生物曝气单元是传统活性污泥法污水生物处理过程中最大的耗能环节，约占污水处理厂总能耗的50%~70%^[1]. 为了实现持续稳定的硝化效果，污水处理厂通常将溶解氧(DO)浓度控制在2 mg ·L^-1以上^[2]. 但是近来的研究表明，在较低的溶解氧浓度下也能实现完全的硝化作用^{[3, 4, 5]}，而且在低DO条件下运行不仅可以提高污泥系统的生物量^[6],而且可以大大提高氧气利用率^[7]. 如果污水厂能在低DO浓度条件下稳定达标运行，那么将大大提高氧转移效率，可使整个污水厂降低10%左右的能耗^[4]. 本研究通过一个长期运行的缺氧/好氧(A/O)小试试验系统，考察了在不同溶解氧浓度下，系统的除碳脱氮效果和系统内细菌群落结构的变化规律，探讨了A/O的运行特性与微生物群落结构间的相互关系，以期为实际污水厂能在低溶解氧浓度下实现稳定高效的硝化效果，节约能耗提供可靠的理论依据. 1 材料与方法 1.1 材料

接种污泥取自北京北小河污水处理厂. 进水为人工配水，其水质化学需氧量(COD)为300~400 mg ·L^-1，氨氮(NH₄⁺-N)为45~55 mg ·L^-1，pH控制在7.5~8.5. 1.2 反应器装置和运行条件

本研究采用缺氧/好氧(A/O)工艺，缺氧和好氧池总体积为37.5 L，缺氧池/好氧池的体积比为1 ∶4，水力停留时间为9 h，沉淀池体积为24 L，停留时间为3 h. 进水流量为96L ·d^-1，混合液回流比R=200%，污泥回流比r=150%. 装置如图 1所示.

图 1

Fig. 1

1.进水桶; 2.进水泵; 3.A/O反应池; 4.搅拌器; 5.曝气头;6.内回流泵; 7.污泥回流泵; 8.二沉池图 1 反应器装置示意 Fig. 1 Diagram of the experimental system

在试验过程中，温度维持在20~25℃，SRT为20 d，反应器初始污泥浓度在3 000 mg ·L^-1左右，待污泥浓度稳定在5 000 mg ·L^-1左右时进行排泥. 以DO为3 mg ·L^-1启动反应器. 反应器分别在DO为3、 2、 1和0.5 mg ·L^-1下运行. 1.3 水质测定

系统运行期间每隔2~3 d取水样测定进出水水质，采用国标法进行测定^[8]，检测项目包括COD、 NH₄⁺-N、 NO₂^--N、 NO₃^--N和TN. 在每个工况的运行后期采集活性污泥样品，置于-80℃保存. 1.4 活性污泥细菌群落结构分析 1.4.1 DNA的提取

采用改进的Zhou法提取活性污泥的DNA^[9]，即玻璃珠振荡-SDS-氯仿异戊醇法. 1.4.2 总细菌的聚合酶链式反应(PCR)扩增

采用通用引物27F(AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG)和518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)先进行第一轮PCR扩增，再用带40 bp的GC夹的357F(CCTACGGGAGGCAGCAG)和518R进行巢式PCR. 最终总细菌的PCR扩增产物为220 bp长的16S rDNA片段. PCR反应的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测. 1.4.3 PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)

将4 μL PCR样品和1.5 μL 6倍加样缓冲液混合，在D-code系统(Bio-Rad，美国)上进行，用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度为45%~75%，在110 V的电压下60℃电泳6 h，用SYBR GREEN I染料对凝胶进行染色，利用凝胶成像系统(Bio-Rad，Gel-Doc^TM XR+，美国)进行拍照，获得DGGE指纹图谱. 1.4.4 基因测序

用洁净的手术刀切取DGGE图谱中的目的条带，利用聚丙烯酰胺DNA回收试剂盒(Solarbio，北京)进行回收，回收纯化后的DNA用357F和518R进行PCR扩增，产物送上海英骏生物公司进行测序. 序列通过NCBI进行在线BLAST分析，选取相关序列，采用MEGA 6.0软件的邻近相接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树^[10].

