环境雌激素是指能够干扰生物体内天然激素的合成、 分泌、 运输、 结合、 反应和代谢等，从而影响生物生殖等功能的外源性化学物质^[1]. 环境雌激素包括天然雌激素和人工合成雌激素^[2]，天然雌激素属于类固醇物质，主要由人和动物体内卵巢细胞产生，其中雌二醇(17β-estradiol，E2)具有较强的毒性，53.6 ng ·L^-1E2可以引起绵鳚胚胎严重畸形^[3]； 人工合成雌激素既包括与E2结构相似的类固醇衍生物，也包括结构简单的非甾体激素，其中己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)与E2具有相同药理与治疗作用，但极微量DES便可导致雌性小鼠卵巢功能紊乱、 肥胖和垂体瘤^[4]. 环境中E2和DES不易被去除，并易在水体和畜禽粪便中富集^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}，付银杰等^[6]检测出牛粪中E2高达107.95 μg ·kg^-1，Zhou等^[7]检测出北京污水中E2和DES分别高达67.4 ng ·L^-1和11.1 ng ·L^-1，如何消除水和畜禽粪便中E2和DES很受关注.

目前关于E2和DES的生物去除研究多处于雌激素降解功能菌株纯培养阶段，并且多针对单一污染物，并未应用于自然污水和畜禽粪便^[11]. 近年来，国内外能降解E2的菌株有Stenotrophomonas maltophilia^[12]、 Pseudomonas putida^[13]、 Bacillus subtilis^[14]等，能降解DES的菌株有Serratia sp.^[15]、 Pseudomonas sp.^[16]. 本实验室已经分离得到了1株E2降解菌株Rhodococcus sp. JX-2和1株DES降解菌株Serratia sp. S，摇瓶培养7 d，Rhodococcus sp. JX-2对30 mg ·L^-1 E2的降解率为95%，Serratia sp. S对50 mg ·L^-1 DES的降解率为68%^[15]. 然而由于富集E2和DES的污水和畜禽粪便成分非常复杂，实验室筛选的功能菌株可能会因不适应环境而使活性受到抑制、 与土著微生物竞争处于劣势、 难以回收等缺点，在应用中受到限制^[17]. 而固定化微生物菌剂技术因具有耐环境冲击、 可回收利用、 显著提高修复效率等优点，使其成为弥补游离菌株不足的选择，目前已广泛应用于有机污染物的处理^{[17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34]}，如Ahmad等^[18]固定化Acinetobacter sp.后，降解1 100 mg ·L^-1苯酚的时间较游离态细菌缩短了132 h，并且固定化菌株能够降解1 300 mg ·L^-1苯酚，而游离态细菌不能降解； Hazaimeh等^[19]将6株革兰氏阴性菌Pseudomonas sp.、 Serratia sp.、 Flavobacterium sp.、 Chryseomonas sp.、 Xanthomonas sp.、 Agrobacterium sp.和3株阳性菌 Arthrobacter sp.、 Bacillus sp.、 Micrococcus sp.构建为混合功能菌群后固定化，与游离菌群相比，6周内对原油的降解率提高了17.52%，完全降解原油的时间缩短了25%. 由于需要将固定化菌剂投加至污水和牛粪，所以固定化菌剂所选择的载体材料应用于水体应具有传质性能好、 便于回收的特点； 在牛粪中由于不需回收，载体材料应具有可生物降解、 对功能菌株和环境无毒、 可吸附污染物的特点. 海藻酸钠作为常用的载体材料，具有传质性能好、 无毒、 可被土壤微生物降解的特点^[20]，所以本研究采用海藻酸钠为载体材料.

本研究通过海藻酸钠包埋法将菌株Rhodococcus sp. JX-2和菌株Serratia sp. S制备成固定化混合功能菌剂，探讨了该菌剂对E2和DES的去除效能，将其投加至实际污水和牛粪中，分析了其应用效果，以期为利用固定化功能菌剂来有效去除污水和牛粪中雌激素、 规避雌激素污染风险等提供新思路和途径. 1 材料与方法 1.1 供试菌

E2降解菌株Rhodococcus sp. JX-2与DES降解菌株Serratia sp. S均由本实验室分离，保藏至中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCC 9636和CGMCC 1.12941.

