对叔丁基邻苯二酚(p-tert-Butylcatechol，TBC)作为邻苯二酚的重要衍生物，是1种高效有机阻聚剂，广泛应用于烯烃、 聚烯烃的生产或聚烯烃单体的贮运过程. 此外，还用作多种化合物的抗氧剂与稳定剂. TBC不易被生物降解，随着我国石化工业的迅速发展，TBC的需求与消耗也急速增加，使其成为环境中较常见、 分布广泛的污染物^[1]. 它对人体皮肤、 黏膜和上呼吸道有一定危害，可引起呼吸道和皮肤过敏反应，严重时对遗传也有影响^[2]. 国内生产TBC主要合成方法大多需要经过水洗中和处理步骤，水中TBC等酚类含量高，难以去除废水中酚类，面临污水排放不达标等环保问题. 因此，除去水体中的TBC等酚类已成为污水处理的重要课题^{[3, 4, 5]}.

目前，降解酚类的方法主要包括吸附法，电化学法和生物降解法等，其中生物降解因投资与运行成本低、 二次污染小、 处理效率高等优点而广泛应用于含酚废水处理^{[6, 7, 8]}. 酚类化合物的降解主要集中在结构简单且具有代表性的苯酚上，对该化合物降解菌的筛选及其降解特性研究已有大量报道^{[9, 10, 11]}，但对TBC这种结构较复杂、 理化性质稳定的酚类的降解研究尚不多见. 本研究主要利用高效降解微生物对TBC进行生物降解，能有效去除水体中的TBC，但降解过程的影响因素较多，有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素. 由于传统单因素实验不能确定主次因素的差别^[12]，而Plackett-Burman实验广泛应用于生物过程重要参数的筛选，通过对实验进行统计学设计和数据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素^[13]. 响应面分析法(response surface methodology，RSM)是1种优化过程的有效方法，其中的Box-Behnken实验设计法比较常用，可用于确定实验因素及其交互作用在过程中对指标响应值的影响，精确的表述因素与响应值之间的关系. 该法与正交设计比较，所需实验组数相对较少，更能直观体现因变量的最佳值^{[14, 15, 16]}.

本研究从株洲某化工厂污水处理车间氧化池的活性污泥中筛选分离出1株能高效降解TBC的细菌菌株，根据其形体特征、 生理生化性状、 BIOLOG鉴定和16S rDNA序列分析进行分类鉴定，考察了该菌株降解TBC的特性和初步探讨了该菌株降解TBC的途径，并利用响应面法(RSM)优化YH1降解TBC的条件以提高降解效率.

从株洲市某化工厂废水处理车间氧化池采集的活性污泥作为筛选降解菌株的样品.

种子培养基(LB)：每升含酵母粉 5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2. 无机盐培养基(MS)：每升含K₂HPO₄ 0.4 g、 KH₂PO₄ 0.4 g、 NaCl 0.1 g、 (NH₄)₂SO₄ 0.04 g、 MgSO₄ ·7H₂O 0.1 g、 MnSO₄ ·H₂O 0.01 g、 Fe₂(SO₄)₃ ·H₂O 0.01 g、 NaMoO₄ ·2H₂O 0.01 g，加水定容至1 000 mL. 选择培养基：在已灭菌的MS培养基中，按浓度要求加入经0.22 um微孔滤膜过滤的TBC母液(5 g ·L^-1水溶液)，pH 7.0. 以上固体培养基需加入1.8%的琼脂粉，经121℃、 20 min高压灭菌备用.

TBC(纯度＞99.9%)及其他试剂均为分析纯. Taq酶、 pEASY-T1 Cloning Kit、 克隆用感受态细胞Trans10 Chemically Competent Cell以及其他生化试剂购自北京全式金生物技术有限公司. PCR引物合成及产物测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成. 常用仪器：恒温摇床(Thermo SCIENTIFIC，MAXQ 420HP，USA)，高速冷冻离心机(eppendorf，Centrifuge 5804R，German)，紫外可见分光光度计(SHIMADZU，UVmin1240，Japan)，电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-8C)，PCR扩增仪(BIO-RAD，T100 Thermal Cycler，USA)，凝胶成像分析系统(Kodak，Gel Logic 212，USA)，光学显微镜(NIKON，50i，Japan)等.

准确称量氧化池活性污泥10 g，加入到装有90 mL 3级水的锥形瓶中，30℃、 200 r ·min^-1恒温摇床中振荡培养1 h. 将重悬液按2%接种量加入到含TBC的选择培养基中，TBC浓度按100、 200、 300、 400、 500、 600、 800、 1 000 mg ·L^-1依次提高以梯度驯化与富集降解菌. 经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于含TBC固体选择培养基上，在30℃恒温培养箱中倒置培养12 h. 挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB平板上，反复划线分离纯化得到纯菌株，保存于4℃冰箱中备用.

