水环境中内分泌干扰物质的污染及其引起的生态健康效应^{[1, 2]}，特别是通过干扰性激素信号通道引起发育繁殖异常^{[3, 4, 5, 6, 7]}，是过去20年国际上关注的热点问题. 随着研究的深入，科学家们发现一些具有激素活性的合成药物和个人护理品等进入环境水体同样可能会影响其他激素受体(如糖皮质激素受体)相关的生命/生理活动. 最新的研究结果显示糖皮质激素效应物质可能普遍存在于环境水体中，并且可能已经达到了对人类和水生生物造成负面影响的水平^{[8, 9]}. 然而，与雌激素等性激素的环境行为研究^{[10, 11, 12, 13]}相比，糖皮质激素及其合成药物在环境水体中的浓度水平、 来源分布和迁移转化等研究还非常有限，其中一个重要原因就是缺乏识别和定量检测复杂环境介质中该类物质的高灵敏分析方法.

糖皮质激素是一类重要的内分泌激素，几乎参与了人类和动物所有的生命活动^{[14, 15]}. 鉴于其重要的生理功能，大量的糖皮质激素合成药物(30种以上)被广泛应用于人类医疗和兽药使用^{[16, 17, 18, 19, 20, 21]}，而且由于极性较强和不易吸附于生物体的特点，糖皮质激素药物的50%~90%很快随着尿液和粪便排出体外，进而通过各种途径进入环境，通常在ng ·L^-1级别或者甚至更低的浓度水平. 由于糖皮质激素药物结构非常类似，其导致的毒性往往是其混合物共同作用的结果，所以尽可能多的展现这类污染物的环境含量组成特征非常必要，特别是一些生物效应强的药物化合物，即使环境浓度相对较低也可能对生物造成不容忽视的毒性效应. 但是目前关于糖皮质激素的环境分析方法还主要集中于氢化可的松、 可的松、 泼尼松龙、 泼尼松、 地塞米松和甲泼尼龙等几种化合物^{[22, 23, 24, 25, 26, 27]}. 一些药效或激素效应更强的卤代药物化合物(如氟米松、 曲安西龙、 曲安奈德、 倍氯米松、 氟米龙和丙酸氯倍他索)，以及一些更加常用的易转化的酯化前体药物(如醋酸氟氢可的松、 醋酸可的松、 醋酸氢化可的松和醋酸地塞米松)等更广泛的糖皮质激素很少包括在内. 因此，本研究针对18种糖皮质激素物质，包括6种卤代药物和4种酯化前体药物，应用固相萃取技术结合超高效液相色谱串极质谱联用系统(ultra performance liquid chromatography-tandam mass spectrometry，UPLC-MS/MS)，建立高灵敏同时分析方法，并应用于北京市地表水体，初步调查糖皮质激素的浓度水平及其组成特征，以期为后续的环境行为和风险评估研究奠定基础.

ACQUITY^TM超高液相色谱仪，Micromass-Quattro Ultima^TM Pt质谱仪(Waters公司，美国)，MassLynxV4.1软件； N-EVAP^TM 116氮吹仪(Organomation公司，美国)，Oasis HLB固相萃取柱，玻璃纤维滤膜(GF/C，1.2 μm孔径，Whatman公司，英国)； 甲醇、 乙酸乙酯和乙腈(色谱纯，Dikmapure公司)，甲酸和乙酸(纯度为99%，Acros Organics公司)，实验用水均为超纯水(电阻率18.2MΩ ·cm，Millipore公司超纯水器制备).

糖皮质激素标准样品：醛固酮(aldosterone)、 泼尼松(prednisone)、 可的松(cortisone)、 氢化可的松(cortisol)、 泼尼松龙(prednisolone)、 氟米松(flumethasone)、 地塞米松(dexamethasone)、 曲安西龙(triamcinolone)、 醋酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、 曲安奈德(triamcinolone acetonide)、 甲泼尼龙(methylprednisolone)、 倍氯米松(beclomethasone)、 醋酸可的松(cortisone acetate)、 醋酸氢化可的松(cortisol acetate)、 氟米龙(fluorometholone)、 醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)、 布地奈德(budesonide)、 丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)(所有标准品纯度均大于或等于98%，sigma公司). 皮质醇激素同位素内标为cortisol-d4，来自于C/D/N Isotopes(Montreal，加拿大). 18种糖皮质激素结构如图 1所示.

糖皮质激素标准储备液及工作液的配制：分别称取标准糖皮质激素样品各10.0 mg用甲醇溶解后转移至10 mL棕色容量瓶，用甲醇定容后于-20℃下保存. 待使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的标准液.

