全程自养脱氮(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite，CANON)工艺作为一种新型的全程自养脱氮技术，具有节约曝气和占地面积、 污泥产量低和无需外加有机碳源、 高效脱氮等优点，并且适用于处理低碳氮比的城市污水或者有机碳缺乏而氨氮含量高的味精废水、 养殖废水和垃圾渗滤液等工业废水，是一种经济、 友好型的污水处理工艺，极具应用前景^[1].

在CANON系统中，脱氮主要是在氨氧化微生物的作用下，将进水中约一半的NH⁺₄-N氧化为NO^-₂-N，厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation,ANAMMOX)再将剩下一半的NH⁺₄-N和生成的NO^-₂-N转化为N₂^[2]. 最初，研究者们认为氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)是污水生物处理系统中氨氧化的主要完成者. 例如，Wagner等^[3]利用荧光原位杂交技术对比了几个污水厂AOB群落的异同； Persson等^[4]研究了处理生活污水的生物膜系统内AOB的活性及分布； Hallin等^[5]研究了污泥停留时间对AOB群落的影响； Siripong等^[6]在7个污水处理厂使用末端限制性片段长度多样性技术检测到AOB的存在. 随着人们发现氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)在自然环境中的普遍存在，证实AOA也可以实现氨氧化，并将其归属于一个新的“门”——奇古菌门^[7]. 在污水处理领域，Park等^[8]首次在美国5个污水处理厂(共考察了9个污水处理厂)检测到AOA； 随后Zhang等^[9]在香港的2个污水处理厂中也发现了AOA. 而后，一些研究者开始同时研究AOA和AOB在污水脱氮工艺中的丰度和多样性，例如：Limpiyakorn等^[10]研究了4个市政和3个工业水处理厂的AOA和AOB的数量和种属，对同一个系统内的AOA与AOB的数量进行了比较； Gao等^[11]采集了8个不同工艺、 水质的市政和工业污水处理厂的污泥样品，研究了AOA和AOB的种属和丰度以及影响因子； Zhang等^[12]对中国杭州一个化学工业园的污水处理厂和一个处理抗生素废水的污水厂中AOA和AOB的丰度进行了研究. 尽管有一些不同污水脱氮系统AOB和AOA的种属和数量的研究，但是关于CANON系统的研究，主要集中于研究其系统运行效能的影响因素，如温度^[13]、 pH^[14]、 DO^[14]、 NH⁺₄-N浓度^[2]等，关于该系统内氨氧化微生物的研究也主要集中于AOB，有关CANON系统中AOA的研究很少. 基于此，本文研究了2个CANON污水处理系统中(1个小试和1个中试反应器)AOA的数量和种属特征； 同时考察了生物膜和活性污泥絮体这2种不同污泥形态中AOA的数量区别，分析了污泥形态对AOA的影响. 本研究将扩展人们对于CANON系统中氨氧化微生物的认识.

本研究的对象是2个CANON自养脱氮系统：低氧运行下0.12 m³的序批式生物膜反应器(sequencing batch biofilm reactor，SBBR)，小试(lab-scale，L)； 低氧运行下500 m³的填充有海绵和空心球填料的缺氧/好氧脱氮系统(anoxic/oxic，A/O)，中试(pilot-scale，P).

系统L和P分别处理城市污水处理厂二沉池出水和高NH⁺₄-N浓度的污泥消化上清液. 系统L接种短程硝化污泥0.06 m³，并额外接种已富集ANAMMOX菌的海绵填料，填料比为10%； 系统P接种活性污泥泥饼10 t，并接种富含ANAMMOX菌的空心球和海绵两种填料，填料比为20%. 系统L和P进出水水质以及运行参数见表 1. 从中可知：L系统COD和总氮去除率分别为50.0%和78.3%，而P系统COD和总氮去除率分别为68.2%和84.0%~86.7%，2个系统运行效果较好.