将保藏的纯化菌株接种至LB平板上，划线分离单菌落.挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30℃、 200 r ·min^-1振荡培养至D600为2.0(对数生长期末期). 连续活化3代后，用生理盐水将发酵液离心洗涤两次并重悬菌体. 以2%接种量接种至选择培养基中，振荡培养并间隔12 h检测培养液中TBC含量，从中挑选降解TBC能力最强的菌株.

肉眼观察降解菌的菌落形态(形状、 大小、 颜色、 透明度、 黏稠度、 湿润度、 隆起和边缘特征及是否产色素等)，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、 鞭毛、 荚膜、 芽孢等结构，利用日立S-3400N型扫描电镜观察菌体大小和表面结构.

参照文献^{[17, 18]}做该菌株的生理生化鉴定，另采用BIOLOG全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定. 采用添加有抗生素和重金属盐的LB培养基培养YH1，检测菌株的相关抗性.

细菌基因组DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒，依据说明书提取. 采用上海生工生物工程技术服务有限公司的细菌16S rDNA通用引物，27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)，以基因组DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增. PCR反应体系：10×Taq Buffer(含Mg+)5 μL，dNTP(2.5 mmol ·L^-1)4 μL,引物(10 μmol ·L^-1)各1 μL，模板DNA(约50 ng ·μL^-1)2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U ·μL^-1)0.5 μL，加水至50 μL. PCR反应条件：94℃ 3 min； 94℃ 30 s； 55℃ 45 s； 72℃ 1 min，循环30次； 72℃ 10 min. PCR产物经琼脂糖电泳检测后送上海生工测序，经BLAST软件与GenBank数据库中已收录的基因序列进行比对，于MEGA 6.0上用邻接法构建系统发育树.

测试的底物有：二苯胺、 对苯二胺盐酸盐、 三(羟甲基)氨基甲烷、 苯甲酸钠、 1-萘酚、 3，5-二硝基水杨酸、 无水对氨基苯磺酸、 辛基酚聚氧乙烯醚、 十二烷基硫酸钠、 二苯氨基脲、 磷酸苯二钠、 1-10-菲啰啉、 邻苯二甲酸氢钾、 磺胺、 五氯硝基苯、 对二甲氨基苯甲醛、 邻苯二酚、 苯酚^[19]、 TBC，将用生理盐水洗涤两次的菌液分别涂布在以上述底物为唯一碳源的MS平板上，底物浓度为1%. 同时以接种不含底物的MS平板为阴性对照，在30℃倒置培养，每隔12 h观察菌株的生长情况.

将菌株以2%接种量加入到TBC浓度分别为50、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 800、 1 000 mg ·L^-1的选择培养基中，30℃、 200 r ·min^-1振荡培养7 d，取2 mL培养液测D 600值，同时培养液离心测上清液D425值，并计算降解率.

经单因素实验确定影响YH1降解TBC的TBC浓度、 温度、 接种量、 初始pH、 外加碳源和外加氮源. 以TBC降解率为响应值，采用3步法进行TBC降解的优化^[20]. 首先，利用Plackett-Burman设计选出对菌株降解TBC效率影响较大的因素，然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后利用响应曲面法中的Box-Benhnken设计进行实验. 通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优降解条件并进行验证. 实验数据借助SPSS和Design Expert软件进行分析.

将筛选到的菌株YH1接种至选择培养基(含500 mg ·L^-1 TBC)和LB培养基中，30℃、 200 r ·min^-1振荡培养32 h，取对数生长期末期菌液50 mL，4℃、 12 000 r ·min^-1离心10 min，上清液即为胞外粗酶液，于-20℃ 冻存. 菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗两次后，重悬于磷酸缓冲液中. 在冰浴中，用HUP-400A型超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声破碎30 s，间隔30 s，连续处理10 min. 于4℃、 13 000 r ·min^-1离心20 min，上清液即为胞内粗酶液，于-20℃ 冻存^[21].

邻苯二酚2，3双加氧酶(C₂₃O)引物为G23OF(CCAGCAAACACCTCGTTGCGGTTGCC)和G23OR(AGAGGCATGGGGGCGCACCGGTTCGATCA)，邻苯二酚1，2双加氧酶(C₁₂O)引物为G12OF(CGCCTTCAAAGTTGATCTGCGTGGT)和G12OR(GCCAACGTCGACGTCTGGCA)^[22]. 上述基因片段扩增体系与16S rRNA基因序列扩增体系相同，引物反应程序均为：94℃预变性3 min； 94℃变性60 s； 57℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环； 72℃延伸10 min. 经琼脂糖电泳检测后送上海生工测序. 测序结果用BLAST软件与GenBank数据库中已收录的基因序列进行同源性比较.