LB培养基与MSM培养基制备方法参照文献^[35]. 含有E2和DES的MSM培养基：800 mg ·L^-1E2和DES甲醇溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌三角瓶中，待甲醇挥发后加入MSM培养液，使E2和DES达到实验设计的质量浓度.

E2和DES均购自上海阿拉丁试剂有限公司，纯度≥98%.

以海藻酸钠质量分数、 菌胶比、 CaCl₂ ·2H₂O质量分数和混合菌体积比作为试验因素，采用正交试验法，设计四因素三水平的正交表L₉(3)⁴，以E2和DES去除率为指标，各因子水平取值见表 1. 制备固定化菌剂的方法为：菌株JX-2和菌株S分别接种于LB培养基，摇床30℃、 150 r ·min^-1振荡24 h后，调D600=1.0^[35]. 将两株菌的菌悬液按一定体积比混匀后，与海藻酸钠以一定的菌胶比充分混匀，匀速滴入4℃的CaCl₂溶液后，于4℃交联6 h，得到直径为3~5 mm的固定化颗粒(图 1). 用无菌生理盐水冲洗后使用.

表 1(Table 1)

表 1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment 水平 因素A(海藻酸钠质量分数/%) 因素B(菌液与海藻酸钠体积比) 因素C(CaCl2·2H2O质量分数/%) 因素D(菌株S与菌株JX-2体积比) 1 4 1∶1 2 1∶1 2 5 1∶2 3 1∶2 3 6 2∶1 4 2∶1

表 1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

图 1

Fig. 1

图 1 固定化菌剂照片Fig. 1 Photo of bacteria-immobilized agents

在E2和DES添加质量浓度为1、 2、 5、 10、 15、 20、 25 mg ·L^-1的MSM培养基中，加入5%接菌量的固定化菌剂，30℃、 150 r ·min^-1摇床培养，0~7 d后取样，测定培养液中E2和DES质量浓度，计算E2和DES残留率或去除率. 以接入相等菌量的游离菌剂的处理作为阳性对照，不接种微生物的空白小球的处理作为阴性对照. 1.4.2 固定化菌剂对污水中E2和DES的去除

采集南京某湖泊中污水入口的湖水样品，调节水样pH至5.0~9.0，在1 L水样中投加200、 300、 400、 500、 600 g ·L^-1固定化菌剂，30℃、 150 r ·min^-1振荡培养7 d后，测定水中E2和DES质量浓度，计算E2和DES去除率. 以接入相等菌量的游离菌剂作为阳性对照，不接种微生物的空白小球的处理作为阴性对照.

牛粪采自南京某奶牛养殖场. 冷冻干燥后称取50.00 g牛粪平铺于15 cm×15 cm的培养皿中，将600、 800、 1 000、 1 200、 1 400 g ·kg^-1的固定化菌剂洒在牛粪上，与牛粪混匀后加入一定量的超纯水，保持牛粪含水量40%~70%，置于30℃培养，每隔12、 18、 24 h翻堆搅拌，7 d后测定牛粪中E2和DES去除率. 以接入相等菌量的游离菌剂作为阳性对照，不接种微生物的空白小球的处理作为阴性对照.

测定方法为整瓶提取，加入等体积甲醇，超声振荡30 min后，分别用HPLC/FLD和HPLC法测定E2和DES质量浓度. 高效液相色谱(岛津LC-20AT)参数为：Inertsil ODS-SP-C₁₈反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，E2的流动相为甲醇/乙腈/水(体积比为25 ∶30 ∶45)，荧光激发和发射波长分别为280 nm和310 nm. DES的流动相为乙腈/水(体积比为80 ∶20)，紫外检测波长230 nm. 流速1 mL ·min^-1，柱温40℃，进样量20 μL.

水样以约5 mL ·min^-1的流速通过已分别用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化的C₁₈固相萃取柱(200 mg/6 mL)，5 mL超纯水淋洗柱体并抽吸3 min后，用15 mL甲醇洗脱，洗脱液收集至试管中. 试管置于40℃恒温水浴并用氮气吹干后，加入50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至2 mL，过0.22 μm孔径滤膜，分别用HPLC/FLD和HPLC分析.