于2014年8月在北京地区采集5个地区地表水样品，置于棕色玻璃瓶中运回实验室，并在6 h内萃取富集. 为避免固相萃取柱的堵塞，1.5 L水样首先经过玻璃纤维滤纸过滤，之后添加最终浓度为100 μg ·L^-1过程内标(cortisol-d4). HLB固相萃取柱依次用6 mL乙酸乙酯、 6 mL乙腈和12 mL超纯水活化，水样以5~10 mL ·min^-1的流速通过活化的HLB柱，待水样全部通过固相萃取柱后，用10 mL超纯水淋洗SPE柱，并用氮气吹干以除尽柱内的水分. 最后用6 mL乙酸乙酯/乙腈(1 ∶1，体积比)洗脱HLB柱，收集洗脱液用微弱氮气吹干，用100 μL甲醇重新溶解定容、 待测.

超高液相色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY^TM BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm，Waters公司，美国)； 柱温：40℃； 样品温度：4℃； 进样体积：3 μL. 流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%(体积分数)乙酸的水溶液，洗脱程序如下：0~6 min，A：35%→45%； 6~12 min，A：45%→ 80%； 12~15 min，A：80%→ 95%； 15~15.1 min，A：95%→ 35%.

质谱条件离子源为电喷雾电离采用ESI(-)模式，毛细管电压：3.00 kV，射频透镜1(RF lens 1)电压：27.0 V，射频透镜2(RF lens 2)电压：0.0 V，离子源温度：100℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流量：600 L ·h^-1，碰撞梯度：2.0，采用多选择反应监测转换模式(MRM). 18种糖皮质激素的质谱分析参数如表 1所示.

由于糖皮质激素目标化合物种类较多，且在环境中的浓度经常在几个ng ·L^-1甚至更低的水平，最佳化UPLC-ESI-MS/MS方法、 提高检测灵敏度和特异性对于这类目标化合物的环境识别显得尤为重要. 对于ESI-MS/MS，不同的离子化模式、 流动相组成会促使目标化合物产生不同的分子离子峰及其信号响应情况. 本研究中，对比正、 负离子模式下，甲醇/水、 甲醇/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%乙酸水不同流动相组成条件下分子离子峰的一级质谱全扫描结果，发现负离子模式下，甲醇/0.1%乙酸水流动相条件下形成的目标激素乙酸加合物[M+CH₃COO]^-响应信号最高，选择作为本研究的分子离子； 添加甲酸的流动相也形成目标激素的甲酸加合物[M+HCOO]^-，但是相应的响应信号比乙酸低2~3倍(如醋酸氟氢可的松添加甲酸情况下的信号强度只有后者的33.58%)； 在正离子模式下，目标激素除了形成[M+H]⁺，由于Na⁺无处不在还产生了大量[M+Na]⁺竞争离子，大大降低了[M+H]⁺的响应信号^[28].

图1

Fig. 1

图1 18种目标糖皮质激素的化学结构 Fig.1 Chemical structures of 18 target glucocorticoids

碰撞能量是影响目标物质分子离子产生碎片离子最重要的MS/MS参数. 在2~18eV碰撞能量范围内，本研究得出每个目标物质响应最高的两个碎片离子，具体见表 1. 在18种目标物质中，泼尼松、 可的松、 氢化可的松、 泼尼松龙、 氟米松、 地塞米松、 曲安西龙、 甲泼尼龙、 倍氯米松这9种糖皮质激素响应最高的碎片离子是[M-H-CH₂O]^-，其次是[M-H]^-； 这2个碎片离子是[M+CH₃COO]^-在C-17位置上失去CH₃COOH、 C-21位置上失去CH₂O而形成. 对于C-21羟基取代位置被乙酸酯化的醋酸氟氢可的松、 醋酸可的松、 醋酸氢化可的松和醋酸地塞米松这4种糖皮质激素，响应最高的碎片离子都是[M-H]^-，而用于辅助定性的碎片离子分别是[M-H-H₂O]^-、 [M-H-CH₂CO-H₂O]^-、 [M-H-CH₂CO-H₂O]^-和[M-H-CH₂CO-CH₂O]^-(如图 2)，主要由于基团脱水形成或者来自C-21位置的酯基断裂； 尽管4种乙酸酯化糖皮质激素也形成[M-H-CH₂O]^-，但是产生信号强度较弱，未被选作定性/定量离子. 醛固酮、 氟米龙和丙酸氯倍他索3种糖皮质激素响应最高的2个碎片离子也都包括[M-H]^-，醛固酮由于C-18位置上失去CO(相对分子质量28)，而后两种物质分别失去HF(相对分子质量20)和HCl(相对分子质量36)形成定量/定性离子. 对于曲安奈德和布地奈德，根据碎片离子扫描的结果，它们响应最高的碎片离子分别为[M-H-C₂H₄-CH₂O]^-和[M-H-C₃H₆-CH₂O]^-，主要来自于C-16、 C-17位置上的C₂H₄(相对分子质量28)和C₃H₆(相对分子质量42)以及C-21位置上的CH₂O(相对分子质量30)，辅助定性碎片离子则是继续失去H₂O (相对分子质量18)而形成的离子. 值得注意的是，不同品牌的质谱、 不同类型的离子源以及不同优化条件都可能导致同一目标物质的分子离子、 定量/定性碎片离子结果不同. 如Herrero等^[28]运用Agilent公司生产的仪器在ESI(-)模式下，得到曲安奈德的定量和定性碎片离子为[M-H-HF]^-和[M-H-C₂H₆CO-HF-H₂O]^-，与本研究中明显不同.