采用碱裂解法^[23]抽提质粒. 质粒消除采用变温-SDS法^[24]，具体步骤为：挑取单菌落接种至LB培养基中，37℃、 200 r ·min^-1培养12 h，按2%接种量接种到含100 mg ·L^-1 SDS的LB培养基中，40℃、 200 r ·min^-1培养24 h，再按2%接种量接种该培养液至LB培养基中，37℃、 200 r ·min^-1培养12 h，按以上温度变化交替转接发酵液至含SDS浓度为500、 1 000、 1 500、 2 000 mg ·L^-1的LB培养基中. 取菌体能生长且SDS浓度最大的培养液，梯度稀释至10^-9并依次涂布于LB平板上.采用点接法将单菌落按相同位置接种至LB和选择培养基的平板上，对能在LB平板上生长而不能在选择培养基上生长的菌株进行质粒检测.

采用可见分光光度法在600 nm下测定培养液的吸光度(D600).

本实验采用改进的分光光度法^[25]测定TBC的含量：取2 mL培养液加入等体积的75%乙醇，10 000 r ·min^-1离心10 min，取上清液1 mL加入到100 mL容量瓶中.加水至约90 mL，加三氯化铁溶液5 mL，并加水稀释至刻度，混匀. 静置5 min后，以水为参比，在425 nm波长用分光光度计测定溶液的吸光度. 同时做试剂空白，样品吸光度减去试剂空白的吸光度，其差值为净吸光度.

分别参考文献^{[26, 27]}邻苯二酚1，2-双加氧酶(C₁₂O)和邻苯二酚2，3-双加氧酶(C₂₃O)催化降解邻苯二酚的产物为粘糠酸和2-羟基粘糠酸半醛，分别在260 nm和375 nm处有最大吸收峰. C₁₂O和C₂₃O酶活力测定以单位时间内反应产物分别在260 nm和375 nm处吸光度变化表示. 反应体系为8.01 mL邻苯二酚、 0.39 mL磷酸缓冲液(pH=7.0)和0.6 mL粗酶液，以缓冲液为参比. 定义C₁₂O(或C₂₃O)活力单位(U)为25℃ 条件下每分钟反应产生1 μmol产物所需酶量. 总蛋白含量用Bradford法测定，具体方法参见全式金Easy Protein Quantitative Kit试剂盒说明书. 酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算.

从活性污泥中分离纯化得到单菌落，划线分离后获得35株TBC降解菌. 通过复筛得到1株TBC降解能力最高的菌株，命名为YH1. 在驯化前，该菌在TBC浓度为500 mg ·L^-1的选择培养基中，经30℃、 200 r ·min^-1培养4 d可使TBC降解率达到85.6%. 采用梯度浓度驯化后，该菌可在4 d内使600 mg ·L^-1的TBC降解54.9%. 采用-4℃斜面短期保藏和-80℃ 30%甘油长期保藏菌株.

菌株YH1的菌落呈圆形、 浅黄色、 中间隆起、 边缘整齐、 湿润有光泽、 较粘稠、 不产色素. 菌株细胞呈短杆状，端生鞭毛，有荚膜，无芽孢，经扫描电镜观察该菌在LB和选择培养基生长的菌株细胞，结果发现正常细胞表面分布有较多的菌毛，而TBC则使该菌细胞表面出现凹陷，部分细胞破裂、 菌毛脱落(图 1和图 2).

图 1

Fig. 1

图 1 YH1在LB中的扫描电镜图(×20.000 0) Fig. 1 Electron micrograph of YH1 in LB(×20.000 0)

图 2

Fig. 2

图 2 YH1在TBC中的扫描电镜图(×20.000 0) Fig. 2 Electron micrograph of YH1 in TBC(×20.000 0)

菌株YH1生理生化指标为：革兰氏染色阴性、 氧化酶阴性、 过氧化氢酶阳性、 苯丙氨酸脱氨酶阴性、 吲哚实验阴性、 淀粉水解阴性、 硫化氢阴性、 三糖铁阴性、 硝酸盐还原阴性、 V-P实验阴性、 甲基红阴性、 明胶液化阳性、 纤维素酶阴性，4℃ 和40℃ 均可生长，具有运动性. 将菌株YH1细胞悬浮液接种到BIOLOG GN2版微孔中，培养4 h和16 h后分别测定菌株代谢指数. 经BIOLOG细菌鉴定系统分析，菌株YH1代谢指数与皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)的相似性为90%.

