分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)是模拟体内抗原与抗体之间的相互作用发展起来的一种新型技术^[1]. 它是指以特定的分子为模板分子，将其与合适的功能单体相结合，在致孔剂的作用下形成预组装的可逆性复合物，然后再加入合适的交联剂和引发剂在一定条件下使它们发生聚合反应形成需要的分子印迹聚合物. 用洗脱液洗去模板分子之后在聚合物中就会留下与模板分子结构相似、 大小相匹配的空腔，当该聚合物与模板分子再次结合时能选择性地识别模板分子^{[2, 3, 4, 5]}. 基于该技术制备的分子印迹聚合物具有选择性高、 抗恶劣环境能力强、 稳定性好、 使用寿命长、 应用范围广等特点. 目前，分子印迹技术被广泛应用于药物分析^[6,7]、 环境分析^{[8, 9, 10]}、 色谱分离^[11]、 人工模拟抗体^[12]、 化学传感器^{[13, 14, 15]}、 食品分析^[16]等领域.

众所周知，染料是一类稳定难降解的有机物，染料工业是化学工业中对环境污染严重的产业之一，在整个染料生产过程中流失的染料占了全部染料产量的15%，并且其中的偶氮染料占了相当大的比例. 刚果红就是一种典型的致癌联苯胺类直接双偶氮染料，代谢之后就成了联苯胺，联苯胺是人类所熟知的一种致癌物质^{[17, 18, 19, 20]}. 刚果红结构复杂并且具有高度的水溶性，一旦被直接排放到环境中，它的污染将是持久性的. 目前，除去被污染水体中刚果红的方法主要有吸附法^{[17, 18, 19, 20, 21]}、 光催化降解法^[22]，生物降解法^[23]等，但研究比较多的还是吸附法，相对于其他环境修复方法而言，吸附具有高效、 范围广、 过程简单等特点. 因此，研究出高效、 经济、 对环境友好的刚果红吸附剂仍是非常重要的. 分子印迹聚合物以其特有的构效预定性、 特异识别性和广泛实用性，而被作为吸附剂^{[24, 25, 26, 27, 28]}广泛应用. 纳米技术作为20世纪90年代初迅速发展起来的新兴科技，其发展为解决传统分子印迹研究遇到的困难带来了希望. 因为纳米结构的分子印迹聚合物不需研磨、 筛分等工序，识别点不易破坏； 具有极大的比表面积表现出较高的结合容量，模板分子更容易接近到MIP上的结合位点，从而表现出较快的结合动力学特性^[29].

本研究选用刚果红作为模板分子，α-甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂，乙腈为致孔剂，2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，采用沉淀聚合法制备了能够特异性吸附刚果红的纳米分子印迹聚合物(MIP)，利用扫描和透射电镜表征聚合物的形貌； 分析了溶液pH值，聚合物与刚果红的结合时间，刚果红初始浓度及温度对印迹聚合物吸附模板分子的影响； 研究循环使用性能. 同时，还合成了空白印迹聚合物(NIP)，将其与刚果红分子印迹聚合物作了对比研究. 实验结果表明印迹聚合物对刚果红具有较好的选择性吸附能力，考虑可用于染料废水中刚果红的吸附分离. 1 材料与方法 1.1 仪器及药品

药品：刚果红(AR，国药集团化学试剂有限公司)，α-甲基丙烯酸(MAA，GC，国药集团化学试剂有限公司)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA，分析纯，阿拉丁试剂)，2,2-偶氮二异丁腈(AIBN，AR，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(AR，四川科龙试剂有限公司)，超纯水.

仪器：扫描电子显微镜(JSM-6510LV，日本电子株式会社)； 全自动气体吸附和检测系统(Autosorb-IQ-MP Pulsar LC-D200，美国康塔仪器公司)； 透射电子显微镜(Tecnai G20，FEI公司)； 紫外-可见分光光度计 (UV2550，日本岛津公司)； 高速离心机(TG16K-Ⅱ)； 超纯水器(Human UP 900型，Human 公司).