冷冻干燥牛粪后，充分搅拌，五点取样法共称取1.00 g粪样于玻璃离心管中，加入20 mL乙酸乙酯，涡旋30 s后超声30 min，以4 500 r ·min^-1离心30 min，上清液转入另一离心管，重复提取粪样1次，合并提取液，4 500 r ·min^-1离心20 min，取上清液用氮气吹干，甲醇溶解，超纯水稀释至50 mL. 将溶液以3 mL ·min^-1流速过已活化的C₁₈固相萃取柱(200 mg/6 mL)，用5 mL超纯水淋洗柱体并抽吸3 min，15 mL体积比为1 ∶1的甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液收集至试管中. 将试管置于40℃恒温水浴并用氮气吹干，加入甲醇溶液重新溶解至2 mL，过0.22 μm孔径滤膜，分别用HPLC/FLD和HPLC分析.

实验所得数据用Microsoft Office Excel 2010软件进行处理. 雌激素去除率计算公式如下:

通过设计四因素三水平正交试验，优化了海藻酸钠包埋菌株JX-2和菌株S的条件. 由表 2可见，去除E2和DES固定化混合菌剂制备的最优方案分别为A₂B₃C₂D₃(因素A取2水平，因素B取3水平，因素C取2水平，因素D取3水平)和A₂B₂C₃D₁(因素A取2水平，因素B取2水平，因素C取3水平，因素D取1水平). 但是方案A₂B₃C₂D₃可能由于菌胶比为2 ∶1，导致海藻酸钙浓度较低，结构较疏松，胶珠难成型，并且由DES的最优方案A₂B₂C₃D₁制得的固定化菌剂对E2的去除率最高，所以最佳方案选定为A₂B₂C₃D₁.

表 2(Table 2)

表 2 固定化菌剂去除E2和DES的正交试验结果 1) Table 2 Orthogonal experiment results of E2 and DES removal by the immobilized bacteria 实验编号 因素 E2去除率 /% DES去除率 /% A B C D 1 1 1 1 1 84.46 59.46 2 1 2 2 2 90.58 57.28 3 1 3 3 3 96.80 67.17 4 2 1 2 3 97.57 53.39 5 2 2 3 1 98.83 94.96 6 2 3 1 2 98.46 75.62 7 3 1 3 2 90.16 63.55 8 3 2 1 3 97.86 73.62 9 3 3 2 1 98.30 63.13 K1 271.84 272.19 280.78 281.59 K2 294.86 287.27 286.45 279.20 K3 286.32 293.56 285.79 292.23 K1′ 183.91 176.40 208.70 217.55 K2′ 223.97 225.86 173.80 196.18 K3′ 200.30 205.92 225.68 194.18 R 23.02 21.37 5.67 13.03 R′ 40.06 49.46 51.88 23.37 1)K为同一因素E2去除率的合计值，K′为同一因素DES去除率的合计值，R为E2去除率极差，R′为DES去除率极差，单位均为%

表 2 固定化菌剂去除E2和DES的正交试验结果 1) Table 2 Orthogonal experiment results of E2 and DES removal by the immobilized bacteria

由图 2可知，固定化菌剂对E2和DES的去除率高于游离态菌剂. 固定化菌剂、 游离态菌剂、 空白小球7 d对初始质量浓度为2 mg ·L^-1E2去除率分别为99.42%、 96.86%、 13.55%，对初始质量浓度为2 mg ·L^-1DES去除率分别为84.59%、 70.89%、 15.58%，推测固定化菌剂对E2和DES去除率高于游离态菌剂的原因可能是固定化菌剂依靠吸附和生物降解的协同作用去除E2和DES^{[17, 21, 22, 23]}. 24 h时，固定化菌剂和游离态菌剂对E2和DES去除率差别明显，E2去除率分别为45.75%和11.63%，DES去除率分别为33.80%和11.17%，可能是由于E2和DES溶解度很低，低浓度的碳源导致游离态菌剂无法高效利用，固定化菌剂由于外壳海藻酸钙具有吸附作用，前24 h内固定化菌剂达到吸附饱和，在菌剂内部的菌剂接触到的E2和DES的浓度较大，有利于菌剂更好地摄取底物，促进底物去除^[23]. 第4 d固定化菌剂E2残留质量浓度为0.03 mg ·L^-1，而游离态菌剂第7 d E2为0.07 mg ·L^-1；第5 d固定化菌剂DES残留质量浓度为0.35 mg ·L^-1，而游离态菌剂7 d DES为0.46 mg ·L^-1，可见固定化菌剂去除时间短于游离态菌剂.