表 1(Table 1)

表 1 2个CANON污水处理系统的各项水质参数 Table 1 Water quality parameters of wastewater in two CANON bioreactors 反应器 容积 /mg·L-1 进水/mg·L-1 出水/mg·L-1 MLSS /mg·L-1 SRT /d HRT /h DO /mg·L-1 COD TN NH+4-N TP COD TN NH+4-N TP L 0.12 206.58 51.52 43.89 4.09 40 10.7 7.24 0.17 3 000 4~5 3~4 0.2~0.5 P 500 516 500~600 450~500 14.6 164 60~80 <15 2.65 3000~5000 8 10 <0.5

表 1 2个CANON污水处理系统的各项水质参数 Table 1 Water quality parameters of wastewater in two CANON bioreactors

分别采集稳定运行的系统L和P中活性污泥絮体和生物膜填料，存于-20℃. 样品情况见表 2. L和P中所有样品的AOA均采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR)进行定量分析. 其中，L为投加富含ANAMMOX菌填料的SBBR反应器，该反应器自养脱氮的主体为生物膜； P为投加富含ANAMMOX菌海绵填料的A/O系统，该系统的主体是絮体活性污泥. 选取样品L1(生物膜)和样品P4(污泥絮体)为代表，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和克隆技术研究L和P中AOA多样性.

表 2(Table 2)

表 2 样品详细信息 Table 2 Information on samples from two bioreactors 反应器 样品 污泥形态 样品描述 L1 生物膜 常温运行10 d后边长为1 cm立体海绵方块 L L2 生物膜 低温14℃运行45 d的边长1 cm立体海绵方块 L3 活性污泥絮体 常温运行10 d的絮状活性污泥 P1 生物膜 直径10 cm聚乙烯球内边长1 cm的立体海绵填料 P P2 生物膜 直径10 cm聚乙烯球内8 mm厚度的片状海绵填料 P3 生物膜 边长1 cm的立体海绵填料 P4 活性污泥絮体 活性污泥絮体

表 2 样品详细信息 Table 2 Information on samples from two bioreactors

使用Fast-DNA Spin kit for soil (QIAGEN，CA，USA) DNA试剂盒，提取生物膜和活性污泥样品DNA. 使用特异性引物Arch-amoAF(5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′)和Arch-amoAR(5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′)扩增AOA的amoA基因^[15]，PCR反应体系和程序见文献^[15]. 使用Zero Background TA TOPO Cloning Kit(Clone Smarter,Houston,USA)将纯化的PCR产物连接到pCloneEZ-TA-AMP载体中，并最终转入DH108感受态细胞，随机挑取平板上生长的白斑，送往中美泰和生物技术(北京)有限公司测序. 将测序序列经MEGA 5.05和Mothur 1.19软件处理后，按97%的序列相似度计算得到代表性OTU和文库覆盖率及多个多样性指数，并得到稀缺性曲线. 在NCBI库比对测序序列，搜索并下载同源性高的序列. 利用MEGA 5.05软件，将代表性OTU和下载的高同源性序列、 前人研究发表的AOA的amoA基因序列采用邻接(Neighbor-joining)法构建系统发育树.

首先，通过特异性引物扩增AOA amoA目的片段，将该片段克隆到pCloneEZ-TA-AMP载体，再转入DH108感受态细胞生长，最终挑斑、 摇菌，经测序验证为AOA amoA基因序列，提取带有目的片段的质粒作为qPCR标准品. 采用引物Arch-amoAF和Arch-amoAR，参照文献^[11]中的扩增体系和程序，于Stratagene MX3005p thermocycler(Agilent Technologies,USA)仪器上采用qPCR(SYBR Green Ⅰ核酸染料法)对AOA定量. 质粒经过一系列稀释，使其浓度(以DNA计)为10¹~10⁸ copies ·μL^-1，建立标准曲线. 标准品和未知样品，分别做3个平行，并设置阴性对照. qPCR的扩增斜率为-3.33，扩增效率为99.6%，标准曲线相关系数R2为0.997，溶解曲线为单一峰.

L和P系统共克隆、 测序得到58条AOA序列，提交到GenBank数据库，登录号分别为KM402140~KM402168和KM402169~KM402197.

2.1 2个CANON污水处理系统AOA数量特征

本文研究了2个CANON污水处理系统(L和P)中不同污泥存在形态(生物膜和活性污泥絮体)对于AOA数量的影响. L和P系统的7个样品中AOA的数量均较高，其qPCR的结果如图 1所示. 从中可以看出：这7个样品AOA的amoA基因含量(以dry sludge计，下同)范围为(2.67×10⁵±1.16×10⁵)~(1.26×10⁷±6.50×10⁵) copies ·g^-1，平均值为4.76×10⁶ copies ·g^-1. 其中，反应器L和P中，AOA的丰度均值分别达到2.42×10⁶和6.51×10⁶ copies ·g^-1. 反应器L中，生物膜样品L1和L2中AOA的数量分别是2.97×10⁶和4.02×10⁶ copies ·g^-1，污泥絮体L3中AOA的数量较少为2.67×10⁵ copies ·g^-1，生物膜样品中AOA的数量约为活性污泥絮体样品的11.1~15.1倍，说明不同污泥形态对AOA数量有一定影响； 其次，样品L2取自于低温环境中(14℃)，而其AOA数量最大，表明低温(14℃)并未抑制AOA的生长，温度对于AOA数量的影响可能不大. 反应器P中，3种不同生物填料(分别为P1、 P2和P3)的AOA数量相差不大，其AOA的数量分别为3.61×10⁶、 5.90×10⁶和3.96×10⁶ copies ·g^-1，平均值为4.49×10⁶ copies ·g^-1，说明生物填料的大小、 形状以及放置方式对AOA数量的影响不大. 污泥絮体P4中AOA的数量是1.26×10⁷ copies ·g^-1，约为生物膜中的2.8倍，进一步说明污泥形态对于AOA的数量有影响，但却与L系统的结果相反.

