2015, Vol. 36
2. 四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,绵阳 621000
2. Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province, Mianyang 621000, China
铀，元素符号U，为银白色金属，是重要的天然放射性元素. U作为一种具有无限潜力的能源被人们大量开采，但同时也对生态环境造成严重的破坏，甚至威胁到人类的健康. U及其化合物具有很强的致癌性，能引起急性肾功能衰竭，肝脏和心脏疾病甚至死亡[1]. 已报道的修复方法有物理方法、 化学方法和生物修复法[2, 3, 4]，与前两种修复技术相比，生物修复技术以植物或微生物为载体，具有投资和维护成本低、 操作简便、 不造成二次污染等优点，且有可能通过资源化利用而取得一定经济效益，具有广阔的应用前景[5]，因而越来越受到各国科研人员的广泛重视和青睐.
前人研究显示，自然界中某些植物对U污染土壤是有良好的适应性[6]. 蜈蚣草(Pteris vittata L.)属凤尾蕨科凤尾蕨属多年生草本植物[7]，具有生长快、 生物量大、 地理分布广和适应性强等特点，对U污染土壤具有耐受性. 丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是自然界普遍存在的一种土壤微生物[8]，能够增加宿主植物对土壤中水分和矿质元素的吸收，提高宿主植物的抗逆性[9,10]. AM真菌在U的固定和累积中起着一定作用[11]. Rufyikiri 等[12]通过离体培养实验，证实根外菌丝体能够吸收U并将U运输至植物根系，但根内菌丝可能对U起着主要固持作用[13]. Chen 等[14]研究表明AM 真菌对植物的侵染能增加根中U的固定，从而降低U 由根部向地上部的转运[15, 16]. Chen 等[16]还发现，与菌丝吸收U相比，当根吸收U时，大部分的U转移到地上部，表明根途径吸收的U比菌丝吸收的U 更容易转运给地上部，进一步说明部分AM 真菌吸收的U被固定在菌根共生结构中. Chen 等[17]采用无根毛突变体及野生型大麦为研究材料，证实AM真菌在控制植物体内的U 分配起着关键作用. 以上研究说明AM 真菌在U污染土壤的修复上具有重要的潜在应用价值. Rufyikiri 等[13]认为，在植物根对U 的吸收过程中，相同条件下菌根真菌菌丝吸收和固定U的能力要强于植物根，且AM真菌在U 的吸收中起到主要作用. 蜈蚣草能被AM 真菌侵染形成蜈蚣草-AM真菌共生体从而提高蜈蚣草对重金属污染土壤的耐受性[18]. 但蜈蚣草-AM真菌共生体在修复U污染土壤方面研究报导较少. 同时，土壤中的U有可交换离子态、 碳酸盐结合态、 铁锰氧化物结合态、 硫化物及有机物结合态等多种形态. 元素的存在形态决定了该元素在环境中的稳定性、 迁移性和生物有效性[19]. 研究菌根对土壤中不同形态U的影响，将一定程度上丰富AM真菌吸收和转运U的机制. 因此探明AM真菌与蜈蚣草共生体在修复U污染土壤中的功能作用有重要意义.
本实验以蜈蚣草为材料，接种AM真菌共同作用，探索菌根对U污染土壤中不同形态U的年动态作用，分析菌根共生体对铀的富集和转移，以期为进一步研究蜈蚣草-AM真菌共生体修复铀污染土壤提供理论基础. 1 材料与方法 1.1 供试材料
供试植物为蜈蚣草(Pteris vittata L.)幼苗，购买于厦门百农花卉公司. 供试AM真菌菌种为地表球囊霉(Glomus versiforme，Gv)购买于北京市农林科学院植物营养与资源研究所“中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)”. 供试基质为华侨大学园土、 蛭石、 草炭体积比2 ∶1 ∶1混合，草炭、 蛭石购买于厦门市黑土农业科技有限公司,基质的理化性质为pH=5.3、 有机质0.725 g ·kg-1、 碱解氮0.715 g ·kg-1、 有效磷0.266 g ·kg-1、 速效钾0.507 g ·kg-1. 1.2 实验方法 1.2.1 实验设计
