因营养盐过量累积导致水体富营养化，其外在表现就是蓝藻水华的周期性、大规模暴发^[1]，成为当前重要的水环境问题.蓝藻水华大量聚集死亡引起的藻源性黑水团等现象^[2]，使得其对水质污染产生了质的变化.因此，只有快速、有效地去除水体中过量的氮磷营养盐，才能从源头上控制蓝藻水华的发生.在多种治理措施中，控制性种养生长和扩繁能力快、适应性强且生物量大、易于机械化打捞的以凤眼莲为代表的漂浮植物，进行污染水体的生态治理，成为当前水体生态修复的热点^{[3, 4, 5]}，其实际治理效果也显现出明显的水质净化功能.然而，在没有完全控制住水体及内源氮磷负荷的情况下，蓝藻水华仍然是周期性、规模性发生，而且藻华发生期间正值温度高(气温大于25℃)、光照强烈的夏季.此时水华细胞聚集后将会因水体溶解氧耗尽而快速死亡、分解.在研究逆境胁迫对水生植物的影响时，多采用沉水植物作为研究对象^{[6, 7]}.然而，在实际较大水体的生态治理中，采用以凤眼莲为代表的漂浮植物进行水体治理，具有更大的灵活性、显著的治理功效.因此，采用以凤眼莲为代表的漂浮植物对藻华不同聚集程度下的应答响应，可以更为全面了解藻华聚集对水生植物生长的影响.本研究采用模拟实验研究在较高温度(气温大于25℃)、藻华的不同堆积程度下，以凤眼莲为代表的水生植物叶绿素和光合作用对外界的胁迫作用产生的应答响应.通过本研究的结果，探讨蓝藻水华聚集后植物生长乃至消亡原因，以期为降低蓝藻聚集不良影响、强化利用以凤眼莲为代表的水生植物修复污染水体和水质净化效果提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 实验设置

本实验在江苏省农业科学院温室大棚内的400 L的大塑料周转箱内开展，其编号为1~9，其中1~3号为处理实验1，4~6号为处理实验2，7~9号为对照.实验水体采集于江苏省农业科学院的2号池塘，该池塘的上游来水主要是生活污水(实验区水体水温不低于25℃).然后盛放在周转箱内，周转箱底部预先放入过筛的10 cm厚、采自2号塘中的底泥.待水体注入周转箱10 d后，开始放入规格一致、生长健壮的凤眼莲植株，凤眼莲为单株、带有8片新鲜叶片、白色须根的绿色健壮植株，静置10 d后，待凤眼莲适应水体、开始正常生长后，放入从合肥巢湖十五里河口处采集的新鲜藻体.放入前预先用浮游植物生物网过滤掉流动的水分，然后用百分之一天平称量后，处理1中蓝藻细胞加入量为60 g ·L^{-1[8, 9]} (每g新鲜藻体中含有藻细胞数量为2×10⁸个，与2007年无锡发生藻华黑水团而引起供水危机时的藻密度相同)，处理2中蓝藻加入量为120g ·L^-1，以模拟蓝藻水华不同聚集程度以及发生藻源性黑水团时其对凤眼莲的影响； 对照实验不添加，每个处理3个平行.在蓝藻大量死亡、水体发黑后，凤眼莲生长无明显变化时视为植物受到的损伤为不可逆的，结束实验； 实验共持续两周时间. 1.2 样品采集 1.2.1 基本指标测定

实验开始后，用便携式水质监测仪YSI测定水体基本参数[主要测定指标为水温、水体溶解氧(DO)、水体酸碱度(pH)、水体氧化还原电位(ORP)及水体电导率(EC)].每3 d采集一次植物样品和水体样品，然后带回实验室进行处理.采集完好植物顶生叶片4片，无折叠地放入自封袋中用细线缠好，立即置于液氮罐中，留作测定叶绿素浓度. 1.2.2 水体营养盐含量测定