图 1

Fig. 1

图 1 2个CANON污水处理系统中AOA的定量结果 Fig. 1 Quantitative results of AOA amoA gene copies in samples of two CANON systems

样品L1和P4各自得到29条AOA序列，其稀缺性曲线如图 2所示，多样性指数表如表 3所示. 从图 2可知，两个样品的稀缺性曲线均达到平台期，同时序列的文库覆盖度分别高达86.21%和100%，说明，测序量足以反映样品中AOA的多样性. 在97%的序列相似度下，L1和P4分别得到8和1个OTU，同时L1的香农指数明显高于P4，说明L1中AOA的多样性明显高于P4. 图 3表明了L1和P4样品中OTU的分布及含量：其中L1中OTU2和OTU4为主要的OTU，其所占的比例分别为55.17%和17.24%； 此外，OTU1和OTU3所占的比例均为6.9%，而OTU5和OTU6所占比例更小，均为3.45%； 而P4中仅含有OTU6，也证明了L1中AOA的多样性明显高于P4.

图 2

Fig. 2

图 2 2个CANON污水处理系统中AOA种群稀缺性曲线 Fig. 2 Rarefaction curves indicating the richness of AOA within clone libraries derived from different samples in two CANON systems

表 3(Table 3)

表 3 两个CANON污水处理系统中AOA克隆文库分析结果 Table 3 Sequence diversity of AOA and Goods coverage of the clone libraries in two CANON systems 样品 测序数 OTUs数 文库覆盖度/% Chao1指数 测得OTUs数/实际OTUs数/% 香农指数 L1 29 8 86.21 10 80.00 1.46 P4 29 1 100.00 1 100.00 0.00

表 3 两个CANON污水处理系统中AOA克隆文库分析结果 Table 3 Sequence diversity of AOA and Goods coverage of the clone libraries in two CANON systems

图 3

Fig. 3

图 3 2个CANON污水处理系统中AOA的OTU分布以及相对含量 Fig. 3 Distribution and relative abundance of OTUs of AOA in two CANON systems

对于AOA种属的划分，有2个阶段，第一阶段是将AOA归为泉古菌的group I.1a和group I.1b的阶段^[16]，I.1a主要是海洋硝化古菌，而I.1b主要是土壤硝化古菌^{[17, 18]}； 第二阶段将AOA划分到一个新的古菌门——“奇古菌门(Thaumarchaeota)”^[19]，并且将AOA分为Nitrosotalea cluster、 Nitrosopumilus cluster(即group I.1a)、 Nitrososphaera cluster(即group I.1b)、 Nitrosocaldus cluster 和Nitrososphaera sister cluster 5大类群^[20].

