在一般的微污染原水中，通常会含有多种天然或人工合成的化学物质，其中包括目前广泛应用的纳米级人造物质. 纳米物质尺寸小，比表面积大，反应活性高，释放到水体中后纳米物质极易作为载体对水体中其它污染物质进行吸附，影响环境中已有污染物质的归宿^{[1, 2]}. 虽然这些污染物的含量很低，但在水处理工艺过程中，这些共存物质之间存在或可能存在复合污染效应，可能发生结构或形态转化而产生新的有毒有害副产物. 不同共存物质间的协同或拮抗作用将直接影响水质的健康风险评价.

C₆₀是目前被广泛应用的碳纳米材料之一. 纳米C₆₀具有强疏水性，难溶于水，但其进入水环境后能够形成稳定的C₆₀纳米晶体颗粒物^{[3, 4]}. 对C₆₀纳米晶体颗粒的水质风险研究表明，其对细菌、 水生生物、 细胞等都具有生物毒性^{[5, 6, 7, 8, 9]}. 随着工业发展，水体中的重金属污染日趋严重，对生态系统会造成生物毒性影响. Cu²⁺是常见的典型二价重金属污染物，与不同形态的P、 N均有联合毒性作用^{[10, 11]}. Cu²⁺能很快与羟基及羧基富勒烯达到吸附平衡，且符合Langmuir吸附等温线^[12]. 巨噬细胞是外来物侵入到动物体内的第一道防线，因而当纳米级颗粒物进入生物体内时，巨噬细胞会在第一时间对其进行吞噬. 而且巨噬细胞较易培养，已有较多研究以RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞作为受试物. 有文献指出纳米颗粒物，像是纳米银、 纳米金以及纳米硅等会在细胞内产生氧自由基从而对RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞产生毒性^{[13, 14, 15]}. 本文以RAW 264.7小鼠腹腔巨噬细胞作为受试细胞，研究nC₆₀和Cu²⁺复合体系的生物毒性.

纳米C₆₀(Mer Corporation,Tucson,AZ,99.9%)； 甲苯(上海凌峰化学试剂,≥99.9%)； 超纯水(Millipore 净水装置)； 高氯酸镁(国药集团,AR)，RAW 264.7(ATCC,TIB-71)细胞株购自中科院上海细胞所； DMEM高糖培养液、 胎牛血清、 胰酶、 青链霉素和10XPBS购自美国Gibco公司； WST-1 细胞活性检测试剂 (Cayman.Cat.NO.10008883)，无水硫酸铜购自国药集团，Cu²⁺标准样品购自国家标准样品网.

真空干燥箱(上海森信实验仪器,D2G-₆₀20)； 纳米粒度及Zeta电位分析仪(DelsaNano C,Beckaman coulter)，透射电子显微镜(JEM-2100)； 滤膜(Anotop 25 plus 0.22 μm,Waters)； 滤膜(Anodisc 13,0.02 μm,13 mm,Whatman)； 旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor System:Rotavapor R-215,Vacuum Controller V-850,Vacuum Pump V-700)； 超声清洗机(昆山禾创超器，KH-300DB)； 紫外-可见分光光度计(Mapada UV-1200). 100 mm细胞培养皿，6孔，96孔细胞培养板均购自德国Greiner公司； Thermo 8000二氧化碳细胞培养箱，Beckman AllegraTM X-22R高速冷冻离心机，Olympus CKX-41倒置显微镜，上海上净净化CA-920-3单人垂直流超净工作台，RT-2100C酶标分析仪，HILIP CM-120 高分辨率透射电子显微镜； NovAA350原子吸收分光光度计.

