土壤微生物群落的变化受众多因子的综合影响，例如土壤营养状况、 质地、 水分、 温度、 根系分泌物、 植物残体等，这些因子会随着季节的变化而变化,进而导致土壤中有机质与土壤微生物群落在空间和时间上的差异性. Liu等^[29]研究表明在新墨西哥州北部沙漠牧场中微生物的功能多样性在夏季最高,春季最低； 孟庆杰等^[30]研究也表明草地和农田土壤微生物群落代谢活性的高峰均出现在夏季. 在夏季由于根系分泌物、 动植物残体增加也导致土壤中的有机质增加. 比较不同样品的总PLFAs可以发现，空地土壤的总生物量在所有时期都有明显的差别，由于天气变化温度升高，适合微生物的代谢生长，周围环境没有对微生物产生影响,导致微生物的量增加. 根际土与田间土在不同时期生物量略有不同，尤其根际土中的微生物的量变化很小，由于水稻根际一些分泌物质和植物残体等影响了微生物的代谢活性^[31]. 由表 2分析表明，空地土的多样性指数和均匀度指数明显高于田间土和根际土，说明夏季土壤微生物群落物种的丰富度和均一性，以及群落中常见物种的优势度都高于其它季节，而田间土又高于其它土样. Biolog-ECO 微平板检测结果表明，全部样品微生物生长步入稳定期时间和AWCD的变化范围不同，时间分别为216、 192、 216、 120 h，范围分别为0.52~0.84、 0.82~1.28、 0.40~0.84、 0.05~0.48，表明空地土微生物对相同碳量碳源的利用，以夏季碳源消耗量最大、 速率最高，春秋季次之，冬季消耗量最小且速率最低，因为夏季土壤微生物较春季和秋季代谢快、 活性强，主要由于夏季温度高、 降雨量多、 植物生长旺盛，使进入土壤的植物残体和根系分泌物数量多，进而导致土壤的有机物质含量高，其分解产物可为微生物提供更多的碳源和养分，促进了土壤中微生物的生长和繁殖，提高了土壤微生物代谢的活性^[32]. 在春季样品中空地土AWCD变化最小，由于春季田间和根际土地的翻耕使土壤中的好氧微生物代谢增强，碳源消耗量增加. 在夏季由于水稻的生长消耗了大量的氮源和有机物，使微生物代谢的能源不足生长受到抑制，致使田间土和根际土的AWCD变化较低； 而空地土中由于进入土壤的植物残体数量多，土壤的有机物质含量高，为微生物提供足够的碳氮源和养分，因此土壤中微生物的生长和繁殖都有很高的代谢活性. 在秋季样品中根际土的AWCD变化最低，由于水稻正处于成熟期需要大量的养分，致使土壤中的碳源减少，土壤中的微生物由于能源不足受到抑制，代谢活性降低； 而田间受到影响较小，代谢活性降低较少^[33]. 在冬季样品中，根际土的AWCD变化最高，由于水稻收割后大量须根残留在土壤中，为微生物的生长提供了充足的养分，土壤中微生物的生长和繁殖代谢活性都很高； 而田间土壤中由于水稻的生长从田间吸收了大量有机质，导致微生物生长能量缺乏代谢活性大大降低； 而空白地的营养受外界影响较小，微生物的代谢活性影响不明显，只是随着温度的降低表现出代谢活性减弱. 季节气候以及水稻的种植对黑土中微生物的代谢活性影响显著，而秸杆还田对保持土壤养分起到了重要作用，在农业生产中提倡秸杆还田，使农业可持续发展. 不同土壤样品对碳源的利用情况不同，说明不同类型的土壤在微生物结构上存在一定的差异，人为的耕作改变了微生物的结构和土壤的性质^[34,35]，同时减弱了微生物对碳源的利用能力.

4 结论

(1) 空地中有机质含量最高，其次为田间土，根际土中有机质含量最低，夏季样品中有机质含量最高，土壤中全氮的变化趋势与土壤有机质相似.

(2) 土壤微生物群落功能多样性指数则表现为夏季显著高于秋季和春季，春、 秋两季差异不明显，冬季最低，且空地的Shannon-Wiener指数和Pielou均匀度指数高于田间和根际.

(3)对单糖及其衍生物的利用能力的大小为：空地>根际>田间； 对于二糖和多糖的利用能力：空地最大，田间次之，根际较小； 而对于氨基酸底物及其衍生物的利用能力：空地最高，田间和根际相当接近； 对于脂肪酸和脂类而言：空地、 田间和根际的利用能力比较接近； 对于代谢产物和次生代谢产物的利用情况：空地最大，田间最小，根际与田间比较接近，说明不同类型的土壤在微生物结构上存在一定的差异.