通过比较相似性系数(C_s)来分析样品图谱的相似性^[11]. 试验所得图像用BIO-RAD的Quantity One软件分析. 微生物多样性指数采用Shannon-Wiener指数(H′)表示^[12]，计算公式如下：

式中，P_i=n_i/N，n_i为第i个条带的强度； N为所有条带强度总和. 2 结果与讨论 2.1 不同DO环境下A/O系统的运行效果 2.1.1 不同DO环境下A/O系统的COD去除效果 A/O小试系统分别在DO为3、 2、 1和0.5 mg ·L^-1下运行，进水COD为300~400 mg ·L^-1，出水COD均在50 mg ·L^-1以下，COD的平均去除率分别为88.7%、 86.7%、 85.8%和89.7%(图 2).

图 2

Fig. 2

DO单位为mg ·L图 2 不同DO条件下反应器对COD的去除效果 Fig. 2 COD removal in the reactor underdifferent DO concentrations

以溶解氧为3 mg ·L^-1启动反应器，小试A/O系统在系统刚启动时出水COD较高，活性污泥驯化至20 d左右时即达到稳定状态. 将系统曝气池中的溶解氧调至1 mg ·L^-1时，由于突然从高溶解氧(2 mg ·L^-1)调节至低溶解氧状态，运行初始阶段出水水质存在波动，但长时间培养和驯化后出水COD处于稳定状态. 继续降低曝气池中的DO浓度，COD去除效果未发生明显变化，说明A/O小试系统中DO的降低对COD的去除影响并不显著，即在低DO(0.5 mg ·L^-1)的条件下仍然能很好地去除系统中的COD.

这样的结果证明了系统中的DO浓度并不是COD去除的限制性因素，即使在低DO浓度下，A/O系统仍然能保证较高的COD去除率. 为了进一步验证这个结论，在其他的试验中，将DO降为约0~0.2 mg ·L^-1时,系统COD的去除率也没有受到太大影响. 类似的结论也被其它研究者报道过^[4,13]. 因此，对于一个A/O工艺的实际污水处理厂，如果只是要求去除COD，那么可以将系统的DO浓度大幅度地降低，这样可以节约大量的运行成本. 2.1.2 不同DO环境下A/O系统的NH₄⁺-N和TN去除效果

图 3

Fig. 3

DO单位为mg ·L图 3 不同DO条件下反应器对氮素的去除效果 Fig. 3 Nitrogen removal in the reactor underdifferent DO concentrations

由图 3可知，在DO为3、 2、 1和0.5 mg ·L^-1条件下的稳定运行期，NH₄⁺-N的去除率均大于98%，当把系统曝气池中的溶解氧调至1 mg ·L^-1时，由于突然从高溶解氧(2mg ·L^-1)调节至低溶解氧状态，运行初始阶段出水水质存在波动，但长时间培养和驯化后出水氨氮和总氮均达到了稳定状态，TN的去除率分别为87.2%、 86.2%、 85.5%和88.0%. 此结果说明即使在低溶解氧(0.5 mg ·L^-1)条件下，A/O小试系统也具有很好的脱氮效果.

一般地，硝化反应过程是在好氧条件下进行，氧气作为电子受体，氮元素作为电子供体，将氨氮氧化为硝酸盐. 硝化细菌将1 g氨氮氧化为硝酸盐氮需要消耗氧气4.57 kg (其中亚硝化反应耗氧3.43 kg，硝化反应耗氧1.14 kg). 因此，为了能充分实现硝化反应，污水处理厂往往将DO设计到2 mg ·L^-1 以上^[2]. 根据本试验结果，在DO为0.5 mg ·L^-1的低DO情况下，系统也能很好地实现硝化作用，这样可以大幅度节约硝化反应所需要的能源. 如果DO从0.5 mg ·L^-1继续降低，将会对系统的硝化效果产生影响，这个时候必须增大污泥停留时间(SRT)来补偿氧气的不足. Liu等^[4]的研究结果也证明了这一点，他们考察了SRT为10 d和40 d两种情况下，当DO降低到0.2 mg ·L^-1以下时，在SRT为10 d的系统中硝化效果很难达到稳定，而在SRT为40 d的系统中硝化效果较为稳定.