通过在Andrievsky等^[16]的制备方法基础上稍加改动，优化其配比条件，制备nC₆₀水溶液. 具体方法为：称取40 mg C₆₀，置于容器中与100 mL甲苯混合，然后将容器置于摇床上振荡12 h，使C₆₀ 完全溶解到甲苯当中，形成甲苯溶液. 确定C₆₀完全溶解后，再向容器中加入400 mL超纯水. 封口膜将瓶口密封，置于超声器(昆山禾创超器，KH-300DB)中超声(80 KHz)48 h，保持水温在50℃以下，使C₆₀逐渐从甲苯转移到水相中^[17,18]. 超声结束后，用旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor System: Rotavapor R-215,Vacuum Controller V-850,Vacuum Pump V-700)蒸发掉甲苯，然后使剩余混合液体通过0.22 μm滤膜(Anotop 25 plus 0.22 μm,Waters)，滤除未溶解C₆₀固体，得到黄色的nC₆₀纳米颗粒水悬液. C₆₀浓度测定参照Fortner等^[19]报道方法进行. 采用JEM-2100透射电子显微镜(TEM)对制备的nC₆₀进行外观表征，纳米粒度及Zeta电位分析仪(DelsaNano C,Beckaman coulter)对其粒径分布及表面电荷进行测定.

为排除甲苯残留的影响，利用超滤杯(超滤膜YM10，截留分子量,10000)反复过滤冲洗再悬浮，并采用GC/MS(日本津岛，QP2010)检测制备nC₆₀中甲苯浓度低于1 μg ·L^-1.

采用高糖DMEM细胞培养液培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7，加5%胎牛血清，1%的双抗. 快速复苏冻存的小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7细胞株，RAW 264.7属于贴壁细胞，制备成悬浮液分等份接种于100 mm细胞培养皿中，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱(Thermo 8000)中培养，待细胞生长活性符合实验要求，胰酶消化，进行相应的实验处理.

调整细胞浓度，接种2×10³个细胞于96孔板当中，细胞贴壁后，弃去上清原液，分别添加含不同浓度nC₆₀水悬液的新培养液，及不同浓度的Cu²⁺，每个剂量组设定4个平行孔. nC₆₀单独作用时的浓度按浓度梯度设置分别为0、 0.21、 0.83、 1.65、 3.3、 6.6和9.9 mg ·L^-1； Cu²⁺单独作用时浓度按浓度梯度设置为0、 0.5、 1、 2、 4、 10、 15、 20、 40和50 mg ·L^-1. 两者联合作用时的浓度分别设置为当nC₆₀浓度固定为3.3 mg ·L^-1和6.6 mg ·L^-1时，Cu²⁺浓度为0、 2、 5、 10和20 mg ·L^-1； 当Cu²⁺浓度固定为5 mg ·L^-1和10 mg ·L^-1时，nC₆₀浓度为0、 1.65、 3.3、 6.6和9.9 mg ·L^-1. 染毒12 h和24 h后，每孔添加20 μL WST-1溶液，细胞培养箱中继续培养2 h. 在RT-2100C酶标分析仪(RT-2100C)波长450 nm测定光密度D值.

C₆₀纳米晶体颗粒对铜的吸附等温线测定实验在25℃，150r ·min^-1的恒温振荡器中进行. 实验中设定nC₆₀浓度在1.8 mg ·L^-1,铜离子初始浓度分别设定在1、 2、 3、 4和5 mg ·L^-1. pH设为6. 吸附24 h后取样，20 nm膜滤(Anodisc 13,0.02 μm,13 mm,Whatman)，原子吸收分光光度计(NovAA350)检测铜离子浓度.

nC₆₀对重金属铜的吸附等温线以吸附容量q_e对铜离子被吸附后的平衡浓度c_e制得. 为了解nC₆₀对重金属铜的吸附过程，分别选取Langmuir吸附等温方程和Freundich吸附等温方程对其进行描述. Langmuir吸附等温方程式可用式(1)表示，式中，q_e为吸附容量； q_m为单位吸附剂的最大吸附量； c_e为铜离子被吸附后的平衡浓度； b为温度的函数.

根据式(2)中的1/c_e对1/q_e作图，可得nC₆₀对铜离子的Langmuir吸附等温线. Freundich吸附等温方程式可用式(3)表示，其中k和n为一定温度下的常数. 根据式(4)中的lgc_e对lgq_e作图，可得nC₆₀对铜的Freundich吸附等温线.

对每组数据进行组内显著性差异检验，检验方法为单因子方差分析； 同时还对每组平行样数据进行方差同质性检验，使用最小显著差异法，所有数据分析采用SPSS 18.0统计分析软件进行.

