畜禽养殖业已经成为我国最大污染行业之一^[1,2]. 沼气工程是一些大中型养殖场进行废水、 粪污处置、 资源化再利用的主要手段^[3]. 但是厌氧消化过程主要削减有机物，大量氮磷等物质仍存在于沼渣、 沼液中，对生态环境仍具有一定的威胁^[4,5]. 另一方面，沼渣、 沼液中含有大量的氮、 磷、 钾等植物生长所必须的物质，可以作为肥料进行进一步利用，尤其是沼液中含有大量的可溶性氮磷，极易被植物吸收，是良好的肥料^[6]. 但是由于沼液产生的连续性与作物施肥的间断性之间的矛盾，一些养殖场周围的土地无法消纳持续产生的大量沼液^{[3, 4]}. 其他如沼液的自然处理、 工程化达标处理等技术都仍存在一定的问题，难以取得经济可行的效果，沼液的处理仍是限制沼气技术发展的瓶颈之一^[3].

沼液中的氮磷等营养盐类也是微藻生长所必需的^[7]. 利用沼液培养能源微藻被认为是一种高附加值的沼液处理方式^[8]. 但是沼液中高浓度的氨氮和较低的透明度等因素不利于微藻的生长^[9]. 通常需要对沼液进行离心、 稀释后才能用于微藻的培养,这会消耗大量的水资源并使微藻培养成本增加^[8,10]. 获得可以耐受高浓度沼液的微藻藻株是解决这一问题的方法之一. Tale等^[11]从以餐厨垃圾为发酵原料的沼液中分离到5株耐受性较好的藻株用于餐厨垃圾的沼液处理. 但是目前用于以养殖废水为原料的沼液处理的藻株主要是从藻种库购买^{[8, 10, 12]}或从其他地表水体中分离获得^{[13, 14]}. 这些藻株一般对高浓度沼液较为敏感，需要将沼液稀释到较低的浓度. 本研究直接从长期放置的沼液中分离到1株具有较高浓度沼液耐受性的小球藻，并对其污染物去除能力、 产油能力进行了分析，以期为进一步在养殖废水处理和生物柴油中的应用奠定基础.

用于藻株分离的水样是从装有沼液的长期放置在窗台中的广口瓶中获得的. 在无菌操作台中将100 μL水样被涂抹在灭过菌(121℃，20 min)的含有1%琼脂粉和未稀释的沼液的平板上. 将平板置于25℃、 60 μmol ·(m² ·s)^-1光照强度的培养箱中培养(上海一恒MGC-300A，光源为10根36W的白炽灯管)，光暗周期为16 h亮/8 h暗. 5 d后挑取单个的绿色斑点接种到在含有100 mL灭过菌的BG11培养液中^[15]，置于培养箱中扩大培养，每天摇动3次.

实验所用的沼液均采自四川简阳一个以固液分离后猪场废水为发酵原料的沼气工程，发酵工艺为连续搅拌完全混合式厌氧消化反应器(continuously stirred tank reactor，CSTR). 采回的沼液经离心(4500r ·min^-1,15 min)后储存在4℃的冰柜中备用. 经过离心后的沼液pH为7.86，化学需氧量( COD)为1021 mg ·L^-1，总氮为286 mg ·L^-1，氨氮为273mg ·L^-1，总磷为8.9 mg ·L^-1.

分离得到的藻株在三角瓶中扩大培养10 d后取部分样品在光学显微镜下进行形态鉴定，然后将培养液4℃，13000r ·min^-1离心3 min，用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP337-N96)对所得藻体进行基因组DNA提取. 以ITS-F: 5′-TTTCCGTA GGTGAACCTGCGGAAG-3′,ITS-R: 5′-TTAAGTTC AGCGGGTAGTCTTGCC-3′为引物，基因组DNA为模版进行PCR扩增，以获得ITS1(Internal Transcribed spacer I)序列. 扩增产物经电泳检测后回收，构建到pEASY-T1 (TransGene) 克隆载体上，取阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序. 利用MEGA5.1软件的NJ(Neighbor-Jointin)法对获得的序列和GenBank中其他藻种的ITS1序列构建系统发育树，重复100次计算Bootstrap值.