图 4

Fig. 4

A.3.0 mg·L-1; B.2.0 mg ·L-1; C.1.0 mg ·L-1; D.0.5mg ·L-1图 4 不同DO条件下总细菌的DGGE图谱 Fig. 4 DGGE profile of total bacteria underdifferent DO concentrations

总细菌的DGGE图谱如图 4所示. 从中可以看出，微生物群落结构随DO浓度的降低而发生了变化. 部分条带随DO降低逐渐消失或减弱，比较明显的有条带5、 12、 13，说明这部分条带所代表的细菌对低溶解氧环境的适应性降低，在低DO系统中转变为非优势种群； 一部分条带随DO降低逐渐增强，如条带4、 7、 10和15，说明此类条带所代表的细菌适合在低DO环境下生存，在低DO系统中变为优势菌群，其可能在低DO条件下对污水中污染物的去除起着关键的作用； 也有部分条带随DO降低并无明显变化，如条带1、 3、 6、 14和16，这说明此类条带所代表的细菌在高DO和低DO环境下均能生存，对DO的适应性比较强.

图 5显示了DGGE图谱的条带分布和强度. 通过软件计算发现，尽管系统的DO降低了，但是细菌的种类和丰度并没有降低，证明了系统内的生物量不会因为DO的降低而减少. 这对于保持系统内的生物功能具有很大的作用.

图 5

Fig. 5

A.3.0 mg·L-1; B.2.0 mg ·L-1; C.1.0 mg ·L-1; D.0.5mg ·L-1图 5 不同DO条件下DGGE图谱的条带数和强度 Fig. 5 Band number and intensity of DGGE profileunder different DO concentrations

每个工况的DGGE图谱各样品间的相似性如表 1所示. 高溶解氧(3 mg ·L^-1和2 mg ·L^-1)环境中的总细菌群落结构相似性较高，低溶解氧(1 mg ·L^-1和0.5 mg ·L^-1)环境也有着较高相似性的种群结构. 从高DO变化到低DO，系统内细菌群落结构的动态变化率约为30%~50%，这种水平的群落变化属于中高程度的变化^[14]. 然而，这种细菌群正常的动态变化其对系统的功能稳定性并没有造成太大的影响，这个结果与其它的研究者的结论是一致的^[15,16]. 然而，这部并不意味着系统的功能稳定性与系统内微生物群落结构的变化没有关系，如果系统内的微生物群落结构发生了突变或者剧烈的变化，将会破坏系统的功能稳定性^[17].

在本研究中，通过长期的低DO环境运行，淘汰了一批不能适应低DO环境的细菌群落，培养和驯化了一批能适应低DO环境的细菌群落，这种随着环境的变化而导致系统内物种的正常更替不会影响系统的功能稳定性，从而保证了良好的出水水质.

表 1(Table 1)

表 1 不同溶解氧工况下总细菌的种群相似系数 (Cs) Table 1 Similarity coefficient of total bacteria underdifferent DO concentrations 溶解氧/mg·L-1 3 2 1 0.5 3 100 68.8 42 50.3 2 100 61.6 66.2 1 100 65.4 0.5 100

表 1 不同溶解氧工况下总细菌的种群相似系数 (Cs)Table 1 Similarity coefficient of total bacteria underdifferent DO concentrations

将图 4中的条带进行测序后，在GenBank中进行比对，获得各条带的同源性信息，并构建其系统发育树(图 6). 其结果表明，A/O小试系统中微生物群落的大部分优势种群得到了很好地鉴定. 在已知种属的细菌中，条带1、 6、 7、 8、 9、 10、 11和12均被鉴定为α-Proteobacteria； 条带14被鉴定为β-Proteobacteria； 条带3、 5、 17被鉴定为γ-Proteobacteria； 条带4被鉴定为绿弯菌门(Chloroflexi)； 条带16被鉴定为硝化螺旋菌目(Nitrospirales)； 其余的条带(2、 13和15)均被鉴定为Uncultured bacterium.