重金属抗性实验发现，菌株YH1能在分别添加1.5 g ·L^-1 Pb²⁺、 1 g ·L^-1 Cr⁶⁺、 2 g ·L^-1 Cr³⁺、 0.5 g ·L^-1 Cd²⁺、 0.8 g ·L^-1 Sb³⁺、 2 g ·L^-1 Mn²⁺、 1.5 g ·L^-1 Cu²⁺和1 g ·L^-1 Zn²⁺的LB培养基中正常生长，低于1 g ·L^-1的Pb²⁺、 Mn²⁺、 Cu²⁺、 Zn²⁺可促进菌株的生长，而Cd²⁺、 Sb³⁺、 Hg²⁺、 Ag⁺对菌株的生长有强烈的抑制作用. 药敏实验结果表明菌株YH1能耐受5 μmol ·mL^-1的氯霉素、 氨苄青霉素、 庆大霉素、 壮观霉素、 卡那霉素、 红霉素、 头孢噻肟钠，而对四环素和利发霉素敏感. 菌株YH1能在NaCl浓度为1%～7%的选择培养基中生长，表明菌株YH1可适应较高渗透压的环境.

菌株YH1的16S rDNA经PCR扩增得到1条约1.5 Kb的DNA片段，测序得到1 441 bp的序列. YH1的16S rDNA序列(GenBank登录号：KM658326)与GenBank数据库中已收录的16S rDNA序列进行同源性比较分析，结果显示该菌株与Pseudomonas sp.具有很高的同源性(99%)，结合菌株YH1的形态和生理生化特征，鉴定菌株YH1为皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate). 利用MEGA6.0构建系统发育树，结果见图 3.

图 3

Fig. 3

图 3 菌株YH1的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of strain YH1 based on partial 16S rDNA gene sequence

按试剂盒说明从菌株YH1中提取到基因组DNA，片段大于15 Kb. 分别利用C₁₂O(G120F/G120R)、 C₂₃O(G230F/G230R)引物对菌株YH1的基因组DNA进行PCR扩增，结果发现引物C₁₂O有明显的扩增产物(图 4)，而C₂₃O引物无明显的扩增产物. 将扩增产物测序，获得了邻苯二酚1，2-双加氧酶基因大小为251 bp的片段. 测序比对结果表明该菌株的苯酚羟化酶基因序列与登录号为AB047272.1的邻苯二酚1，2-双加氧酶序列同源性最高，达到86%. 故该基因片段被认为是通过邻位途径催化邻苯二酚裂解为粘糠酸.

图 4

Fig. 4

图 4 邻苯二酚1，2双加氧酶基因片段的扩增产物 Fig. 4 Fragments of catechol 1,2-dioxygenase gene amplified from YH1

通过测定菌株YH1粗酶液中邻苯二酚1，2-双加氧酶和邻苯二酚2，3-双加氧酶的活性，初步判断该菌株YH1降解TBC的代谢途径. 菌株YH1粗酶活性检测如表 1所示，从中可知菌株YH1通过邻位开环裂解途径降解TBC. 菌体破碎后上清液中邻苯二酚1，2-双加氧酶的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，由此可见该酶为胞内酶. 以LB培养基为基质的两种上清液均未检测到酶活，而选择培养基中酶活远大于LB培养基中酶活，说明该菌株邻苯二酚1，2-双加氧酶为诱导酶.

表 1(Table 1)

表 1 不同基质中邻苯二酚1，2-双加氧酶比活力(以蛋白质计)/U ·mg-1 Table 1 Catechol 1,2-dioxygenase specific activities in different substrates (protein)/U ·mg-1 基质 项目 邻苯二酚2，3-双加氧酶比活力 邻苯二酚1，2-双加氧酶比活力 LB培养基 上清液 未检测到 0.002±0.000 4 粗酶液 未检测到 0.004±0.000 1 选择培养基 上清液 未检测到 0.031±0.004 7 粗酶液 未检测到 0.145±0.006 9

表 1 不同基质中邻苯二酚1，2-双加氧酶比活力(以蛋白质计)/U ·mg-1 Table 1 Catechol 1,2-dioxygenase specific activities in different substrates (protein)/U ·mg-1

采用碱裂解法，0.8%琼脂糖凝胶电泳发现菌株YH1具有1较大的质粒(图 5)，大小大于15 kb.经变温-SDS法消除质粒后，通过点解法得到只能在LB平板上生长而不能在仅含浓度为500 mg ·L^-1 TBC的MS培养基平板上生长的菌株(图 6)，质粒消除率可达24.5%. 经质粒检测，在质粒消除后的突变菌株中未发现质粒(图 5). 这说明经质粒消除后的菌株不能利用TBC作为唯一碳源进行生长，且可初步判定TBC相关降解基因位于质粒上，这为进一步研究YH1菌株降解TBC的途径和降解机制提供了一定的理论基础.