表1(Table 1)

表118种糖皮质激素的质谱采集参数及其碎片离子类型 1) Table 1 MS/MS operating parameters for 18 target glucocorticoids 目标物质 保留时间/min 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压/kV 碰撞能量/eV 醛固酮 7.38 419.5 [M+CH3COO]- 359.3a [M-H]- 50 18 331.3 [M-H-CO]- 55 18 泼尼松 8.14 417.6 [M+CH3COO]- 327.1a [M-H-CH2O]- 45 12 357.4 [M-H]- 45 6 可的松 8.45 419.5 [M+CH3COO]- 329.3a [M-H-CH2O]- 55 15 359.3 [M-H]- 50 8 氢化可的松 9.16 421.6 [M+CH3COO]- 331.3a [M-H-CH2O]- 55 14 361.2 [M-H]- 50 8 泼尼松龙 9.19 419.5 [M+CH3COO]- 329.3a [M-H-CH2O]- 55 15 359.3 [M-H]- 50 8 氟米松 10.07 469.6 [M+CH3COO]- 379.3a [M-H-CH2O]- 45 12 409.3 [M-H]- 45 10 地塞米松 10.38 451.4 [M+CH3COO]- 361.3a [M-H-CH2O]- 50 16 391.2 [M-H]- 50 12 曲安西龙 10.42 453.4 [M+CH3COO]- 363.3a [M-H-CH2O]- 40 10 393.2 [M-H]- 45 11 醋酸氟氢可的松 10.49 481.5 [M+CH3COO]- 421.3a [M-H]- 45 9 403.2 [M-H-H2O]- 55 9 曲安奈德 10.55 493.4 [M+CH3COO]- 375.2a [M-H-C2H4-CH2O]- 55 14 357.1 [M-H-C2H4-CH2O-H2O]- 40 16 甲泼尼龙 10.57 433.5 [M+CH3COO]- 343.2a [M-H-CH2O]- 50 12 373.3 [M-H]- 60 9 倍氯米松 10.57 467.5 [M+CH3COO]- 377.2a [M-H-CH2O]- 45 11 407.2 [M-H]- 45 10 醋酸可的松 10.60 461.5 [M+CH3COO]- 401.3a [M-H]- 45 8 341.2 [M-H-CH2CO-H2O]- 45 16 醋酸氢化可的松 10.61 463.5 [M+CH3COO]- 403.3a [M-H]- 45 8 343.2 [M-H-CH2CO-H2O]- 45 12 氟米龙 10.91 435.5 [M+CH3COO]- 355.3a [M-H-HF]- 50 12 375.3 [M-H]- 50 12 醋酸地塞米松 11.50 493.5 [M+CH3COO]- 433.5a [M-H]- 45 8 361.3 [M-H-CH2CO-CH2O]- 45 14 布地奈德 12.40 489.5 [M+CH3COO]- 357.2a [M-H-C3H6-CH2O]- 55 13 339.2 [M-H-C3H6-CH2O-H2O]- 45 13 丙酸氯倍他索 12.82 525.5 [M+CH3COO]- 465.2a [M-H]- 40 10 429.2 [M-H-HCl]- 55 16 1)a表示该碎片离子为定量离子

表1 18种糖皮质激素的质谱采集参数及其碎片离子类型 1) Table 1 MS/MS operating parameters for 18 target glucocorticoids