从鉴定结果可以看出系统中的大部分细菌属于变形菌纲(Proteobacteria)，约占系统总细菌的58.8%，这也与从实际污水厂和小试系统的活性污泥中检测出的结果相一致^{[18, 19, 20, 21]}. 其中，α-Proteobacteria数量最多(41.1%)，其次是γ-Proteobacteria(17.6%)和β-Proteobacteria(5.8%). 在这个研究中，低溶解氧(0.5mg ·L^-1)系统中的优势微生物种群非常丰富，包含所有被鉴定出来的细菌种群，这为低溶解氧系统的功能稳定性提供了保障.

图 6

Fig. 6

图 6 A/O系统中总细菌系统发育树 Fig. 6 Phylogenetic tree of total bacteria in the A/O system

活性污泥中变形菌(Proteobacteria)的主要作用是去除各种有机物和营养物^{[22, 23, 24, 25]}. 相关研究表明,生丝微菌科Hyphomicrobiaceae的细菌具有好氧反硝化作用^[26]，Thiothrix sp.是活性污泥中主要的丝状菌^[27]，这类菌群也适合在低DO环境下生存，这与Martins等^[28]报道的结果一致. 2.3 A/O系统的微生物群落结构多样性

根据总细菌的DGGE图谱(图 4)，进行A/O系统的微生物群落多样性指数计算，根据各条带的强度计算出每个工况的Shannon-Weiner指数，如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 不同溶解氧工况下总细菌的种群多样性 (H′) Table 2 Shannon-Weiner index of total bacteria underdifferent DO concentrations 项目 溶解氧/mg·L-1 3 2 1 0.5 条带数/个 19 22 18 17 H′ 2.69 2.97 2.74 2.72

表 2 不同溶解氧工况下总细菌的种群多样性 (H′) Table 2 Shannon-Weiner index of total bacteria underdifferent DO concentrations

在不同的溶解氧环境下，A/O小试系统中微生物的多样性均处于较高的水平^[29,30]. DO为2 mg ·L^-1时小试A/O系统中微生物的多样性最高，优势物种的条带数也最多，尽管DO为3 mg ·L^-1时，活性污泥中的优势微生物物种的条带数多于1 mg ·L^-1和0.5 mg ·L^-1的工况，但是，根据DGGE图谱分析，在DO为3 mg ·L^-1时，系统中各优势物种的分布均匀性较低，这导致了DO在3 mg ·L^-1时系统的微生物多样性低于DO为1 mg ·L^-1和0.5 mg ·L^-1的工况. 随着溶解氧的降低，小试系统中优势菌种的数量有所降低，但是在长期的培养和驯化后，相应的细菌逐渐适应了低溶解氧的环境，系统最终达到了稳定的状态. 在低溶解氧的稳定状态下，系统中各种优势细菌分布的均匀性有所提高，各种优势菌种并存，各自占有稳定的生态位，活性污泥系统处于稳定状态，因此，在DO为1 mg ·L^-1和0.5 mg ·L^-1时A/O小试系统仍具有较高的微生物多样性. 3 结论

(1)小试A/O活性污泥系统在不同的DO工况下(3、 2、 1和0.5 mg ·L^-1)运行，均取得了很好的除碳和脱氮效果. 其中，COD的平均去除率分别为88.7%、 86.7%、 85.8%和89.7%； NH₄⁺-N的去除率均大于98%； TN的去除率分别为87.2%、 86.2%、 85.5%和88.0%. 由此证实了A/O活性污泥系统在低DO条件下也能实现稳定的除碳和脱氮功能.

(2)PCR-DGGE的解析结果表明，小试A/O活性污泥系统中微生物群落结构和多样性随DO的变化而发生变化，高DO与低DO环境中的细菌群落结构的动态变化水平约为30%~50%. 即使DO的降低会导致系统内微生物种群的动态变化，但系统内细菌种群的数量和丰度并未减小，更不会使微生物量损失，因而不会导致系统功能紊乱.

(3)系统发育树的鉴定结果表明，A/O小试系统活性污泥中的优势菌群主要为Proteobacteria、 Chloroflexi和Nitrospirales. 低DO环境下，系统中的微生物种类非常丰富，包含所有被鉴定出来的细菌种群，这为低DO系统的功能稳定性提供了保障.