在150 mL圆底烧瓶中加入2 mmol刚果红、 8 mmol α-甲基丙烯酸和100 mL乙腈超声10 min放入冰箱中24 h使模板分子与功能单体充分相互作用，加入40 mmol EGDMA、 200 mg AIBN，超声脱气，充氮气10 min脱氧密封，然后将密封的圆底烧瓶放入电热恒温油浴锅中70℃热引发聚合24 h. 将得到的沉淀聚合物用体积比为6 ∶1的甲醇 ∶冰乙酸溶液索氏提取48 h 除去模板分子、 未聚合的交联剂和功能单体，再用 150 mL甲醇溶液索氏提取洗脱48 h除去残留的乙酸，再用丙酮反复沉降去除过细微粒，60℃ 真空干燥 24 h，得到分子印迹微球(MIP). 空白印迹微球(NIP)的制备除不加入模板分子以外其余步骤均与MIP的制备过程完全相同.

准确称取MIP和NIP各10份(每份10 mg)，置于相应的5 mL离心管中，加入4 mL浓度为200 μg·mL^-1 pH分别为3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12的刚果红水溶液，在30℃ 下搅拌1 h，然后在10 000 r·min^-1 转速下离心10 min，取清液2.5 mL于10 mL比色管中用二次水稀释至刻线，用紫外可见分光光度计测定吸附后溶液中剩余刚果红的含量.

准确称取MIP和NIP各10份(每份10 mg)，置于相应的5 mL离心管中，加入4 mL浓度为200 μg·mL^-1 pH为7的刚果红水溶液，分别于30℃ 下搅拌不同的时间，然后在10 000 r·min^-1 转速下离心10 min，取清液2.5 mL于10 mL比色管中用二次水稀释至刻线，用紫外可见分光光度计测定吸附后溶液中剩余刚果红的含量.

准确称取MIP和NIP各12份(每份10 mg)，置于相应的5 mL离心管中，加入4 mL pH为7不同浓度的刚果红水溶液，在30℃下搅拌1 h,然后在10 000 r·min^-1 转速下离心10 min，取清液2.5 mL于10 mL比色管中用二次水稀释至刻线，用紫外可见分光光度计测定吸附后溶液中剩余刚果红的含量.

准确称取MIP和NIP各8份(每份10 mg)，置于相应的5 mL离心管中，加入4 mL浓度为200 μg·mL^-1 pH为7的刚果红水溶液，分别于不同温度下搅拌1 h,然后在10 000 r·min^-1 转速下离心10 min，取清液2.5 mL于10 mL比色管中用二次水稀释至刻线，用紫外可见分光光度计测定吸附后溶液中剩余刚果红的含量.

利用扫描电镜和透射电镜对MIP 和NIP 的形貌进行分析，采用全自动气体吸附和检测系统对分子印迹聚合物的比表面积和孔容进行分析. 2 结果与讨论 2.1 扫描和透射电镜分析

图 1是MIP和NIP的扫描和透射电镜图，可以看出MIP和NIP都呈规则的球形，MIP粒径约为90 nm左右，NIP约为140 nm左右. 并且由扫描电镜和透射电镜可以看出MIP与NIP表面比较粗糙，应该是致孔剂和模板分子洗脱后留下的空穴.

图 1

Fig. 1

图 1 MIP和NIP扫描电镜和透射电镜图Fig. 1 SEM and TEM images of MIP and NIP

氮气吸附脱附实验结果表明：MIP的比表面积、 孔容分别为83.250 m²·g^-1、 0.209 cm³·g^-1； NIP的比表面积、 孔容分别为148.414 m²·g^-1、 0.788 cm³·g^-1. MIP的表面积和孔容都小于NIP，而在吸附实验中证明MIP吸附刚果红的能力远远高于NIP，进一步说明了MIP的吸附能力源于特异性位点吸附. 2.3 pH的影响

考察了pH为3～12范围内溶液酸碱度对刚果红分子印迹聚合物吸附性能的影响(图 2). 由图 2可知，在pH为3～7范围内，聚合物的吸附容量随着 pH 的增大依次增加； 当pH为7时，聚合物的吸附容量达到最大(Q_m=17.706 mg·g^-1)； 当pH＞7 时，聚合物的吸附容量急剧下降，所以选择pH=7 为最佳吸附条件. 产生这种现象的原因可能是在pH 较低的溶液中刚果红更容易质子化，不利于与MIP 上的官能团产生作用，导致吸附量较低； pH＞7 之后，MIP上弱酸性的可识别刚果红的官能团—COOH可能与碱作用成盐，也不利于MIP 对刚果红的吸附，从而导致吸附量到达最高点之后又降低.