随着去除天数增加，E2和DES残留浓度越来越低，游离菌剂降解到6 d后停止降解E2，而固定化菌剂可能由于球体外壳为具有吸附作用的海藻酸钙，内部的菌剂接触到的E2浓度高于游离菌，使菌剂能够继续摄取底物^{[22, 23]}，7 d固定化菌剂去除E2和DES残留质量浓度分别为0.01 mg ·L^-1和0.24 mg ·L^-1. 无论是固定化菌剂还是游离态菌剂，前48 h对E2和DES的去除速率较快，随后去除速率变缓，原因可能是随着培养时间延长，培养液中营养物浓度降低或菌剂降解污染物时产生了某些代谢产物，抑制了菌株生长繁殖. 另一方面，海藻酸钙凝胶小球内部呈多孔道结构，菌株在其中增殖，随着菌株数量增多，占据的孔道越多，不仅影响了载体的传质性能，而且氧气扩散速率减慢，同时细胞生长空间减小，从而阻碍了细胞的增殖^{[17, 20, 24]}.

图 2

Fig. 2

图 2 以E2和DES为唯一碳源时，菌剂对E2和DES的去除Fig. 2 Removal of E2 and DES in solution by bacteria using E2 and DES as the sole source of carbon

图 3

Fig. 3

图 3 污染浓度对菌剂去除E2和DES的影响 Fig. 3 Effect of initial concentrations on E2-elimination and DES-elimination by bacteria

由图 3可见，随着E2和DES从1 mg ·L^-1增至5 mg ·L^-1，固定化菌剂和游离态菌剂对E2和DES的去除率提高，固定化菌剂和游离态菌剂对E2去除率分别达到98.98%和98.61%，对DES去除率分别达到87.32%和82.59%. 由于E2和DES为MSM中唯一碳源，可以被菌剂利用来满足自身生长繁殖，当E2和DES浓度较低时，菌剂可利用的碳源较少，生长缓慢，因此去除率较低； 随着E2和DES添加浓度提高，可利用的碳源增多，菌剂大幅生长，去除率同时提高^[25]. 随着E2和DES从5 mg ·L^-1增至25 mg ·L^-1，

固定化菌剂和游离态菌剂对E2和DES的去除率均逐渐降低，固定化菌剂和游离态菌剂对E2的去除率分别降低了38.28%和37.93%，对DES的去除率分别降低了18.08%和22.28%. 可能是高浓度的E2和DES对菌株生长有毒害作用，并且由于两株菌株的降解专一性，如菌株JX-2只能降解E2，不能降解DES，高浓度的DES对菌株JX-2产生了毒害作用，导致菌株JX-2降解E2的能力降低. 同等浓度条件下，固定化菌剂的去除率高于游离态菌剂，E2和DES低于或高于15 mg ·L^-1时，固定化菌剂与游离态菌剂的去除率差异较小，此结果与Ahmad等^[18]研究结果类似. 当E2和DES为15 mg ·L^-1时固定化菌剂、 游离态菌剂、 空白小球对E2去除率分别为84.92%、 67.96%、 5.91%，对DES去除率分别为79.21%、 63.14%、 9.89%，固定化菌剂与游离态菌剂的去除能力差异较大，这可能是由于在固定化体系中，海藻酸钙外壳为包在内部的菌体提供了一定的保护作用，当E2和DES从载体外部扩散进入载体内部，形成了浓度梯度，降低了E2和DES对载体内部细菌的毒性^[24].