采集的水体样品带回实验室后，采用GF/C滤膜过滤后，用过硫酸钾消解法测定DTN、DTP含量^[10]； 用GF/C滤膜过滤后的水样用注射式流动分析仪测定水体中PO^3-₄-P、NH⁺₄-N含量. 1.2.3 叶片叶绿素浓度测定

参照李合生^[11]的实验方法，在实验室中，取出无折叠、无破损的叶片，用直径为0.6 cm的打孔器打出叶圆片5片，放入10 mL 96%乙醇溶液中，密封，暗处浸提叶绿素.每个处理重复3次.待浸泡48 h后，再以参比作为对照，用紫外分光光度计在665 nm和649 nm波长处测其吸光值，求得叶绿素的浓度，并代入公式求出叶绿素a、叶绿素b的浓度.

采用美国LI-COR公司生产的LI-6400型便携式光合测定仪，开放系统使用红蓝光源测定，光量子密度为1 600 μmol ·(m² ·s)^-1，流速设为500μmol ·s^-1，室外测定条件为自然晴天上午09:00~11:00当地光温条件，在相同的时间，用LI-6400型光合仪测定供试材料5片不同叶位叶片的净光合速率^[12]. 1.3 数据分析

用Excel 2007对数据进行初步处理，然后应用SPSS 18.0和Origin 8.0进行数据分析和图件绘图. 2 结果与讨论 2.1 藻细胞聚集后水体基本指标变化

藻华细胞聚集后，很快消耗掉水体中溶氧[图 1(a)、1(c)]. 在本实验中，表现为在藻细胞聚集后2 h内就完全消耗掉水体中的溶解氧，植物根区水体中溶解氧从2.6 mg ·L^-1 下降为不超过0.2 mg ·L^-1，随后水体中溶氧浓度持续保持较低浓度而呈现缺氧现象.在较高气温(>25℃)[图 1(b)]作用下，藻细胞出现快速死亡、腐解现象，导致水体缺氧现象更为严重，实验进行1 d后，处理1、2根区水体中氧化还原电位(Eh)从初始的200 mV分别下降为28.3 mV、-135.9 mV； 在实验进行到第5d时达到最低值，处理1、2根区水体中Eh分别为-216.5 mV、-251.0 mV. 实验中发现处理1、2的植物根系开始大量发黑、发臭、枯死，同时开始大量脱落.随后处理1中根区水体中Eh缓慢增加，至实验结束时根区Eh增加了91 mV，同时也发现处理1中植物根部开始长出大量的白色嫩根系，表明此时在处理1的藻华聚集程度下(藻细胞添加量为60 g ·L^-1，新鲜藻体)，凤眼莲抵消藻华细胞前期的不良影响后又慢慢恢复了继续生长的能力. 处理2中根区水体的Eh值呈持续降低的变化趋势，直至实验结束其含量为-199.9 mV.且此时处理2中植物大部分叶片呈现干枯、焦黄、发蔫的状态，根系发臭、须根基本脱落掉，表明处理2中植物在此种藻华聚集程度(藻细胞添加量为120 g ·L^-1，新鲜藻体)下的长期不良环境影响下受到不可逆的毒害作用，植物开始死亡.

图 1

Fig. 1

图 1 藻细胞聚集后水体中DO、WT、Eh变化 Fig. 1 Changes of DO,WT,Eh concentration in aquatic plant after algae cells gathered