图 5

Fig. 5

(1)野生型；(2)突变型图 5 质粒抽提与质粒消除后检测结果 Fig. 5 Detection result of plasmid extraction and after plasmid elimination

图 6

Fig. 6

(a)LB；(b)TBC图 6 LB与TBC影印对照 Fig. 6 Comparative result between cultures on LB plate and TBC plate

用生理盐水洗涤2次的菌液涂布于平板上培养7 d，结果发现菌株YH1分别在邻苯二酚、 苯酚、 TBC、 二苯胺、 三(羟甲基)氨基甲烷、 辛基酚聚氧乙烯醚、 十二烷基硫酸钠、 五氯硝基苯为唯一碳源的培养基上培养4 d后，平板上都长出了明显菌落. 其中在以TBC、 邻苯二酚、 二苯胺为底物的平板上，24 h内便出现了菌落. 而在7 d后，在对苯二胺盐酸盐、 苯甲酸钠、 3，5-二硝基水杨酸、 无水对氨基苯磺酸、 二苯氨基脲、 磷酸苯二钠、 1-10-菲啰啉、 邻苯二甲酸氢钾、 磺胺、 对二甲氨基苯甲醛为唯一碳源的平板上未观察到菌落产生. TBC和邻苯二酚平板较其他4种底物平板上的菌落大且密集，说明邻苯二酚及其衍生物较易被菌株YH1降解.

将菌株YH1接种于含500 mg ·L^-1 TBC的MS培养基中，30℃、 200 r ·min^-1摇床培养，定时取样测定菌体生长量及TBC. 结果如图 7所示，从中可知，YH1菌株的生长同步于对TBC的降解，且菌株的生长和降解曲线的迟缓期为0~24 h，这一时间段为YH1细胞合成TBC相关降解酶的诱导期. 菌株在24~96 h进入对数期，大约在96 h最大菌体生长量达到0.65，此时TBC降解率达到92.35%.

图 7

Fig. 7

图 7 菌株YH1利用TBC生长和降解TBC曲线 Fig. 7 Degradation of TBC and the growth of strain YH1 using TBC as the sole carbon source

为了研究不同环境条件下菌株YH1对TBC的降解情况，选择TBC浓度、 温度、 接种量、 初始pH、 外加碳源、 外加氮源这5个影响因素作为研究对象，进行单因素实验. 实验结果表明在TBC浓度低于500 mg ·L^-1时，菌体的生长与TBC浓度呈线性关系,菌体生长量和降解率同时达到最大； 当TBC浓度高于500 mg ·L^-1时，D600值和TBC降解率随TBC浓度增加而变小，表明高浓度TBC抑制了菌株YH1的生长及其对TBC的降解. 菌株YH1生长和降解TBC的适宜温度范围为24~34℃,在30℃ 时菌株生长量和降解率达到最大，即30℃ 初步确定为最适温度. YH1生长和降解的临界温度为34℃,超过该温度，菌株YH1的生长和代谢便基本停止. 菌株YH1的最适接种量为2%，当接种量大于2%时，YH1的生长和对TBC降解率的增加不明显. 菌株YH1在pH 7.0~10.0范围内对TBC降解有较高的效率，即中性或偏碱性的环境中可使菌株YH1较好地生长和降解TBC. 蔗糖和胰蛋白胨作为最适外加碳源和氮源，适当添加可使菌株YH1的生长和降解TBC能力得到较明显的提升.

采用N=12 Placket-Burman 实验设计研究YH1对TBC的降解率产生影响的7个因素，每组实验重复3次. 11个考察因素及其编码水平见表 2，其实验设计以TBC降解率为响应值，借助实验设计软件Design Expert 7.1进行数据分析，其结果如表 3所示. 通过比较各因素的显著性水平，筛选出对TBC降解率影响较为显著的因素.

表 2(Table 2)

表 2 Placket-Burman设计各因素与水平 Table 2 Plackett-Burman experimental factors and levels 因素编码 因素1) 低(-1) 高(1) X1 Dummy1 X2 蔗糖/% 1 3 X3 TBC/mg·L-1 400 600 X4 Dummy2 X5 接种量/% 2 5 X6 胰蛋白胨/% 1 2 X7 温度/℃ 30 36 X8 培养时间/h 48 96 X9 Dummy3 X10 初始pH 5 8 X11 Dummy4 1)Dummy1~4为空白因素

表 2 Placket-Burman设计各因素与水平 Table 2 Plackett-Burman experimental factors and levels

表 3(Table 3)