取 25cm×20 cm 规格的塑料花盆，每盆装供试基质2.0 kg. 实验处理共分2组：①接种Gv组(Gv)，每盆接种Gv菌剂30 g； ②未接种组(CK)，每盆接种灭菌基质30 g. 每组15盆. 将幼苗栽到盆内，每盆一棵幼苗. 将UO2(NO3)2 ·6H2O 溶液(U含量为100 mg ·kg-1，pH 为5.0~5.5)均匀喷洒入基质，于华侨大学温室中培养，保持基质湿润. 30 d后进行第1次收割，随后每3个月收割1次，每次随机取3盆，采样时间分别为2013年9月1日、 2013年12月1日、 2014年3月1日、 2014年6月1日，以下简写为9月、 12月、 3月、 6月). 1.2.2 样品的采集
样品采集时，每个处理组随机取3盆，蜈蚣草整株及其周围基质一起取出，收集从植物根部抖落下来的基质为根际基质，混合在一起，基质自然风干、 研磨、 过1 mm筛后备用. 基质中丝密度参照Abbott等[20]的方法测定. 将取出的整株植物样品先用自来水洗净，然后用去离子水冲洗，将根、 茎、 叶分开收集. 取蜈蚣草的根剪切成1 cm长的根段，吸水纸处理后及时地放入FAA固定液(50%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL，福尔马林5 mL)中固定24 h，测定菌根侵染率. 新鲜蜈蚣草根、 茎、 叶去离子水洗涤3次，晾干，在80℃烘箱中烘至恒重，记录干重，粉碎研磨，放入干燥器中备用. 1.2.3 样品的测定
土壤中不同形态U采用Tessier等[21]法连续提取，用ICP-AES测定. 蜈蚣草根、 茎、 叶消解后用ICP-AES测定总U含量. 1.3 数据分析
实验数据运用SPSS 18.0软件进行差异显著性测验和主成分分析. 2 结果与分析 2.1 接种Gv对蜈蚣草植株生长的影响
表 1结果表明，蜈蚣草菌根侵染率2013年9月最低为57.14%，2014年3月最高为75.20%，呈先上升后下降的年周期变化规律. 同一时期，接种Gv组蜈蚣草生物量显著高于CK组. 以根为例，2013年9月、 12月及2014年3月、 6月Gv组蜈蚣草根干重分别为16.9、 8.7、 22.1和37.0 g，较对应CK组分别提高了13.4%、 26.1%、 35.6%和14.6%. 依次采样，Gv组冠根比(地上部分与地下部分干重比)分别为2.07、 1.85、 1.13和0.73，明显小于CK组(2.13、 2.36、 1.17和0.45 g)，说明接种Gv促进了蜈蚣草地上部的生长，但对根系的促进作用更为明显.
随着盆栽培养时间的推移，Gv组和CK组冠根比均逐渐下降，说明U对蜈蚣草的毒害作用抑制了蜈蚣草地上部分生长. 然而，CK组下降幅度较Gv组大，说明Gv有助于缓解U对蜈蚣草的毒害作用.
 | 表 1 AM真菌对蜈蚣草植株生长的影响 Table 1 Effects of AM fungi on Pteris vittata L. growth |
接种Gv对蜈蚣草各器官吸收总U的年动态影响见图 1. 从中可知，同一时期，接种Gv均提高于蜈蚣草各器官中总U含量(2014年6月叶片中总U除外). 随着蜈蚣草盆栽培养时间的延长，接种Gv组叶片中总U含量逐渐下降，而CK组呈上升下降周期性变化； 无论接种组还是CK组，蜈蚣草茎中总U含量均呈下降趋势； 根中总U的年动态变化则相反，接种组与CK组中总U呈递增现象，至2014年6月达到最高，分别为129.2 mg ·kg-1和109.0 mg ·kg-1. 以上说明，接种Gv增加了蜈蚣草根茎叶各器官对U的积累，但地上部和地下部存在差异，根系积累更多，忍耐性最强.
 | 图 1 接种Gv对蜈蚣草不同器官中U含量的影响 Fig. 1 Effects of Gv inoculum on U contents in different organs of Pteris vittata L. |
从表 2可得，2013年9月、 12月及2014年3月、 6月接种Gv组的生物富集系数(BFS)分别为1.13、 1.68、 1.94和1.31，显著高于CK组的0.66、 0.99、 0.59和1.21，且不同时期BFS值均大于1，说明蜈蚣草-AM真菌共生体对U污染土壤具有良好的修复作用. 同一时期，蜈蚣草不同器官对U的BFS存在差异，其中根系BFS远远大于茎和叶的，最大可达20倍.