采用JEM-2100型透射式电子显微镜(TEM)对新制备的nC₆₀(13.2 mg ·L^-1)进行外观表征. 透射电子显微镜成像结果如图 1所示，nC₆₀颗粒的单体大多呈现圆形，粒径分布比较均一[图 1(a)]，且有聚集成颗粒粒径更大的团块出现，颗粒重叠聚集[图 1(b)]，粒径分布在几十nm至200 nm左右.

图1

Fig. 1

图1 nC60透射电镜表征 Fig.1 Characterization of nC60 by TEM

纳米粒度及Zeta电位分析仪测定结果显示，新制备的nC₆₀(13.2 mg ·L^-1)平均粒径为122.3 nm，平均Zeta电位为-45.24 mV，使nC₆₀纳米晶体颗粒能稳定悬浮在水溶液中^[20]，而不发生沉降. 由于一些nC₆₀纳米晶体颗粒表面电荷小，从而导致一些小的nC₆₀纳米颗粒聚集在一起，形成更大的聚集体[图 1(b)].

Jia等^[21]发现C₆₀在到达226.00 μg ·cm^-2的剂量下对肺泡巨噬细胞存在细胞毒性，并在3.06 μg ·cm^-2的剂量下会引起细胞损伤，本实验中nC₆₀纳米晶体颗粒浓度分别设定为6.6 mg ·L^-1和9.9 mg ·L^-1. nC₆₀单独对RAW 264.7的毒性如图 2所示，实验数据在方差同质性检验中为齐性，单因子方差分析中组内数据均与对照组数据有显著性差异(P＜0.05). 不管共培育时间是12 h[图 2(a)]，还是24 h[图 2(b)]，单纯暴露nC₆₀，RAW 264.7细胞都不同程度呈现出细胞活性下降. 并且具有明显的时间-毒性和剂量-毒性效应关系. 当单独给细胞暴露nC₆₀ 12 h时，细胞活性分别相应的减少到了对照组的70%和50%. 当暴露时间为24 h时，细胞活性分别相应减少到了对照组的60%和40%以上.

图2

Fig. 2

图2 nC60对RAW 264.7细胞活性影响 Fig.2 Cell viability of RAW 264.7 cells exposed to nC60 for 12 h and 24 h

单独暴露不同浓度Cu²⁺与RAW 264.7共培育24 h如图 3所示，实验数据在方差同质性检验中为齐性，单因子方差分析中组内数据均与对照组数据有显著性差异(P＜0.05). 结果表明Cu²⁺对RAW 264.7具有细胞毒性，Cu²⁺浓度越高，其毒性作用增大. 与对照组比较，暴露0.5 mg ·L^-1浓度的Cu²⁺时，细胞活性降低到对照组的80%，在暴露50 mg ·L^-1时，RAW 264.7细胞活性降低到对照组的50%. 随着Cu²⁺浓度的增加，其毒性效应增加并不明显，当Cu²⁺浓度从0.5 mg ·L^-1增加到50 mg ·L^-1时，细胞活性降低不超过30%.

图3

Fig. 3

图3 Cu2+浓度对RAW 264.7细胞活性影响 Fig.3 Effects of Cu2+ concentration on cell viability of RAW 264.7

图 4显示了固定nC₆₀浓度，添加不同浓度的Cu²⁺离子对nC₆₀对RAW 264.7细胞活性的影响. 结果表明，2~20 mg ·L^-1 Cu²⁺离子浓度变化对nC₆₀对RAW 264.7细胞活性没有明显影响，两组实验数据在单因子方差分析中均与对照组数据有显著性差异(P＜0.05).

图4

Fig. 4

图4 Cu2+浓度对nC60对RAW 264.7细胞活性影响 Fig.4 Effects of Cu2+ concentration on RAW 264.7 cell viability incubated with different concentrations of nC60

当nC₆₀浓度设定为3.3 mg ·L^-1时，Cu²⁺浓度从2 mg ·L^-1增加到20 mg ·L^-1时，细胞活性降低都保持在30％～40%之间，对细胞活性变化影响较小； 当nC₆₀浓度设定在6.6 mg ·L^-1时，细胞活性降低都保持在25％～30%之间，Cu²⁺浓度变化同样对细胞活性的影响较小.