表 3 Placket-Burman实验设计与结果1) Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiment 编码 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 TBC降解率/% 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 85.57 2 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 61.56 3 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 23.45 4 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 42.56 5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 94.32 6 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 92.70 7 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 95.25 8 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 24.94 9 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 96.29 10 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 83.34 11 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 55.21 12 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 82.23 1)X1~X11含义同表2

表 3 Placket-Burman实验设计与结果1) Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiment

从表 3可以看出，实验组9的TBC降解率最高，达96.29%； 实验组3的TBC降解率最低，为23.45%. 将实验数据采用SPSS V19.0拟合后，可得方程为：

Y= 69.78+0.87 X₂-2.84 X₃-9.15 X₅+9.10 X₆-4.68 X₇+3.15 X₈+21.28 X₁₀

式中，X2为蔗糖含量，%； X3为TBC浓度，mg ·L^-1； X5为YH1菌株接种量，%； X6为胰蛋白胨浓度，%； X7为温度，℃； X8为培养时间，h； X10为初始pH； X₁、 X₄、 X₉、 X11为空白变量.

应用Design Expert软件分析得到模型的P为0.001 5，表明所得回归方程达到极显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合性很好； 复相关系R2=0.960 4，说明相关性较好； 校正决定系数Adj R2=0.891 2，表明89.12%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释； 通常情况下变化系数(Cv)越低，实验的可信度和精确度越高，Cv值等于12.94%，表示PB实验的可信度和精确度较好； 精密度(Adeq Precision)是有效信号和噪声的比值，大于4.0视为合理，本实验精密度达到10.225根据回归分析结果(见表 4)，从表 4可知接种量(YH1菌液与培养液体积比)、 胰蛋白胨浓度以及初始pH对TBC降解率存在显著影响，其中初始pH的P值最小(P=0.001 2)，对菌株YH1降解TBC效率影响最显著，其次是接种量(P=0.024 6)，再次为胰蛋白胨浓度(P=0.025 1). 其他4个因素，蔗糖浓度、 TBC浓度、 温度、 培养时间P值均大于0.05，对TBC降解率没有明显影响. 由此，初始pH、 接种量和胰蛋白胨浓度为影响TBC降解率的关键因素.

表 4(Table 4)

表 4 Placket-Burman实验分析结果1) Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment 因素 效应 F检验 Pr＞F 重要性 X2 0.87 0.11 0.756 2 7 X3 -2.84 1.19 0.336 7 6 X5 -9.15 12.33 0.024 6 2 X6 9.10 12.19 0.025 1 3 X7 -4.68 3.23 0.146 9 4 X8 3.15 1.46 0.293 6 5 X10 21.28 66.62 0.001 2 1 1)X1~X11含义同表1

表 4 Placket-Burman实验分析结果1) Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分模拟真实情况，所以应先逼近最大TBC降解率区域后再建立有效的拟合方程.

根据Placket-Burman 实验筛选出的3个显著因素估计系数的正负效应，依次增大或减小，其他因素根据估计系数的正负效应分别取PB设计中的最高值和最低值. 初始pH和胰蛋白胨浓度对TBC降解率有显著正效应，应依次增加. 而接种量是负效应，应依次减少.其他因素的取值为蔗糖浓度3%、 TBC浓度400 mg ·L^-1、 温度30℃、 培养时间48 h. 由表 5数据分析可得，随着初始pH和胰蛋白胨浓度的增加及接种量的减小，TBC降解率呈先增大后减小的趋势. 当初始pH为7.0，接种量为3%，胰蛋白胨浓度为2%时，TBC降解率最大. 因此，序号3的实验为最大响应值区域，故以此为中心点进行响应面分析.

表 5(Table 5)

表 5 最陡爬坡实验设计及结果实验分析结果 Table 5 Experimental design and the results of steepest ascent 编号 接种量/% 胰蛋白胨/% 初始pH TBC降解率/% 1 4.0 1.0 6.0 87.56 2 3.5 1.5 6.5 91.39 3 3.0 2.0 7.0 94.57 4 2.5 2.5 7.5 88.93 5 2.0 3.0 8.0 85.21 6 1.5 3.5 8.5 78.94 7 1.0 4.0 9.0 65.42

表 5 最陡爬坡实验设计及结果实验分析结果 Table 5 Experimental design and the results of steepest ascent

响应面分析法是1种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Box-Behnken和Box-Wilson中心组合设计是两种较常见的响应面分析法(RSA). 根据相应的实验设计进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，最后在一定的水平范围内求出最佳值，然后进行数学模型验证. 通过爬坡路径法确定降解条件重要影响因子范围后，以初始pH、 接种量和胰蛋白胨浓度这3种因子为自变量，以TBC降解率为响应值，设计了3因素3水平的响应面分析实验. 实验设计及结果见表 6.