转移系数(TFS)则相反，接种Gv组转移系数小于CK组. 2013年9月、 12月及2014年3月、 6月接种Gv组的生物富集系数(TFS)分别为0.38、 0.13、 0.12和0.10，显著低于CK组的0.44、 0.18、0.55和0.11. 以上说明接种Gv能促进U向蜈蚣草各器官中的转移，但根系富集效应最大.
| 表 2 接种Gv对蜈蚣草富集和转移U的影响 1) Table 2 Effects of Gv inoculum on the bioconcentration factors (BFS) and translocation factors (TFS) |
由表 3可知，菌根侵染率与根吸收U含量、 BFS和TFS呈正相关关系. 其中菌根侵染率与BFS之间存在显著正相关关系(P>0.05)，与根吸收总U及TFS之间呈正相关关系但不明显，说明Gv的侵染促进了基质中U向宿主植物蜈蚣草中的转移. 根系中总U含量与BFS呈显著正相关(P<0.05)，说明基质中的U主要的转移部位是蜈蚣草的根系. 2.5 接种Gv对基质中不同形态U含量的影响
从图 2可知，基质中总U的含量在同一时期，Gv组均低于CK组，2014年3月差异最显著，CK组基质中总U的含量是Gv组的1.63倍. 接种Gv组随时间的推移总体呈下降趋势，但3月略有回升，而CK组呈先上升后下降的周期变化趋势[图 2(a)]. 以上结果说明，接种Gv提高了基质中总U的转移率，Gv可以改善蜈蚣草因季节变化而对基质中U的吸收量变化情况，增强了蜈蚣草对U污染土壤的修复效果.
 | 图 2 接种Gv对基质中不同形态U含量的影响 Fig. 2 Effect of Gv inoculum on different U species in medium |
基质中可交换态U含量CK组9~12月未变化为13.0 mg ·kg-1，12月~次年3月含量下降1.0 mg ·kg-1，3~6月为变化为12.0 mg ·kg-1. Gv组从2013年9月到2014年6月含量持续降低，且下降幅度为CK组2倍[图 2(b)]； Gv组与CK组基质中碳酸盐态U含量差异显著，9月含量最高Gv为36.0 mg ·kg-1，CK为35.0 mg ·kg-1，12、 3、 6月持续下降，6月含量最低Gv为9.0 mg ·kg-1，CK为13.0 mg ·kg-1，说明基质中碳酸盐态U易于转移. 9月Gv组大于对照组，从12月开始均小于对照组[图 2(c)]，说明Gv有助于促进碳酸盐态U转移； Gv组基质中铁锰氧化态U含量显著高于CK组，Gv组和CK组均在9月含量最高为129.0 mg ·kg-1和11.0 mg ·kg-1，6月含量最低为60.0 mg ·kg-1和42.0 mg ·kg-1，9月~次年6月持续下降[图 2(d)]，说明铁锰氧化态U易于转移. 但Gv组基质中铁锰氧化态U含量始终高于CK组，有可能是AM真菌促进了其他形态U向铁锰氧化态U的转化； Gv组9月硫化物态U的含量显著高于CK组，9月~次年6月Gv组硫化物U的含量为下降趋势，从12月开始变化明显且含量低于CK组. CK组从9 月~次年3月相继持平，3~6月有下降趋势[图 2 (e)]，Gv促进硫化物态U的转移明显； CK组基质中残渣态U含量大于Gv组，3月最为明显. 9月~次年3月变化趋势不大，但随着时间的推移含量有所下降. 而Gv组结晶态U的含量持续下降且变化较为明显，从9月~次年6月下降12.0 mg ·kg-1，结晶态U为惰性状态不易于转移[图 2(f)]，结果显示Gv有利于增加残渣态U的活性促进其转移. 图 3更直观地表现出铁锰氧化态U和硫化物态U所占比例高于其他形态.
| 表 3 菌根侵染率与蜈蚣草根茎叶总U、 BFS和TFS的相关关系 1) Table 3 Relationship between mycorrhizal colonization and total U contents in centipede grass,BFS and TFS |
 | 图 3 不同形态U占总U的百分比 Fig. 3 Percentage of different U species |
基质中不同形态U的主成分分析见表 4，从中可知，前两项主成分贡献率累计达到92.274%，大于85%，可以保存和说明原有的全部信息，其余贡献率较小，忽略不计. 这样把原来的5 个单项指标转换为2 个新的相互独立的综合指标，代表了原来的全部信息.