从图 4可知，本研究的AOA序列属于Nitrososphaera cluster和Nitrosopumilus cluster两个大簇：第一簇Nitrososphaera cluster又分为subcluster 9、 subcluster 8.1、 subcluster 4.1和subcluster 1.1这4个亚簇； 第二簇Nitrosopumilus cluster仅含subcluster 5.2这1个亚簇. 第一簇中，L1样品OTU1、 OTU4、 OTU6聚成亚簇Nitrososphaera subcluster 9，这3个OTU与长江河口沉积物样品clone S7-A-21(EU025160)序列最相近，序列相似度均为92%. L1样品OTU8，聚成亚簇Nitrososphaera subcluster 8.1，并且与西太平洋深海沉积物样品clone 3063-A-28 (EU885697)和土壤样品clone SGX-362 (EU590481)相近，序列相似度分别为94%和97%. L1样品OTU3，聚成Nitrososphaera subcluster 4.1簇，并且L1-OTU3与海洋沉积物样品clone OKR-C-9 (DQ148872)、 河口沉积物样品clone MX 4 JAN 14 (DQ500996)和盐沼沉积物样品clone SP 3H4 (EU925370)最相近，与这3条序列的相似度分别为89%、 87%和91%. L1样品OTU5和OTU7聚成Nitrososphaera subcluster 1.1这一簇，L1-OTU5和OTU7与土壤样品OTU clone SGX-650 (EU590639)、 生物膜样品clone RW-1 (AB525377)、 亚热带河流河口沉积物样品clone FR613AOA05 (GQ863088)和海洋潮间带样品clone 5 05 amoA (FJ227158)相近，其中OTU5与这4个参考序列的相似度为88%~90%，而OTU7与这4条序列的相似度在87%~91%. 第二簇Nitrosopumilus cluster中，L1样品OTU2和P4样品OTU1#，聚成Nitrosopumilus subcluster 5.2，L1-OTU2和P4-OTU1#与河口沉积物样品clone WBF071204 19E3 (FJ227693)、 土壤样品clone AOAdr-269 (GQ142642)、 热泉样品clone DHB-B2 (GQ226081)、 污水样品clone DI-2 (DQ278514)和淡水样品clone Arc-Jul-J7 (FJ951672)这5条序列相近，并且L1-OTU2和P4-OTU1#与这5条参考序列的相似度均为85%~95%.

图 4

Fig. 4

本研究序列已加粗，红色实心圆代表L1样品，蓝色实心三角形代表P4样品，OTU后括号内数字为属于该OTU的序列条数， 参考序列取自Genbank库，参考序列后括号内为提交序列号，最后的彩色字体为出现该序列的样品类型 图 4 AOA的邻接法系统发育树 Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on AOA amoA gene sequences

如表 3所示，L1样品AOA共有29条序列，Nitrososphaera cluster和Nitrosopumilus cluster分别占有13和16条，比例为44.83%和55.17%. 其中，Nitrososphaera cluster由Nitrososphaera subcluster 9、 subcluster 8.1、 subcluster 4.1和subcluster 1.1这4个亚簇组成，它们的比例依次为27.59%、 3.45%、 6.90%和6.90%(图 5)； Nitrosopumilus cluster仅包含Nitrosopumilus subcluster 5.2这一个亚簇，比例为55.17%(百分比指的是该簇中的序列数占全部测序数的比例). P4样品中，AOA也共有29条序列，但是这29条序列全部属于Nitrosopumilus subcluster 5.2这个亚簇.

图 5

Fig. 5

图 5 2个CANON污水处理系统中AOA的种群分布以及种群相对含量 Fig. 5 Distribution and relative abundance of phylogenetic AOA groups in two CANON systems

当前有关AOA的研究，多集中于海洋、湿地、河口和土壤等自然生态系统，对于以污水处理系统为代表的人工生态系统的研究相对较少，尤其是在CANON这种污水处理系统中，更是鲜有提及. Third等^[2]提出CANON工艺主要是由AOB和ANAMMOX菌这2类自养菌协同完成低氧脱氮，付昆明等^[21]在以陶粒为填料启动与运行CANON反应器的实验中也证实了这一观点.而本研究在CANON系统中不仅检测到AOA的存在，而且发现AOA的数量较高，达到10⁶ copies ·g^-1，揭示了AOA可能在CANON系统发挥着氨氧化的作用.

就AOA在其他污水处理系统中的作用而言，当前的研究认为：AOA和AOB相似，主要完成硝化作用的第一步，即将NH⁺₄-N氧化为NO^-₂-N. 而在CANON系统中，主要由2个反应完成脱氮，一是氨氧化微生物将NH⁺₄-N氧化为NO^-₂-N； 二是ANAMMOX菌将进水中剩余的NH⁺₄-N和氧化生成的NO^-₂-N转化为N₂^[22]. 一般认为前者由AOB完成，近期有研究指出AOA也可完成NH⁺₄-N的氧化，因此不难解释AOA在CANON系统中具有较高丰度的原因.

从上述反应可知，CANON系统中AOA与AOB、 ANAMMOX菌可能共同存在、 相互作用. 对于AOA与AOB、 ANAMMOX菌的具体关系，有学者探讨指出：AOA与AOB存在竞争关系，而且主要是针对O₂和NH⁺₄-N这两种底物的竞争； 而AOA和ANAMMOX菌既协作又竞争，一方面AOA耗氧完成氨氧化反应生成NO^-₂-N，为ANAMMOX菌提供底物并提供厌氧环境，两者协作； 另一方面，NH⁺₄-N是AOA与ANAMMOX菌共同的底物，两者竞争^[23]. 具体到本文的CANON系统而言，AOA与两者的关系，仍有待研究. 另外，AOA对于整个CANON系统脱氮中氨氧化相对贡献的大小，仍有待评定.