表 6(Table 6)

表 6 Box-Behnken 实验设计及结果 Table 6 Box-Behnken experimental design and result 实验序号 接种量/% 胰蛋白胨/% 初始pH TBC降解率/% X5 编码X5 X6 编码X6 X10 编码X10 1 3 0 2 0 8 0 97.34 2 3 0 3 1 7 -1 84.86 3 3 0 2 0 8 0 97.31 4 4 1 2 0 9 1 80.69 5 2 -1 1 -1 8 0 93.07 6 2 -1 2 0 7 -1 82.15 7 2 -1 2 0 9 1 77.82 8 4 1 1 -1 8 0 91.77 9 3 0 1 -1 7 -1 79.03 10 3 0 3 1 9 1 81.97 11 3 0 2 0 8 0 97.48 12 4 1 2 0 7 -1 75.08 13 3 0 1 -1 9 1 88.83 14 2 -1 3 1 8 0 88.49 15 3 0 2 0 8 0 97.63 16 4 1 3 1 8 0 79.70 17 3 0 2 0 8 0 97.75

表 6 Box-Behnken 实验设计及结果 Table 6 Box-Behnken experimental design and result

运用Design Expert 软件对17个实验点的响应面值进行回归分析，得二次多项式方程：

Y=97.5-1.79 A-2.21 B+1.02 C-1.87 AB+2.49 AC-3.17 BC-6.99 A²-2.25 B²-11.58 C²

式中，Y为TBC降解率； A、 B、 C分别为接种量、 胰蛋白胨浓度、 初始pH的编码值. 相关系数R2=0.962 7，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行实验结果预测.

预测模型的P值0.000 3远小于0.01，说明该模型是显著的. 结合响应面分析3维图(图 8,9,10)，可直观的看出各因素之间的交互作用，各实验各因素对TBC降解率的影响不是简单的线性关系，且对响应值的影响存在一个极值点.

图 8

Fig. 8

图 8 胰蛋白胨浓度和接种量对TBC降解率的影响 Fig. 8 Effect of the concentration of tryptone and inoculum volume on the TBC biodegradation

图 9

Fig. 9

图 9 初始pH和接种量对TBC降解率的影响 Fig. 9 Effect of the initial pH and inoculum volume on the TBC biodegradation

图 10

Fig. 10

图 10 初始pH和胰蛋白胨浓度对TBC降解率的影响 Fig. 10 Effect of the initial pH and concentration of tryptone on the TBC biodegradation

根据表 7方差分析数据可知，表明对TBC降解率的影响排序为：胰蛋白胨浓度(X₅)>接种量(X₆)>初始pH(X₁₀). 其中，X₅²、 X₁₀²对Y的影响差异极显著，X₆和X₆X₁₀对Y 的影响高度显著，而X₅、 X₁₀、 X₅X₆、 X₅X₁₀和X₆²对Y 的影响不显著.

表 7(Table 7)

表 7 Box-Behnken 实验回归分析结果 Table 7 Result of regression analysis of the Box-Behnken design 项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 常数 1 005.79 9 111.75 20.09 0.000 3 极显著 A 25.53 1 25.53 4.59 0.069 4 不显著 B 39.07 1 39.07 7.02 0.032 9 显著 C 8.38 1 8.38 1.51 0.259 2 不显著 AB 14.03 1 14.03 2.52 0.156 3 不显著 AC 24.70 1 24.70 4.44 0.073 1 不显著 BC 40.26 1 40.26 7.24 0.031 1 显著 A2 205.79 1 205.79 36.99 0.000 5 极显著 B2 21.38 1 21.38 3.84 0.090 7 不显著 C2 564.23 1 564.23 101.43 <0.000 1 极显著

表 7 Box-Behnken 实验回归分析结果 Table 7 Result of regression analysis of the Box-Behnken design

根据模型构建的方程进行偏导微分处理，求导得出方程组的3个解：A=2.97，B=1.44，C=8.12，即：接种量2.97%(φ)、 胰蛋白胨浓度1.44%(ρ)、 初始pH 8.12. 此时，YH1菌株对TBC降解率的最大预测值为98.21%.

为了验证模型预测的准确性和有效性，按照优化后的TBC降解条件进行3组平行实验，实际检测TBC的降解率达到98.16%，实验值与预测值之间具有良好的拟合性，表明回归方程能够比较真实的预测各因素对菌株YH1降解TBC的影响. 降解优化实验组与未优化实验组的结果比较发现，优化后的最佳降解条件可使菌株YH1对TBC的降解率提高6%左右.