| 表 4 基质中不同形态U的主成分分析 Table 4 Principal component analysis on different U species in medium |
第一主成分因子中硫化物态负荷系数较大，表明硫化物态U的变化对总U的影响起重要作用； 第二主成分因子中可交换态负荷系数较大，表明可交换态的变化对产量影响较大； 综合以上数据，基质中不同形态U对总U的影响大小表现为：硫化物态＞铁锰氧化态＞碳酸盐态＞可交换态＞残渣态. 3 讨论
前面研究显示，接种Gv组蜈蚣草中总U的含量显著高于CK组，说明Gv有助于蜈蚣草富集基质中的U. 可能是因为Gv侵染蜈蚣草形成菌根共生体，菌根根外菌丝扩大了蜈蚣草吸收U的面积. Rufyikiri等[13]发现，相同条件下AM真菌菌丝吸收U的能力要强于植物的根，在吸收U中起到主要作用. Chen等[14]研究发现菌根根外菌丝和植物的根毛具有相同作用，都可以扩大吸收U的面积. Chen等[31]研究还发现菌丝长度与土壤中U的浓度呈负相关关系. 都说明AM真菌根外菌丝是促进植物吸收U的作用之一. 另一方面有研究报道，AM真菌分泌物会改变根际土壤的pH，而pH也是影响植物体对U吸收的因素之一，pH可以改变U的生物有效性[12]. Gv组蜈蚣草叶片中铀的含量呈下降状态(图 1)，可能是因为随着时间的推移，叶片生物量变大，叶片中铀的浓度被稀释. 也有可能是随着季节的变化，蜈蚣草自身的生理周期的影响. Pérez-Sánchez等[29]研究表明季节的变化显著影响U向植物的转移.
U在土壤中的形态可分为可交换离子态、 碳酸盐结合态、 铁锰氧化物结合态、 硫化物及有机物结合态和残渣态，其中前4 种形态U为活性U，残渣态U为惰性U[22]. 图 2结果显示随着时间的延长，铁锰氧化态U的含量显著下降说明铁锰氧化态U易转移，Gv组基质中铁锰氧化态U含量显著高于未接种组，说明Gv有助于铁锰氧化态U的形成，Gv组和CK组均在9月含量最高，6月含量显著下降，说明Gv促进铁锰氧化态U的吸收； Gv组的硫化物态U年含量下降最显著，说明Gv有助于促进蜈蚣草对硫化物态U的吸收. 由表 4可以得到，基质中不同形态U对总U的影响大小表现为：硫化物态＞铁锰氧化态＞碳酸盐态＞可交换态＞残渣态. 而Gv对硫化物态和铁锰氧化态作用最为显著，菌根共生体内可能存在着活化根际土壤U素的机制. 硫化物态和铁锰氧化态为活性态U，易于转移，可能AM真菌与蜈蚣草共生使得蜈蚣草内某种离子含量增加，而这种离子易与硫化物态和铁锰氧化态U结合，为进一步研究蜈蚣草-AM真菌共生体修复U污染土壤提供参考.
生物富集系数是植物地上部分的放射性核素的含量与植物根部放射性核素含量的比值(以干重计)[23]. 迁移系数是植物地下部分的放射性核素的含量与植物根部放射性核素含量的比值. 在U污染修复植物的筛选过程中，植物能否抵抗U的毒性而在U污染土壤中正常生长以及植物对U的吸收富集能力是两个重要的评价指标[24,25]，接种Gv组的生物富集系数显著高于CK组，且富集系数大于1，说明蜈蚣草-AM真菌共生体具有良好的土壤U修复作用. 而接种Gv组蜈蚣草对U的转移系数小于CK组. 这与Chen 等[14,16] 研究结果相一致，他们发现AM 真菌对植物的侵染能增加根中U的固定，AM 真菌吸收的U被固定在菌根共生结构中. Boulois等[26]也发现AM真菌可减少U从植物根部向上转移. Rufyikiri等[27]通过实验证明AM真菌能促进U迁移至植物的根系，但AM真菌的结构对U有强烈的吸附作用，因而限制了U从植物根部向上部的转移. Shtangeeva[28]的实验也证实了植物根部中U的含量高于植物地面上部. AM真菌有助于提高植物修复重金属的工作效率，通过提高植物对营养素的吸收，保护它们免受金属的毒性[30]. 说明AM真菌抑制放射性元素U从根系向上转移，从而保护蜈蚣草少受U毒害，有助于蜈蚣草在U污染土壤中生存. 因此，蜈蚣草-AM真菌共生体修复U污染土壤具有良好的应用前景.
4 结论
(1)AM真菌可以有效促进蜈蚣草对铁锰氧化态铀和硫酸盐态铀的吸收和转移.
(2)AM真菌有助于蜈蚣草富集铀，同时又有效缓解铀对蜈蚣草的毒害.
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