图2

Fig. 2

图2 醋酸地塞米松在一定条件下形成的碎片离子的质谱图 Fig.2Mass spectrum of dexamethasone acetate

在确定每个目标物质的分子离子、 定性/定量碎片离子之后，分别对各种ESI-MS/MS参数进行优化，提高分析的灵敏度，具体见表 1及1.3节. 另外，流动相溶剂种类及其浓度比例对目标物质的电喷雾离子化效果和选择性也有重要影响. 利用乙腈/0.1%乙酸水和甲醇/0.1%乙酸水分别对18种目标糖皮质激素物质进行梯度分离，由于乙腈相对于甲醇在反相C18色谱分离柱的洗脱能力更强，黏度小、 柱压低，目标糖皮质激素在乙腈比例还比较低的情况下就被洗脱并ESI-MS/MS检测，导致目标物质灵敏度较甲醇为流动相溶剂低2~3倍(见图 3). 而且，尽管MS/MS在MRM模式下，根据每个目标物质各自不同的分子离子和定性/定量离子，即使在色谱没有有效分离的情况下也能特异检测分析，但是对于具有相同的分子离子和定性/定量离子的不同目标物质，比如本研究中的可的松和泼尼松龙，就需要色谱分离才能分别对其进行定量检测. 一些研究已经证明，乙腈作为流动相溶剂在C18反相色谱分离柱上很难将二者分离^[29]，本研究中尽管应用了超高效液相分离系统、 1.7 μm填料粒度高分离性能的色谱分离柱、 较低的流速和梯度条件(见1.3节)，二者仍然没有达到基线分离，甲醇则较容易将二者有效分离(见图 3). 因此，本研究中选择甲醇作为流动相中的有机溶剂.

图3

Fig. 3

图3 乙腈/0.1%乙酸水和甲醇/0.1%乙酸水流动相体系中18种糖皮质激素以及可的松和泼尼松龙分离效果的色谱图 Fig.3 MRM chromatograms of 18 glucocorticoids and cortisone, prednisolone in acetonitrile-0.1% acetic acid/water and methanol-0.1% acetic acid/water

18种目标糖皮质激素都是氢化可的松的衍生物，结构相近，因此，它们在色谱分离柱的保留行为也表现出典型的特征和规律(图 1和表 1)：首先出峰的是醛固酮，泼尼松，可的松、 泼尼松龙和氢化可的松5个目标物质，保留时间7.38~9.19 min，这5个物质与氢化可的松类似，具有共同的结构； 接着是氟米松、 地塞米松、 曲安西龙、 醋酸氟氢可的松、 曲安奈德、 甲泼尼龙、 倍氯米松、 醋酸可的松、 醋酸氢化可的松、 氟米龙和醋酸地塞米松这11个目标物质(保留时间10.07~11.50min)，由于在C-6、 C-9位置增加了甲基或在C-21位置连接了乙酸结构，降低了极性，增大了它们在色谱分离柱上的保留性能； 最后出峰的是布地奈德和丙酸氯倍他索2个目标物质，由于在C-16和C-17位置连接了直链丁酮和丙酸结构，显著降低了目标物质的极性，增大了保留时间. 关于18种目标物质的保留时间还可以再缩短，不过鉴于有机溶剂比例增加越快可能导致在分析复杂环境样品时基质的抑制越强烈，本研究建议尽量缓慢洗脱目标物质.

鉴于糖皮质激素的环境浓度很低，在UPLC-MS/MS检测分析前进行固相萃取富集和浓缩是必要的过程. 糖皮质激素是一类不易离子化的化合物，因此，调节pH值不会对这类物质的萃取产生重要影响. 本研究未调节水样pH值，选用比较广泛使用的Oasis HLB固相萃取小柱萃取，并考察了4种溶剂及其组合[甲醇、 乙酸乙酯、 乙腈及乙酸乙酯/乙腈(1 ∶1，体积比)]的洗脱能力. 在回收率结果中，除了乙酸乙酯对氟米松、 曲安西龙和倍氯米松这3个目标物质的回收效果略差(低于60%)，总的来说甲醇、 乙腈及乙腈/乙酸乙酯混合溶剂的回收率都很高. 从溶剂极性的角度讲，这3种溶剂的极性依次降低，洗脱下来的基质干扰物与之密切相关，鉴于糖皮质激素是一类极性较强的化合物，本研究选择乙腈/乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱溶剂. 另外仅从实际样品洗脱下来的溶剂颜色(甲醇洗脱液显示深黄色，乙腈次之，乙腈/乙酸乙酯混合溶剂颜色最浅)也表明，甲醇溶剂可能洗脱出更多的基质干扰物，乙腈/乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱溶剂更为合适.