假单胞菌属菌株在有毒害且难降解有机物的降解研究中较多见^[28,29]，本实验筛选得到的皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)对TBC等酚类化合物的降解的报道尚不多见^[30]，故对该菌株生理生化、 代谢途径和降解特性的研究有较重要的意义. 据报道，细菌降解芳香类化合物有邻苯二酚、 龙胆酸、 原儿茶酸等途径^[31]. 对芳香化合物主要代谢途径的研究表明，由不同酶完成起始的转化步骤都转变为有限的中间代谢产物，如原儿茶酸和(取代的)儿茶酚，这些双羟基中间代谢产物进一步代谢都是经间位裂解途径形成丙酮酸和乙醛，或经邻位裂解途径形成乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A进行的，通过不同的下游途径最终进入三羧酸(TCA)循环^[32]. 一般认为烷基取代芳烃生物降解的途径是从烷基侧脸的末端ω-氧化和β-氧化，然后再发生苯环的断裂^[33]. 本实验研究表明，菌株YH1能降解多种芳烃化合物如邻苯二酚、 苯酚、 对叔丁基邻苯二酚、 二苯胺、 五氯硝基苯、 辛基酚聚氧乙烯醚，并推测菌株TBC降解酶的活性中心可接纳苯环对位上存在烷基、 硝基、 氯基、 叔丁基、 羟基； 邻位上可存在氯基、 氨基、 羟基. 而在菌体粗酶液中检测到邻苯二酚1，2-双加氧酶的酶活，表明菌株YH1通过邻苯二酚邻位裂解途径使苯环开环，进而生成产物进入TCA循环. 结果与段佩玲等^[34]的C₂₃O途径降解苯酚的研究不同.

重金属抗性实验结果与龚斌等^[35]报道的Cd²⁺、 Co²⁺对苯酚降解物促进作用而Mn²⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺、 Pb²⁺在一定浓度浓度范围对苯酚降解有促进作用一致，浓度低于1.0 g ·L^-1的Pb²⁺、 Mn²⁺、 Cu²⁺、 Zn²⁺可促进菌株的生长，而Cd²⁺、 Sb³⁺、 Hg²⁺、 Ag⁺对菌株的生长有强烈的抑制作用. 菌株YH1在偏酸和偏碱条件下，TBC降解能力受到抑制，这可能与微生物表面电荷随pH改变而改变，进而影响微生物对TBC的吸收和利用^[36]. 而菌株在中性或偏碱性的环境中可较好地生长和降解TBC，生长量和降解率随着pH的增加而增加，主要与TBC在碱性环境下以盐的形态存在，溶解性较好，菌体能充分利用该盐作为碳源和能源进行生长代谢^[37]. 外加碳源实验中低浓度的蔗糖可促进菌体生长和降解，而高浓度的蔗糖明显抑制了TBC的降解，结果与Hess等^[38]的研究结果相一致，表明蔗糖和TBC两种底物之间存在非竞争性交叉抑制作用，蔗糖明显地抑制单位降解菌生物量对TBC的降解率.

(1)本研究从株洲某化工厂污水处理车间的污泥样品中分离到1株TBC降解菌，经形态特征、 生理生化、 BIOLOG微生物全自动鉴定仪和16S rDNA序列分析，该菌鉴定为Pseudomonas corrugate，命名为YH1. 菌株YH1能够利用TBC为唯一碳源和能源生长，30℃、 200 r ·min^-1培养96 h可使初始浓度为500 mg ·L^-1的TBC降解率达到92.35%.

(2)在以TBC为碳源和能源的培养基中，检测到了与TBC降解相关的主要酶活性-邻苯二酚1，2-双加氧酶，证明菌株YH1主要通过邻位开环裂解途径降解TBC. 对菌株YH1的相关降解酶研究表明，菌株YH1的相关降解酶位于胞内，只有诱导后菌体才能产生邻苯二酚1，2-双加氧酶的活性. 利用特异引物进行PCR扩增可从菌株YH1基因组中扩增出1条251 bp的片段，测序比对结果显示该片段为邻苯二酚1，2-双加氧酶基因片段.

(3)通过质粒检测和消除发现菌株YH1具有1个较大的质粒，且菌株YH1对TBC的降解与质粒有关.此外，对降解底物广谱性研究表明，菌株YH1能降解多种芳香族化合物. 同时菌株YH1还能耐受多种重金属和高浓度的NaCl.

(4)采用Placket-Burman实验设计筛选出影响菌株YH1菌株降解TBC的主要因素为接种量、 胰蛋白胨浓度和初始pH. 应用响应面法分析优化设计TBC降解的最佳条件为：蔗糖浓度3%(ρ)、 胰蛋白胨浓度1.44%(ρ)、 TBC浓度400 mg ·L^-1、 初始pH值8.12、 接种量2.97%(φ)、 温度30℃、 培养时间96 h，在此条件下TBC降解率可达98.21%.