图 4

Fig. 4

图 4 接种量对菌剂去除污水中E2和DES的影响 Fig. 4 Effect of inoculation volume on E2 and DES removal from polluted water by bacteria

实验测得污水水样中E2和DES质量浓度分别为0.70 μg ·L^-1和21.05 μg ·L^-1. 由图 4可见，同等接种量条件下，固定化菌剂对E2和DES去除率分别高于游离态菌剂22.16%~30.20%和27.63%~40.55%. 两株供试菌的筛选条件均为MSM中添加E2或DES为唯一碳源驯化所得，污水中可供菌株生长的营养可能较低或者菌株不适应污水环境，菌株的生长受到影响，而固定化菌剂内部为MSM体系，与菌株习惯的环境没有明显差异，所以菌株可以正常生长. 此外，固定化菌剂不仅可以通过海藻酸钙将菌剂包埋在球体内部，屏蔽污水中细菌等恶性竞争，而且可以通过小球的吸附使得固定化菌剂接触的E2和DES浓度高于游离态菌剂，可利用的碳源增多，有利于菌剂的生长^[20].

图 5

Fig. 5

图 5 pH值对菌剂去除E2和DES的影响 Fig. 5 Effect of pH values on E2 and DES removal from polluted water by bacteria

接种量从200 g ·L^-1增至600 g ·L^-1，固定化菌剂对E2去除率从74.82%增至91.14%，对DES去除率则从68.07%增至97.22%. 投加量为300 g ·L^-1时，菌剂对污水中E2和DES的去除率分别达到84.64%和90.82%，残留E2和DES分别为0.11 μg ·L^-1和1.93 μg ·L^-1. 菌剂投加量大于500 g ·L^-1时，虽然残留E2和DES分别为0.06 μg ·L^-1和0.59 μg ·L^-1，但是菌剂处于贫营养状态，细胞自溶死亡，污水体系浑浊.

由图 5可见，同等pH条件下，固定化菌剂对E2和DES去除率分别高于游离态菌剂5.88%~49.07%和26.50%~65.66%. pH不仅可以改变细胞膜的通透性，扰乱细胞对物质的交换过程，而且可以通过影响酶的离解过程进而影响酶活^{[24, 25]}. 与游离态菌剂相比，固定化菌剂由于海藻酸钙的保护作用，不仅缓解了酸性或碱性环境对菌剂的伤害，而且影响了酶活，使底物与酶的结合位点更能承受pH变化，从而增强了菌剂对DES和E2的去除能力^[24]. 游离态菌剂最适pH为8.0~9.0，而固定化菌剂最适pH为5.0~6.0. 经固定化后，最适pH向酸性偏移，在固定化细胞的酶活位点有了更宽的适应范围，使得固定化细胞对外界pH变化不敏感的前提下，主要是因为酸性有利于海藻酸钠的钙化率提高，而碱性越大，钙化率降低，菌株易泄漏于污水中，污水体系越浑浊^[26].

pH=5.0时固定化菌剂去除E2和DES的效率最高，DES去除率为100%，E2去除率为95.85%，E2残留浓度为0.03 μg ·L^-1. 菌剂在pH>7.0的碱性环境下对DES去除率的提高可能是化学和生物共同作用的结果，DES因含酚羟基可发生化学反应^[15]. 综上，由于固定化菌剂对E2和DES去除率高于游离态菌剂，并且固定化菌剂方便回收，对环境无污染，所以治理污水E2和DES方法优选为：固定化菌剂用量300 g ·L^-1，pH值为5.0~6.0.

实验测得所采集的牛粪中E2含量为0.48 mg ·kg^-1，DES含量为2.80 mg ·kg^-1. 由图 6可见，同等接种量条件下，固定化菌剂对E2和DES去除率分别高于游离态菌剂26.44%~43.80%和25.64%~36.98%. 固定化载体可以吸附E2和DES，600 g ·kg^-1空白小球可以吸附0.01 mg ·kg^-1E2和0.12 mg ·kg^-1DES，固定化菌剂接触到的E2和DES高于游离态菌剂，有利于菌剂生长. 此外，微生物具有多种官能团的蛋白质结构，经固定化后其官能团与载体之间发生共价键或范德华力等作用，主链结构得到加固，不易流失和被破坏，能耐pH变化、 生物毒性物质的冲击，不易失活，并且固定化菌剂内部是MSM体系，提供了有利的生长环境^[27].