图 2

Fig. 2

图 2 溶液pH对吸附容量的影响Fig. 2 Effects of pH on adsorption capacity

以吸附动力学研究了刚果红分子印迹聚合物吸附刚果红过程中吸附容量随时间的变化情况. 从图 3可看出，20 min 之前刚果红分子印迹聚合物的吸附速率较高，在 30 min 以后几乎没有变化，达到吸附平衡，快速地吸附平衡表明，刚果红分子印迹聚合物对刚果红具有良好的亲和性.

图 3

Fig. 3

图 3 MIP和NIP的吸附动力学曲线Fig. 3 Adsorption kinetic curves of MIP and NIP

利用吸附动力学数据根据假一级吸附速率方程(1) 和假二级吸附速率方程(2) 进行线性拟合来研究印迹聚合物对模板分子吸附过程中的传质机制.

式中,Q_e、 Q_t分别为吸附平衡时和t 时刻时的吸附容量，mg·g^-1； k₁为一级速率方程常数，min^-1； k₂为二级速率方程常数，g·(mg·min)^-1.

图 4和图 5分别是以MIP和NIP的动力学数据来拟合的假一级和假二级动力学拟合曲线，其动力学常数列于表 1中.

图 4

Fig. 4

图 4 MIP和NIP的假一级动力学拟合曲线Fig. 4 Pseudo-first-order kinetics of experimental data of MIP and NIP

图 5

Fig. 5

图 5 MIP和NIP的假二级动力学拟合曲线Fig. 5 Pseudo-second-order kinetics of experimental data of MIP and NIP

表 1(Table 1)

表 1 假一级和假二级动力学方程参数Table 1 Parameters of Pseudo-first-order kinetic equation and Pseudo-second-order kinetic equation 样品种类 Q实 /mg·g-1 一级动力学参数 二级动力学参数 k1/min-1 Qe/mg·g-1 R2 k2/g·(mg·min)-1 Qe/mg·g-1 R2 MIP 18.616 0.011 22 1.289 8 0.652 11 0.057 87 18.594 0.999 95 NIP 13.408 0.010 48 1.068 1 0.570 23 0.069 98 13.376 0.999 91

表 1 目标化合物工作曲线、 相关系数、 检出限及加标回收Table 1 Regression equations,correlative coefficients,LODs and recoveries of target compounds

从图 4、 5中可以看出一级动力学的线性相关性非常差，计算所得出的平衡吸附容量分别为Q_eMIP=1.289 8 mg·g^-1，Q_eNIP=1.068 1 mg·g^-1与实验值Q_实MIP=18.616 mg·g^-1，Q_实NIP=13.408 mg·g^-1相差特别大，因此聚合物对刚果红的吸附过程不符合一级动力学吸附. 而二级动力学的相关性系数R²均大于0.999 9，相关性非常好，且计算得出的平衡吸附容量分别为Q_eMIP=18.594 mg·g^-1，Q_eNIP=13.376 mg·g^-1和实验值十分接近，这一结果说明聚合物对 刚果红的吸附过程适合用二级动力学吸附速率方程 拟合，根据二级方程的假设可知该吸附过程属于化学吸附过程. 2.5 初始浓度的影响

用平衡吸附法考察了刚果红初始浓度对分子印迹聚合物的吸附量的影响，以初始浓度(c_i，μg·mL^-1)为横坐标，平衡吸附量(Q_e，mg·g^-1)为纵坐标绘制的曲线(图 6). 由图 6可知，MIP和NIP对模板分子的吸附量均随着刚果红浓度的增加而增大，当浓度达到160 μg·mL^-1时二者吸附量几乎都不再发生明显变化，即达到吸附平衡，且MIP的吸附量明显比NIP的大.