配置混合标样1.0、 5.0、 10、 50、 100、 500、 1000 μg ·L^-1共7个浓度水平，所有目标糖皮质激素在此浓度范围内均具有良好的线性，相关系数(R²)均大于0.999. 为了进一步验证实际环境水样中18种糖皮质激素的回收率，在1.5 L采自北京地表水体的样品(n=3)中分别添加最终浓度为10、 50和200 ng ·L^-1的混合标样和100 ng ·L^-1的过程内标cortisol-d4，按照优化后的条件进行前处理并进行测定，所有目标物质的平均回收率在65%和108%之间，相对标准偏差(RSD)小于15%； 同时，将此水样分别在处理完当天和第2、 5、 7 d进行检测分析，每天平行进样3次，所有目标物质的检测结果标准偏差均小于10%. 按出峰信噪比(S/N)为3所对应的浓度水平计算，北京地表水体样品中18种目标物质的方法检出限(MDL)除醋酸可的松和醋酸氢化可的松(10ng ·L^-1)之外，其他均在0.10 ng ·L^-1(地塞米松)和1.0 ng ·L^-1(曲安西龙)之间.

将建立的分析方法应用于5个采集自北京地区的地表水样品，检测的结果见表 2. 图 4显示的是其中一个水样萃取液中检出的目标糖皮质激素的MRM-LC-MS/MS色谱图. 在18种目标糖皮质激素中，有8种(可的松、 泼尼松龙、 氢化可的松、 地塞米松、 曲安西龙、 曲安奈德、 醋酸氢化可的松和丙酸氯倍他索)被检出，浓度水平在0.20 ng ·L^-1(地塞米松)到476 ng ·L^-1(醋酸氢化可的松)之间，其中，可的松、 泼尼松龙、 氢化可的松和地塞米松的环境报道相对较多，本研究中检测到的浓度也与已有的报道类似，在几个ng ·L^-1或者稍低的水平^{[12, 24]}. 值得注意的是，本研究中第一次报道在地表水体中检出曲安西龙、 曲安奈德、 醋酸氢化可的松和丙酸氯倍他索，而且它们的浓度甚至会达到比较高的水平(醋酸氢化可的松：476 ng ·L^-1). 这一方面可能是因为糖皮质激素药物在不同国家和地区使用的种类和用量差异造成的； 另一方面，一些外用的酯化糖皮质激素(如醋酸氢化可的松)脂溶性好、 不易受酸影响，在水环境中稳定性要比非酯化糖皮质激素稳定，相对易于在环境中残留； 另外卤代糖皮质激素(如曲安西龙、 曲安奈德和丙酸氯倍他索)的生物活性或者药性比其非卤代激素更强，所以作为药物使用时用量要相对少，但是由于卤代糖皮质激素环境稳定性增强，它们在环境中也可能达到类似的浓度水平.

表2(Table 2)

表2 清河水体18种糖皮质激素的浓度水平 /ng ·L-1 Table 2 Concentrations of 18 glucocorticoids of Qing River in Beijing, China/ng ·L-1 物质 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 可的松 0.94 0.86 27 2.8 0.58 氢化可的松 0.29 0.46 13 n.d.1) 0.52 泼尼松龙 n.d. n.d. 1.4 n.d. n.d. 地塞米松 n.d. n.d. 0.71 0.77 0.20 曲安西龙 n.d. n.d. 57 15 2.5 曲安奈德 3.7 1.7 4.3 n.d. 0.89 醋酸氢化可的松 n.d. n.d. 476 55 n.d. 丙酸氯倍他索 n.d. 0.25 n.d. n.d. n.d. 1)n.d.表示未检出

表2 清河水体18种糖皮质激素的浓度水平 /ng ·L-1 Table 2 Concentrations of 18 glucocorticoids of Qing River in Beijing, China/ng ·L-1

图4

Fig. 4

图4 样品3萃取液中检出目标糖皮质激素的MRM-LC-MS/MS色谱图 Fig.4 MRM-LC-MS/MS chromatograms of detected glucocorticoids in the extract of Sample 3

本研究基于固相萃取技术结合超高效液相色谱串极质谱联用系统建立了同时检测地表水体中18种糖皮质激素的分析方法. 该方法的检出限除醋酸可的松和醋酸氢化可的松为10 ng ·L^-1外，其他均在在0.10 ng ·L^-1和1.0 ng ·L^-1之间.

对于实际的地表水样品，18种糖皮质激素的平均回收率为65%~108%，经过对北京市地表水体的检测分析，在5个采样点中共检测出8种不同浓度糖皮质激素的存在，本研究为获得更多糖皮质激素污染物的实际环境数据提供了有效的检测方法，有助于糖皮质激素的环境行为和风险的研究.