藻华聚集、死亡并腐解后，细胞内含物会释放到周围水体中，从而会显著增加水体中N、P等的含量.在本实验中，藻华细胞聚集后，水体中N、P含量均呈现快速增加的变化趋势[图 2(a)、2(b)].水体中溶解性TN、TP(总溶解性氮DTN、总溶解性磷DTP)含量在藻细胞聚集后不久即出现快速增加，随后呈现持续增加趋势，至实验结束时，处理1、2中DTN含量分别高达44.49 mg ·L^-1、111.32 mg ·L^-1，同期对照组中为0.70 mg ·L^-1； 且处理2的变化率(增加量)要高于处理1的变化率，处理1、2的DTN的变化率分别为276%、470%，而同期对照实验中水体DTN的增加量为-39%(负值表示水体中DTN含量比初始值下降了39%).根区水体DTP的变化趋势同DTN，也表现其含量快速增加趋势，至实验结束时，处理1、2中DTP 含量分别高达2.57 mg ·L^-1、9.10 mg ·L^-1，对照组中为0.06 mg ·L^-1； 其变化率分别为49%、515%、-41%.处理2中水体DTN、DTP含量增加的幅度和变化量远高于处理1中水体的变化量，表明处理2中藻细胞的死亡分解速率要高于处理1，在处理2的藻华聚集程度下，水体将会出现更为严重的缺氧现象，根区水体呈现强还原状态，这种环境变化加之较高气温作用下反过来加剧了藻细胞的分解，导致大量细胞内含物释放到水体中，引起水体中DTN、DTP含量快速增加.

图 2

Fig. 2

图 2 藻细胞聚集后根区水体营养盐含量变化 Fig. 2 Changes of nutrient concentrations in root-zone water after algae cells gathered

藻细胞死亡后其腐解的大量细胞内含物会释放到水体中，植物根区水体中PO^3-₄-P、NH⁺₄-N含量变化趋势同水体中DTN、DTP的趋势[图 2(c)、2(d)].处理1、处理2中根区NH⁺₄-N含量在实验进行3 d后，其含量分别高达15.90 mg ·L^-1、21.18 mg ·L^-1，对照组中水体中NH⁺₄-N含量为0.17 mg ·L^-1； 随后处理1中NH⁺₄-N开始下降，至实验结束时高达32.99 mg ·L^-1、51.22 mg ·L^-1，分别为对照组的根区水体的54倍和84倍.水体中PO^3-₄-P含量也出现急剧增加现象，在实验进行3 d后，处理1、2中的含量高达1.41 mg ·L^-1、5.28 mg ·L^-1，同期对照组其含量仅为0.038 mg ·L^-1.随后其含量持续增加，至实验结束时，处理1中含量呈现下降趋势，含量为1.45 mg ·L^-1，而处理2中继续增加，含量高达5.64 mg ·L^-1.快速死亡、腐解的藻细胞导致水体呈现强还原、缺氧环境，处理1的植物在抵消掉初期藻细胞聚集后引起的水环境恶化后，长出的新根又可以重新吸收、利用藻细胞释放的丰富营养成分； 在处理2中植物无法抵抗藻细胞聚集引起的不良环境，藻细胞死亡后释放大量的PO^3-₄-P、NH⁺₄-N于水体中，对植物根系产生毒害作用，导致植物生长的生态环境恶化，植物会因外界恶劣的环境而死亡.

蓝藻在厌氧条件下出现快速分解，其死亡后形成大量的有机碎屑，分解时可释放大量营养盐和有机物，一部分沉积到底泥中，一部分会变成溶解性而存留在水体中，可供给藻类等浮游植物生长.相关研究表明，蓝藻碎屑分解速率很快(0.072~0.271 d^-1)，氮磷释放到水体中，不但导致水体中N、P含量急剧增加^[13]，且有可能引发“黑水团”现象致使水体发黑、发臭^{[14, 15]}，不但影响水体感官变化，对水体污染产生质的变化，且可能造成水源地的供水危机^[16].藻华堆积密度可影响蓝藻衰亡时营养盐释放过程，随堆积密度增大，营养盐释放速率和释放量增加^[16]，这与本研究实验结果同.由于在厌氧条件下，大量的含氮化合物分解后以氨氮形态释放，导致植物根区水体中NH⁺₄-N含量快速升高； 而尚丽霞等^[18]研究发现，在厌氧条件下溶解态有机氮逐渐降解为无机氮，且以铵态氮为主.表明在厌氧分解下，水体产生大量的NH⁺₄-N将会对植物根系产生毒害，从而对植物造成伤害.实验中也发现，处理1、2中根系会大量死亡、脱落. 2.3 藻华细胞聚集后叶片中叶绿素浓度变化