随着固定化菌剂投加量从600 g ·kg^-1增至1 400 g ·kg^-1，固定化菌剂对牛粪中E2的去除率从86.70%提高至96.57%，残留含量从0.06 mg ·kg^-1降至0.02 mg ·kg^-1，对DES的去除率从64.29%提高至95.47%，残留含量从1.00 mg ·kg^-1降至0.13 mg ·kg^-1. 由于牛粪中E2和DES迁移能力较弱，往往只有与菌剂接触的牛粪才能得到有效清洁，固定化菌剂投加量提高，则其与牛粪的接触面积增大，进而可以更多地降解和吸附去除牛粪中的E2和DES^[27].

图 6

Fig. 6

图 6 接种量对菌剂去除牛粪中E2和DES的影响 Fig. 6 Effect of inoculation volume on E2 and DES removal from cow dung by bacteria

由图 7可知，同等含水量条件下，600 g ·kg^-1固定化菌剂对E2和DES去除率分别高于游离态菌剂29.79%~47.81%和25.64%~37.41%. 随着牛粪含水量的提高(40%~70%)，固定化菌剂对牛粪中E2和DES去除越多. 供试条件下，牛粪含水量为70%时最有利于固定化菌剂去除牛粪中E2和DES，E2和DES的去除率分别达95.75%和88.87%，比含水量为40%时的去除率分别提高了16.71和27.21个百分点，残留含量分别为0.02 mg ·kg^-1和0.31 mg ·kg^-1. 反之，随着牛粪含水量降低，固定化菌剂对E2和DES去除率降低，一方面菌剂需要一定的含水量保持其球体形态，当含水量低于50%时，会出现干瘪形态； 另一方面，微生物的活动无法脱离水的作用，含水量降低在一定程度上影响了微生物的活性，进而减弱了牛粪中供试雌激素的去除.

图 7

Fig. 7

图 7 牛粪含水量对菌剂去除牛粪中E2和DES的影响 Fig. 7 Effect of water content on E2 and DES removal from cow dung by bacteria

由图 8可见，同等翻堆时间下，含水量为50%的牛粪中600 g ·kg^-1固定化菌剂对E2和DES去除率分别高于游离态菌剂26.74%~43.80%和25.18%~37.94%. 翻堆时间间隔越短，固定化菌剂对牛粪中E2和DES去除越高. 翻堆时间为12 h，牛粪中E2和DES去除率分别达到95.54%和94.01%，比每24 h翻堆分别提高了8.85和29.72个百分点，残留含量分别为0.02 mg ·kg^-1和0.17 mg ·kg^-1. 菌剂对牛粪中E2和DES的去除效率，一方面取决于固定化菌剂与污染物的可接触性，另一方面取决于氧的供应. 菌剂投加虽然明显提高了局部牛粪功能微生物的密度，但同时限制了功能菌群向固定化菌剂外部扩散，由于E2和DES迁移能力较弱，所以只有与菌剂接触的E2和DES得到有效去除，翻堆时间影响菌剂与牛粪中雌激素的可接触性，进而影响雌激素的去除效率^[27]. 此外，两株菌株都是好氧型菌株，翻堆可增加牛粪中的通氧量，有助于好氧菌株的生长，进而发挥降解效能^[28]. 为节省成本，去除牛粪中E2和DES的方案优选为：菌剂投加量为600 g ·kg^-1，牛粪含水量为70%，翻堆时间间隔为12 h，以此条件投加固定化菌剂后，可以完全去除E2，DES去除率为97.41%.

图 8

Fig. 8

图 8 翻堆时间间隔对菌剂去除牛粪中E2和DES的影响 Fig. 8 Effect of overturn time on E2 and DES removal from cow dung by bacteria

目前国内外尚少有关于固定化菌剂治理污水和牛粪中雌激素的报道. 已有的污水和畜禽粪便中雌激素的治理方法多集中在吸附^[36]、 膜过滤技术^[37]、 高级氧化技术^[38]、 堆肥^[39]等. 这些方法往往不能高效去除雌激素或残留浓度较高. 如Chen等^[40]通过人工湿地去除E2，水力停留137.5 h，E2残留率为40.8%. 从本研究结果可见，菌剂投加至污水和牛粪后，7 d对E2和DES的去除率均可达到90%以上，并且在摇瓶条件下，菌剂可回收再利用3次，第4次使用时才会出现小球破损现象. 固定化菌剂操作简单、 去除效果好、 可重复利用等特点说明固定化菌剂去除污水和畜禽粪便中的雌激素具有应用前景.