以从中国科学院淡水藻种库购买的普通小球藻(Chlorella regularis FACHB-729)为对照，将在BG11培养的分离到藻株和FACHB-729作为种子液接种到装有2 L不同沼液的密封的玻璃瓶中，起始细胞浓度是680 nm波长的吸光度值(D)为0.1，并设置不接种任何藻种的对照组(CK). 沼液组设置25%、 50%和100% 这3个浓度梯度. 以空气中的CO₂为碳源，空气的流速为0.5 L ·min^-1. 实验于2014年9月在位于成都市的农业部沼气科学研究所楼顶进行，每天利用分光光度计测定680 nm处的D值. 根据D值的变化情况选择收获的最佳时间，通过离心(4500 r ·min^-1，10 min)的方式收集藻体，用1%的氯化钠溶液洗3次后在60℃的烘箱中烘至恒重.

水质的分析方法均参照文献^[16]. 氨氮采用纳氏试剂分光光度法，总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，总磷的测定用钼酸铵分光光度法，COD用重铬酸钾法测定,pH值用pH计测定.

从干藻粉中提取总油脂采用Bligh等的方法^[17]，并做适当修改过. 具体方法如下，取0.1 g藻粉加入2 mL的氯仿和1 mL的甲醇，充分混合10 min后依次加入1 mL甲醇混合1 min，1.8 mL水混合5 min离心(4500r ·min^-1). 吸取氯仿层，用5%的氯化钠溶液洗2次，然后60℃烘干至恒重，称取离心管前后的重量，即油脂重量.

本研究每个处理设置3个重复，采用Excel 2007、 Origin 8.0软件进行数据方差分析和作图.

用于藻株分离的平板在光照培养箱中培养5 d后绿色的藻斑的直径达到0.5~1 mm，其中一个藻斑在BG11中扩大培养后经显微镜观察为直径约为3~5 μm的圆形的单细胞藻，与小球藻属的形态相似^[18](图 1). 将其命名为Chlorella sp. BWY-1. 以ITS1序列构建的进化树分析表明BWY-1 与Chlorella variabilis、 Chlorella chlorelloides聚类为一簇(图 1).

图1

Fig. 1

图1 从沼液中分离的藻株Chlorella sp. BWY-1的形态特征和系统发育树 Fig.1 Morphological characteristics and the phylogenetic tree of Chlorella sp. BWY-1 isolated from the anaerobic digestion effluent

图 2为BWY-1与FACHB-729在BG11和不同浓度沼液中的生长曲线. 在经过1 d的延滞期后两株藻在BG11和低浓度的沼液中(25%和50%)进入对数生长期，在7 d后进入稳定期，FACHB-729的生长速率均低于BWY-1. 而在高浓度的沼液中(100%)，尽管BWY-1 仍在第7 d进入稳定期，但是其延滞期要达到2 d. FACHB-729在100%的沼液中几乎无法生长(图 3). 因此，本研究后续实验的收获期为第7 d. 两个藻株在BG11中的生长速率均高于在沼液中的生长速率.

图2

Fig. 2

图2 两个藻株在BG11和不同浓度沼液中的生长曲线 Fig.2 Growth curves of the two algal strains in BG11 and different concentrations of anaerobic digestion effluent

图3

Fig. 3

图3 两个藻株在不同浓度沼液中的生长状况 Fig.3 Growth of the two algal strains in different concentrations of anaerobic digestion effluent

图 4为BWY-1与FACHB-729在7 d的培养时间内对不同浓度沼液中COD、 总氮、 氨氮和总磷的去除情况. 两个藻种对COD的去除效果差异较小，但是BWY-1对氮磷的去除效果明显好于FACHB-729，而且在低沼液浓度下的去除效果明显高于高浓度. BWY-1在25%的沼液中对总磷的去除效果最好，可达85.25%. 在未稀释的沼液中两个藻株对氮磷的去除效果较差，效果相对较好的BWY-1对总氮、 氨氮和总磷的去除率分别为30.3%、 23.7%和52.8%.

图4

Fig. 4

图4 两个藻株对不同沼液浓度的氨氮、 总氮、 总磷和COD的去除率 Fig.4 Removal rate of ammonium nitrogen, total nitrogen, total phosphorus, and chemical oxygen demand from different concentrations of anaerobic digestion effluent by the two algal strains

表 1为培养7 d后BWY-1与FACHB-729在BG11和不同浓度的沼液中的生物量和油脂积累情况. 在生物量积累方面，两个藻种均是在BG11中最高，BWY-1可达324.40mg ·L^-1，高于FACHB-729的253.51mg ·L^-1； 在沼液中的生物量积累随着沼液浓度的增加而降低. 在油脂积累方面，由于随着沼液浓度的增加两个藻株的含油量呈增加趋势，在100%的沼液中BWY-1的含油量可高达44.43%，BWY-1的油脂积累能力表现出随着沼液浓度递增的趋势； 但是由于FACHB-729在沼液中的生长情况较差，油脂积累能力仍随着沼液浓度的递增而减少.