图 6

Fig. 6

图 6 初始浓度对MIP和NIP吸附刚果红的影响Fig. 6 Effects of initial concentration on absorption of Congo red on MIP and NIP

Scatchard方程常用来评价分子印迹聚合物的性能，将所得的分子印迹聚合物的吸附数据进行Scatchard分析. Scatchard方程如下：

式中，c_e是平衡时溶液中剩余刚果红的浓度，μg·mL^-1； Q_max是分子印迹聚合物对刚果红的最大表观结合量，mg·g^-1； K_d为结合位点的平衡解离常数，μg·mL^-1.

在图 7中以MIP为吸附物质，以Q/c_e对Q作线性回归，可以看出Q/c_e对Q呈良好的线性关系，说明在所研究的浓度范围内，MIP中存在一类等价的结合位点，它对刚果红呈现均匀的亲和力，其回归方程为Y=2 024.6-107.56X，求得K_d=9.297 μg·mL^-1，Q_max=19.15 mg·g^-1. 以NIP为吸附物质，以Q/c_e对Q作线性回归，其回归方程为Y=494.15-32.88X，求得K_d=30.414 μg·mL^-1，Q_max=15.03 mg·g^-1，此研究结果表明MIP比NIP 具有更高的亲和力结合位点和更高的最大表观结合量.

图 7

Fig. 7

图 7 MIP和NIP的Scatchard分析曲线Fig. 7 Scatchard plot analyses of MIP and NIP

以吸附热力学研究了聚合物吸附刚果红过程中吸附容量随温度的变化情况(图 8). 从图 8可知，聚合物的吸附容量随着温度的升高而快速增大，由此表明，聚合物对刚果红的吸附是吸热过程. 在15～30℃范围内，吸附容量随着温度的升高而快速增大； 30～60℃范围内，吸附容量随着温度的升高变化不大； 且30℃时MIP与NIP的吸附量差别最大，选择30℃为聚合物的最佳吸附温度.

图 8

Fig. 8

图 8 MIP和NIP的吸附热力学曲线Fig. 8 Adsorption thermodynamic curves of MIP and NIP

用吸附热力学数据分析两种吸附模型即Langmuir 模型和 Freundlich 模型.

Langmuir 模型方程线性表达式：

Freundlich 模型方程线性表达式:

式中，Q_e是吸附平衡时的吸附量，mg·g^-1； c_e是平衡时溶液中剩余刚果红的浓度，μg·mL^-1；b和Q_m分别是 Langmuir方程的平衡常数和最大吸附量，L·mg^-1、mg·g^-1、K_F和n是 Freundlich方程的常数，K_F单位为mg·g^-1.

将实验所得到的数据按照公式(3)和公式(4)进行拟合得到Langmuir和Freundlich拟合曲线(图 9、 图 10). 表 2列举了Langmuir和Freundlich两种吸附模型的相关参数，其中R_L的值是根据公式(5)计算而得.

图 9

Fig. 9

图 9 MIP和NIP的Langmuir拟合曲线Fig. 9 Simulation for adsorption of Congo red onto MIP and NIP using Langmuir model

图 10

Fig. 10

图 10 MIP和NIP的Freundlich 拟合曲线Fig. 10 Simulation for adsorption of Congo red onto MIP and NIP using Freundlich model

表 2(Table 2)

表 2 MIP 和 NIP的 Langmuir 和 Freundlich 热力学参数对照表Table 2 Comparison of the Langmuir and Freundlich isotherm parameters of MIP and NIP 样品种类 Q实 /mg·g-1 Langmuir RL Freundlich Qm/mg·g-1 b/L·mg-1 R2 KF/mg·g-1 n R2 MIP 18.812 19.569 0.084 62 0.998 86 0.046 93~0.371 42 5.144 8 3.839 1 0.894 23 NIP 13.344 15.662 0.028 05 0.996 47 0.129 33~0.640 61 1.812 7 2.561 7 0.973 94

表 2 MIP 和 NIP的 Langmuir 和 Freundlich 热力学参数对照表Table 2 Comparison of the Langmuir and Freundlich isotherm parameters of MIP and NIP

式中，c_i是溶液中刚果红的初始浓度，R_L＞1 表明不符合Langmuir 模型； R_L=1 表示 Langmuir 等温线是不可逆的； 0＜R_L＜1，表示符合 Langmuir 模型.