光合色素是绿色植物进行光合作用的主要色素，其含量在一定程度上能反映植物同化物质的能力.光合色素指标是植物重要的生理指标，而环境胁迫会对光合色素含量产生严重影响.在本实验中，叶片叶绿素a、b含量在藻细胞聚集后呈现快速增加、随后下降的变化趋势(图 3).在实验进行3 d后处理1、2中叶片的叶绿素a含量均增加到1.31 mg ·g^-1、1.06 mg ·g^-1，叶绿素b含量高达0.54 mg ·g^-1、0.42 mg ·g^-1，达到实验中的最高值，同期对照组中叶片的叶绿素a、b含量为0.66 mg ·g^-1、0.36 mg ·g^-1； 随后叶绿素a、b含量开始缓慢下降，与对照中叶片的叶绿素a、b含量持平，至实验结束时，处理1、2中叶绿素a含量分别为0.98 mg ·g^-1、0.83 mg ·g^-1，叶绿素b含量分别为0.40 mg ·g^-1、0.39 mg ·g^-1，同期对照组叶片叶绿素a、b含量分别为0.83 mg ·g^-1、0.39 mg ·g^-1.此时处理2中植物叶片已经出现发黄、干枯现象，仅顶生叶片呈现绿色.叶绿素a/b比值呈现类似的变化趋势，表现出随藻细胞聚集程度的加重，其比值产生较大的变化.表明在藻华细胞聚集后，植物叶绿素受到逆境条件的不良影响产生了应答反应.

图 3

Fig. 3

图 3 藻细胞聚集后植物叶绿素变化 Fig. 3 Changes of chlorophyll in plant leaves after algae cells gathered

叶片中胡萝卜素含量表现出在实验初始阶段快速增加的趋势，在实验前3 d，处理1、2和对照组中胡萝卜素含量从0.069、0.065和0.058 mg ·g^-1增加为0.15、0.13和0.13 mg ·g^-1.随后处理1、2中的含量呈现不规则的变化，至实验进行第6 d处理1中胡萝卜素含量快速下降为0.09 mg ·g^-1，随后增加.至实验结束时，处理1、2中含量分别为0.12 mg ·g^-1、0.11 mg ·g^-1，同期对照叶片中胡萝卜素含量增加为0.15 mg ·g^-1.韦凤杰^[19]对不同生育期烤烟叶片中胡萝卜素含量的变化进行研究，发现上部叶片在发育后期含量增高.在本实验中发现处理1、2中含量反而下降，可能是受到因藻细胞聚集形成的不良环境影响而引起的.

有研究学者认为环境胁迫会导致植物叶片叶绿素浓度下降，因为叶片水分运输的障碍影响了叶绿素的合成，且促进已形成的叶绿素加速分解，即叶绿素减少合成和加速分解是叶绿素浓度在环境胁迫下降低的主要原因^[20]； 但也有研究表明，叶绿素浓度随着胁迫增强而呈增大趋势，李芳兰等^[21]认为干旱胁迫下叶绿素量增加可能与叶片含水量减小有关，因为叶片浓缩导致单位面积叶绿素浓度增加，以此保证植物对光能的充分利用，维持一定的光合速率； 也有研究认为是植物叶片叶绿素与叶绿体蛋白间的结合变得松弛，松弛叶绿素容易被提取，导致植物在逆境胁迫下叶绿素浓度增加^[22].但在逆境胁迫下，植物叶片面积伸展比叶片结构成分更易受到影响^[23]，新叶的展开速度和叶片的增长速度都减慢，叶面积变小、叶肉增厚、叶绿体收缩，且植物叶片含水量下降，导致叶绿素浓度增加，产生相对的“浓缩”效应^{[24, 25]}.功能叶片光合色素含量在短期(3 d)胁迫下升高，但随后就开始下降，表明叶片光合色素含量受逆境胁迫后，其功能受损、部分分解后，造成其含量下降^[26].