本研究提供了菌剂固定化方法，并提出了应用固定化菌剂来去除水和牛粪中雌激素的新思路. 然而固定化菌剂尚有的缺陷也有待进一步完善. 固定化菌剂包菌量、 牛粪含氧量、 海藻酸钙吸附能力等会影响固定化菌剂的效果. 本实验中，菌剂内两株菌的初始含量均为D600=0.5，包菌量不高导致菌剂用量过大，为此，下一步可以考虑适当提高包菌量来降低菌剂的投加量. Ahmad等^[18]发现包菌量越高，对氧气和营养物的需求也越多，导致苯酚降解率反而降低； 郝红红等^[24]发现当固定化菌剂内部的细胞含量过高时，氧气扩散速率减慢，同时细胞生长空间减小，从而阻碍了细胞的增殖，去除率降低. 所以合适的包菌量尚需进一步研究. 此外，供试菌株均为好氧型细菌，而牛粪含氧量有限，这可能抑制了菌株的生长，从而抑制了菌剂的使用效果. 王旭辉等^[28]发现，翻耕土壤可以增加氧含量，翻耕土样后石油去除率比不翻耕土样提高24%； 本研究结果也证明翻堆牛粪时间间隔越短，固定化菌剂对E2和DES去除率越高. 所以可以通过缩短翻堆时间间隔来提高菌剂对牛粪中E2和DES的去除率. 海藻酸钙吸附能力低可能也是制约固定化菌剂去除雌激素的原因之一，600 g ·kg^-1海藻酸钙对牛粪中E2和DES吸附率分别为2.73%和4.35%，可考虑添加高吸附性能的吸附剂. 钱林波等^[27]提出，高吸附性能的吸附剂被用作固定化载体，可促进有机污染物从土壤向固定化载体迁移，使固定化载体同时富集高含量的微生物和有机污染物，增加了污染物与微生物的接触，实现了污染物的富集降解一体化，促进了土壤修复效果. Chen等^[33]采用吸附包埋法，以植物残体和生物碳为吸附载体材料，海藻酸钠包埋固定化多环芳烃降解菌株，10%接种量添加至污染土壤，90 d后三、 四、 五、 六环多环芳烃回收率为65%~68%、 64%~68%、 61%~73%、 53%~73%，比不添加吸附材料的海藻酸钠固定化多环芳烃降解菌株分别减少6%~9%、 6%~10%、 7%~19%、 9%~29%. 本研究中固定化菌剂包菌量偏低、 牛粪中含氧量不高、 海藻酸钙吸附能力低等，综合地导致了处理牛粪时菌剂投加量偏多，该问题仍需要进一步针对性地完善.

本研究结果表明，构建雌激素固定化菌剂，可高效去除水和牛粪中E2和DES. 固定化后菌株具有相对封闭和稳定的空间，能保证细菌正常代谢，屏蔽外界土著微生物恶性竞争，防止噬菌体吞噬等^[27]. 固定化菌剂在治理污水和畜禽粪便中E2和DES等有机污染物方面有一定可行性和优越性，可为无害化处理污水和畜禽粪便中雌激素提供新思路和实验科学依据. 4 结论

(1)优选出了固定化菌剂的方案：菌株JX-2和S体积比为1 ∶1，海藻酸钠质量分数5%，CaCl₂ ·2H₂O质量分数4%，菌胶比1 ∶2.

(2)固定化菌剂对溶液中E2和DES(1~25mg ·L^-1)的去除率高于游离态菌剂. 30℃、 150 r ·min^-1于摇床培养7 d后，其对初始含量为2 mg ·L^-1的E2和DES的去除率分别为99.42%和84.59%.

(3) 固定化菌剂可有效去除污水和牛粪中E2与DES. 其去除污水中E2和DES的优选方案为：固定化菌剂投加量为300 g ·L^-1，pH为5.0~6.0. 去除牛粪中E2与DES的优选方案为：固定化菌剂投加量为600 g ·kg^-1，每12 h翻堆，牛粪含水量为70%.