近期有人研究了污水处理系统中AOA的数量和种类. 就AOA丰度而言，在泰国一个市政污水厂检测到AOA的数量(以dry sludge计)为(5.70×10⁶±3.30×10⁵) copies ·mg^{-1[24]； 在香港一个处理含盐污水的连续流反应器中检测到AOA丰度(以DNA计)为101.33~104.06copies ·ng-1[25]； 在中国大陆和澳洲10个污水处理系统中，发现AOA的数量(以dry sludge计)在103~107 copies ·g-1[26]. 本研究中2个CANON系统中AOA的数量(以dry sludge计)为(2.67×105±1.16×105)~(1.26×107±6.50×105) copies ·g-1，AOA丰度较高，并且与前人在其他污水处理系统中发现的AOA数量相差不大.}

本研究中AOA种属Nitrososphaera cluster(即group I.1b)和Nitrosopumilus cluster(group I.1a)曾经在河口、 海洋、 土壤、 盐沼、 生物膜、 热泉、 污水和淡水等多种环境样品中出现(图 4)，可知这2类AOA广泛存在于各类生态环境中. 就AOA的多样性而言，在不同的污水处理系统中都检测到Nitrosopumilus cluster(group I.1a)和Nitrososphaera subcluster(group I.1b)这两大类群. 日本某小试反应器的污泥中检测到的AOA与Nitrosopumilus maritimus(group I.1a)具有较高的相似度^[27]，而Gao等^[26]研究了10个污水处理系统的AOA的种群数量和组成特征，发现AOA主要属于Nitrososphaera cluster(group I.1b，占75%的比例)和Nitrosopumilus cluster(group I.1a，25%的比例)这2大簇. 就本研究中AOA所占这2大类群比例来看(见图 5)，Nitrosopumilus cluster(group I.1a)为这两个CANON污水处理系统的共同优势菌，而Nitrososphaera subcluster(group I.1b)仅在L系统出现. 这一方面说明Nitrosopumilus cluster(group I.1a)在某些污水处理系统中为优势AOA种属； 另一方面也说明Nitrososphaera cluster(即group I.1b)和Nitrosopumilus cluster(group I.1a)是污水生物系统中普遍存在的AOA类群.

本研究中，L系统中生物膜的AOA数量大于污泥絮体； P系统中，生物膜和絮体污泥中的AOA数量均较多，污泥形态(聚集状生物膜和絮体活性污泥)影响着AOA的数量，并且同一形态的生物膜污泥(尽管不同的大小、 形状、 放置方式)AOA数量相差不大. 其可能的原因有：①两个CANON系统中生物膜和活性污泥絮体的种泥皆不同，不同种泥中AOA的含量不同，导致驯化后稳态污泥中AOA的数量不同； ②NH⁺₄-N是AOA氨氧化反应的底物，Wuchter等^[28]研究发现北海中的古菌amoA基因丰度与NH⁺₄-N浓度相关，本文两个CANON反应器氮负荷不同，可能导致AOA丰度不同； ③CANON工艺的一个重要的特点是溶解氧较低，而低溶解氧可能有利于AOA的生存^[29]，因此，CANON系统中有大量AOA存在，但是溶解氧与污泥形态及AOA之间的关系还需进一步深入研究.

(1)CANON这一特殊的污水处理系统中，AOA存在并且数量较大，均值达到4.76×10⁶ copies ·g^-1. L系统AOA多样性明显高于P系统：系统P中仅出现Nitrosopumilus cluster 5.2这一个亚簇，而L中出现Nitrososphaera subcluster 9、 subcluster 8.1、 subcluster 4.1、 subcluster 1.1和Nitrosopumilus subcluster 5.2这5个亚簇.

(2)在同一个CANON系统中，污泥形态不同，AOA丰度相差较大. 系统L中，生物膜样品AOA的数量约为污泥絮体样品的11.1~15.1倍； 而系统P中，污泥絮体AOA的数量约为生物膜的2.8倍.

(3)AOA在CANON系统中数量较高并且多样性丰富，推测AOA可能在CANON系统中发挥氨氧化的作用.

致谢： 北京城市排水集团有限责任公司科技研发中心的张亮博士以及邵和东等在采样时提供帮助，特此感谢！