胡萝卜素可吸收叶绿素吸收剩余的光能，又是内源抗氧化剂.当叶绿素分子接收光能变为激发态时，如果能量不能传递出去或用于化学反应，则激发态的叶绿素分子会与分子氧反应，形成非常活跃的激发态氧，也即单线态氧； 单线态氧会与多种细胞组分，特别是膜脂起反应破坏光合膜^[27]； 而胡萝卜素分子则会接受过剩的激发态叶绿素分子的能量，从而避免形成单线态氧，起到保护作用； 其在细胞内可吸收剩余光能、淬灭活性氧，防止细胞膜脂过氧化，保护光合机能^{[11, 28]}.在本实验中，胡萝卜素含量先升高、后降低，表明在藻细胞聚集后、产生环境胁迫后，为去除活性氧而产生应答反应，其含量表现为先增加、后降低. 2.4 藻细胞聚集后植物光合作用能力变化

由于光合作用是植物生长发育的基础，它为植物的生长发育提供所需的物质和能量^[29]； 外界胁迫作用会对植物产生伤害作用，抑制生长发育和限制光合作用，从而限制作物产量的提高^[19].叶片某一时刻的光合能力是其形成时间(季节)和叶龄的综合反映，但叶片结构和生理的发育进程与叶龄紧密相连^[20]. 在藻华细胞加入到凤眼莲生长的水体2 d后，凤眼莲叶片的光合能力呈现下降趋势，其下降的幅度与蓝藻细胞加入量成正相关关系[图 4(a)]，尤其是处理2在实验3 d后降为25.35μmol ·(m² ·s)^-1，在实验进行到5 d后，叶片的光合作用能力下降得更为明显，处理1和处理2的叶片光合能力为25.48μmol ·(m² ·s)^-1、15.76μmol ·(m² ·s)^-1，处理2叶片光合能力仅为对照组的65%.随着藻细胞死亡、缺氧持续和胁迫的加重，此后处理2的叶片光合能力一直呈现下降趋势，且在实验进行5 d后，部分凤眼莲开始死亡，表现为叶片发焦、枯黄； 实验结束时其光合能力仅为3.95μmol ·(m² ·s)^-1，为对照实验组的35%，而藻华细胞添加量为60g ·L^-1的处理1中，其光合能力呈现出先下降、后增加的变化趋势，这是因为在前期藻细胞的胁迫作用，导致其光合作用能力降低^[30]； 这可从胞间CO₂浓度变化数值得到验证^[31].但在藻华细胞死亡、分解后，植物抵消了这种不良影响后，又重新恢复到以前状态，光合作用能力呈正常状态^[32].

图 4

Fig. 4

图 4 藻细胞聚集后植物光合能力变化 Fig. 4 Changes of photosynthesis in aquatic plant after algae cells gathered

加入藻华细胞3 d后，叶片气孔导度出现明显下降趋势，处理1、2中由初期的0.82μmol ·(m² ·s)^-1、0.83μmol ·(m² ·s)^-1降低为0.68μmol ·(m² ·s)^-1、0.52μmol ·(m² ·s)^-1，同期对照组中为0.78μmol ·(m² ·s)^-1，表现出藻细胞聚集越严重，其对植物的胁迫作用越明显[图 4(b)].实验继续到第5 d时，处理2中叶片的气孔导度急剧下降，为0.19μmol ·(m² ·s)^-1，仅为同期对照组的21.4%.叶片的气孔导度下降，会导致胞间CO₂含量、叶片蒸腾速率均出现下降^[31].

逆境胁迫对植物的危害是多方面的，包括渗透、离子运输、细胞内离子平衡等，是植物的光合速率下降、生长受到抑制、加速衰老^[33].植物光合性能的好坏最终影响植物生长、产量和质量，叶绿体是植物光合作用场所，也是对环境胁迫最敏感的细胞器^[34].在本实验中，植物叶片光合能力表现出在实验进行3 d后就开始出现明显下降现象，且随着胁迫程度加重、光合能力下降越严重的趋势，处理1中叶片的光合能力在后期开始增加、恢复到实验初始水平，