这与单纯暴露Cu²⁺浓度所测得的结果相同，Cu²⁺浓度对细胞活性影响并不明显. 而且研究结果发现Cu²⁺能够降低nC₆₀对RAW 264.7的细胞活性影响. 当nC₆₀(6.6 mg ·L^-1)纳米晶体颗粒与细胞共培育24h，其细胞活性减少了45%[图 2(b)]，但是当添加2 mg ·L^-1Cu²⁺时，其细胞活性只减少了25%[图 4(b)]，当添加20 mg ·L^-1的Cu²⁺时，其细胞活性也只减少了30%，说明在nC₆₀的纳米晶体颗粒中添加Cu²⁺，可明显减少nC₆₀的毒性作用.

nC₆₀浓度对Cu²⁺对RAW 264.7细胞活性的影响如图 5所示，结果表明，当溶液中出现Cu²⁺时，细胞活性降低随nC₆₀浓度变化并不明显，两组实验数据在单因子方差分析中均与对照组数据有显著性差异(P＜0.05). 固定Cu²⁺浓度，再暴露不同浓度nC₆₀纳米晶体颗粒，共培育24 h，随着nC₆₀纳米颗粒浓度的增加，对细胞活性影响没有明显增加. 如图 5结果所示，当固定添加5 mg ·L^-1 Cu²⁺时，依次增加暴露的nC₆₀的浓度，细胞活性降低在0~15%左右，即使在高浓度9.9 mg ·L^-1 nC₆₀纳米晶体颗粒下，细胞活性降低也只在15%左右[图 5(a)]，与单纯的nC₆₀纳米晶体颗粒暴露下得到的结果比较，其对细胞活性的影响远远减少. 固定添加10 mg ·L^-1 Cu²⁺，均得到相同结果.

图5

Fig. 5

图5 nC60浓度对Cu2+ 对RAW 264.7细胞活性影响 Fig.5 Effects of nC60 on RAW 264.7cell viability incubated with different concentrations of Cu2+

为探究Cu²⁺降低nC₆₀对RAW 264.7细胞活性影响的原因，本文研究了nC₆₀对Cu²⁺的吸附. nC₆₀对Cu²⁺的吸附等温线如图 6所示. 比较两种模型的线性相关系数(R²)可得，Langmuir吸附等温方程式对nC₆₀对重金属铜的吸附过程有较好的拟合相关性，表明nC₆₀对重金属铜的吸附较符合Langmuir的理论假设，nC₆₀在物理吸附时为低能位吸附，其吸附热小，故吸附速度快，吸附过程在瞬间完成. 随nC₆₀表面吸附位被重金属铜完全占据，在15 min内吸附达到平衡，吸附机理主要是由于nC₆₀表面负性，其平均Zeta电位为-45.24 mV.

图6

Fig. 6

图6 nC60对铜的Langmuir和Freundich吸附等温线 Fig.6 Langmuir and Freundich adsorption isotherms of Cu2+ by nC60 aggregates

Usenko等^[22]研究发现C₆₀经紫外活化后会产生氧自由基从而引起细胞死亡，而Brant等^[23]的研究指出C₆₀的毒性是由于膜脂质成分的改变及流动，在细胞膜上累积的氧自由基会使细胞凋亡^{[24, 25, 26]}. 在这些研究基础上笔者认为Cu²⁺的添加可有效降低nC₆₀对小鼠腹腔巨噬细胞的毒性作用，其主要原因是nC₆₀表面的负电荷，吸附了相反电荷的Cu²⁺，中和了其表面的负电荷. 当暴露在RAW 264.7当中时，不能被吸附到细胞膜表面的带有正电荷基团的诸如NH₄⁺的膜蛋白受体上，阻断其凋亡信息的传递，降低对RAW 264.7细胞的毒性作用.

(1)C₆₀纳米晶体颗粒存在明显的潜在健康风险，对小鼠腹腔巨噬细胞呈现明显的时间-毒性和剂量毒性效应.

(2)Cu²⁺的添加可明显降低nC₆₀对RAW 264.7的毒性作用.

(3)Cu²⁺与nC₆₀对RAW 264.7的毒性有拮抗作用，原因是由于nC₆₀可吸附水溶液中的Cu²⁺后阻止其在细胞膜表面的吸附，吸附模型符合Langmuir吸附等温线.