表1(Table 1)

表1 两个藻株的生物质生产力、 油脂含量和油脂生产力 Table 1 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of the two algal strains 藻株 培养液 生物量积累(以dwt计)/mg·L-1 油脂积累/mg·L-1 油脂含量/% Chlorella regularis (FACHB-729) BG11 253.51±8.65 43.55±2.00 17.21±1.36 25%沼液 129.87±5.51 34.47±1.40 26.55±0.19 50%沼液 60.10±4.83 16.61±1.17 27.85±1.14 100%沼液 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 Chlorella sp. BYW-1 BG11 324.40±11.50 65.64±0.88 20.24±0.45 25%沼液 274.19±9.48 88.48±1.04 32.29±0.74 50%沼液 269.62±5.89 95.18±1.14 35.32±1.20 100%沼液 244.85±6.54 108.70±1.37 44.43±1.74

表1 两个藻株的生物质生产力、 油脂含量和油脂生产力 Table 1 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of the two algal strains

利用分子生物学的方法对分离的藻株进行离鉴定已经是较为成熟的方法，通常方法是对18S、 ITS等特征序列进行测序后构建进化树进行分析^[19]. 线粒体DNA的ITS1序列是真核生物进行同属的物种鉴定的常用序列^[20]，也已经成功的用于小球藻属的鉴定^[21,22]. 本研究利用ITS1序列的分析，将分离得到的藻株归为小球藻属.

微藻处理沼液具有一定的优势，但是仍受一些条件的限制，沼液中过高氨氮含量就是其中因素之一^[23]. 以猪场废水为原料的沼液中的氨氮含量在100~2000 mg ·L^-1之间^[5]，不利于微藻生长. 固液分离技术作为一种常见的畜禽养殖场粪污的前处理技术可以有效的将一部分氮磷等物质分离到固体中^[24]，使进入厌氧发酵罐的氮磷含量降低，从而使产生的沼液中的氨氮的物质的含量降低，有利于微藻的培养. 本研究所用的沼液即为以固液分离后的养殖废水为原料的沼液，氨氮浓度虽然已经低于300mg ·L^-1，但是仍不利于一些普通微藻藻株的生长，FACHB-729在未稀释的沼液中无法生长. 而从沼液中分离的藻株BWY-1则在未稀释的沼液中表现出良好的生长状态，说明BWY-1对高浓度的沼液具有一定的耐受性，可以结合固液分离、 厌氧发酵工艺用于养殖废水的处理. 另一方面，与在BG11培养基中相比，两个藻株在各个沼液浓度中的生长速率和生物量积累要低，说明沼液虽然可以满足微藻的生长要求，耐受型的藻株BWY-1可以在高浓度的沼液中较好的生长，但是由于沼液中成分复杂，无法使微藻的生长状态达到最佳.

小球藻BWY-1不仅在高浓度的沼液中表现出较好的生长能力，而且在高浓度的沼液中表现出较高的含油量. 这可能与高浓度沼液对其产生的胁迫有关. 研究表明由一些非生物胁迫诱导的氧化胁迫可以使微藻含油量增加^[25]. 废水中高浓度的氨氮也可以使浮萍等水生植物产生氧化胁迫^[26]. BWY-1和FACHB-729在高沼液浓度条件下表现出的高油脂含量增加可能与氧化胁迫相关.

在低浓度的沼液中，小球藻可以对氮、磷等物质进行良好的削减，但是在高浓度的沼液中BWY-1虽然仍有一定的污水净化能力，但是由于沼液中的污染物浓度较高，BWY-1对沼液中氮磷的去除效果有限，可以采取多轮培养或者与其他处理手段结合的方式进行沼液处理.

本研究从长期放置的沼液中筛选的小球藻Chlorella sp. BWY-1在高浓度的沼液中可以良好地生长，并表现出较高的油脂含量和一定的污染物去除能力. 该藻株在养殖废水处理和生物能源方面具有一定的应用潜力，可以结合固液分离、 厌氧发酵等其他技术用于养殖场废水的处理，收集的藻体可以用于生产生物柴汽油的原料.