实验中也发现此时植物叶片长势较好、根部长出许多白色嫩根，表明在处理1的藻细胞聚集水平下，漂浮植物凤眼莲可以抵消短期内的逆境胁迫.但在处理2的藻细胞聚集程度下，叶片的光合能力持续下降，气孔导度也表现出类似的变化，至实验结束时，叶片的光合能力、气孔导度分别为3.95μmol ·(m² ·s)^-1、0.088μmol ·(m² ·s)^-1，分别下降了86%、89%(图 4)； 且植物叶片基本表现为干枯现象，根系死亡、脱落，无白色新根生出.表明在此种藻细胞聚集下，植物无法抵消这种不良环境影响，植物内部组织受到伤害而开始死亡.

对水体理化环境因子(选取WT、DO、ORP、DTN、DTP、PO^3-₄-P、NH⁺₄-N等)与水体光合作用

相关指标(叶绿素a、叶绿素b、叶片光合能力、叶片气孔导度等)进行相关性分析，分析结果表明(表 1)，叶片叶绿素a、b的变化与水体PO^3-₄-P含量显著正相关，但与水体中DO、ORP含量显著负相关(P<0.5).叶片光合能力、气孔导度变化与水体中DTN、DTP呈极显著负相关，与水体中DO、ORP含量正相关性较好.这也表明叶片气孔导度和光合能力受水体理化环境条件影响较大，水体中较高的WT、DO、ORP水平有利于提高叶片光合能力和气孔导度，但水体中较高的DTN、DTP、PO^3-₄-P、NH⁺₄-N含量会显著抑制叶片光合能力和气孔导度.这也表明藻华细胞衰亡、分解后释放的大量营养盐将会对凤眼莲叶片产生严重的不良环境影响.

表 1(Table 1)

表 1 水体理化环境因子与叶片叶绿素、光合能力和气孔导度的相关性分析1) Table 1 Correlations between water environmental factors and chlorophyll,Pn and Gs WT DO ORP DTN DTP PO3-4-P NH+4-N 叶绿素a -0.444 -0.856 -0.764 0.405 0.429 0.783 0.495 叶绿素b -0.155 -0.779 -0.635 0.286 0.155 0.617 0.617 光合能力 0.603 0.651 0.809 -0.987** -0.927* -0.697 -0.697 气孔导度 0.529 0.849 0.944* -0.944** -0.871* -0.816 -0.816 1)*表示在0.5水平上显著相关； **表示在0.01水平上显著相关

表 1 水体理化环境因子与叶片叶绿素、光合能力和气孔导度的相关性分析1) Table 1 Correlations between water environmental factors and chlorophyll,Pn and Gs

(1) 在较高水体温度(>25℃)作用下，藻华聚集后会在2 h内消耗掉水体中溶解氧，藻华细胞开始死亡、腐解，形成厌氧(<0.2 g ·L^-1)、强还原(<-200 mV)的不良环境，对植物根系产生胁迫作用.

(2)藻细胞分解后，会释放大量营养盐到水体中，使得处理1、2的根区中DTN含量分别高达44.49 mg ·L^-1、111.32 mg ·L^-1，DTP含量2.57 mg ·L^-1、9.10 mg ·L^-1，NH⁺₄-N含量32.99 mg ·L^-1、51.22 mg ·L^-1，较高的营养盐含量(尤其是高NH⁺₄-N)将对植物根系产生毒害作用.

(3)植物在受到逆境胁迫影响后，植物的光合作用发生显著变化，至实验结束时处理2中的光合能力、气孔导度分别下降为3.95μmol ·(m² ·s)^-1，0.088μmol ·(m² ·s)^-1，分别为对照的0.18倍、0.11倍.表明在超过植物抗逆能力后，植物根系死亡、光合功能受损，造成植物营养输送功能障碍而枯萎，这也表明藻华聚集而产生的逆境条件持续胁迫是导致植物死亡的主要原因.

致谢： 在样品采集、分析过程中得到顾东祥博士、石祖良博士、孙国峰博士给予的大力帮助和指导，在此表示感谢.