从图 9、 图 10和表 2中可以看出，在30℃下Freundlich拟合曲线的相关性不如 Langmuir 拟合曲线的相关性好，Langmuir 拟合曲线的 R²大于0.996，且根据此模型计算得出的吸附量理论值与实验值接近，说明印迹聚合物吸附刚果红的过程符合Langmuir吸附模型； 同时计算得到的R_L位于0～1之间，也说明此吸附过程与Langmuir吸附模型是相吻合的. 根据Langmuir吸附模型的假设^[30]可知MIP吸附刚果红的吸附过程是单吸附层的化学吸附过程，说明所制备的分子印迹聚合物是很容易吸附刚果红的.

为了研究MIP的选择识别性能，选择亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿等常见染料作为干扰物质. 图 11为MIP和NIP分别吸附刚果红、 亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿的浓度-吸附容量曲线，从中可看出MIP对刚果红的吸附量明显要大于对
其它3种染料的吸附量，NIP对这4种染料的吸附量相差不大并且都明显低于MIP对刚果红的吸附量，这一结果说明MIP对刚果红具有较高的选择识别性.

图 11

Fig. 11

图 11 MIP和NIP吸附刚果红、 亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿的吸附量对比Fig. 11 Comparison chart of adsorption capacity for congo red, methylene blue, rhodamine B and malachite green oxalate onto MIP and NIP

同时做竞争实验，即在刚果红溶液中分别加入相同浓度的甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿振荡吸附后，取上清液，测定其中剩余的刚果红、 甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿浓度，根据公式分别计算K_d、 k和k′，进而进行选择性评价，结果如表 3.

表 3(Table 3)

表 3 分配系数与选择性系数数据Table 3 Distribution coefficient and selectivity coefficient data 吸附物质 MIP NIP k Kd k Kd k′ 刚果红 236.778 — 97.047 — — 亚甲基蓝 99.274 2.385 96.966 1.001 2.383 罗丹明B 82.240 2.879 78.893 1.230 2.341 孔雀石绿 132.030 1.793 112.346 0.864 2.075

表 3 分配系数与选择性系数数据Table 3 Distribution coefficient and selectivity coefficient data

式中，K_d为分配系数，mL·g^-1； c_i为吸附前溶液中吸附质的浓度，μg·mL^-1； c_e为吸附后溶液中剩余的吸附质的浓度，μg·mL^-1； k为选择性系数，是印迹分子与竞争分子分配系数的比值； k′是相对选择性系数，是MIP与NIP的选择性系数的比值.

从表 3的数据可以发现:①相对于其他竞争分子亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿，NIP对刚果红的选择性系数比较低，说明NIP对刚果红和竞争分子的吸附能力接近，缺乏选择性； ②MIP对刚果红的K_d远高于其他竞争分子亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿，同时也高于NIP对刚果红的K_d，说明MIP对模板分子刚果红的吸附效果非常好； ③相对于其他竞争分子亚甲基蓝、 罗丹明B和孔雀石绿，MIP的相对选择性系数均在2以上，表明相对于NIP，MIP对刚果红的选择性识别能力得到较大提高. 上述竞争性实验数据再此揭示,MIP对刚果红具有特异的选择性识别能力，用MIP可以从染料废水中把刚果红选择性地吸附下来，可用于染料废水的处理.

准确称取MIP 100 mg，加入40 mL 浓度为200 μg·mL^-1 pH为7的刚果红水溶液进行吸附实验，测其吸附容量，然后用体积比为6 ∶1的甲醇 ∶冰乙酸溶液进行解吸，洗至中性，烘干，再称取一定质量烘干后的聚合物，根据质量加入一定体积的刚果红水溶液进行吸附实验，重复进行吸附-解吸实验. 图 12为循环使用时MIP对刚果红的吸附容量变化. 从中可以看出随着使用次数的增加，MIP对刚果红的吸附容量有所降低，但变化不是很大，说明通过沉淀聚合法合成的刚果红分子印迹聚合物可以被循环多次使用. 解吸所得到的废液，可以通过旋转蒸发回收甲醇，剩余的刚果红可以回收再利用.

图 12

Fig. 12

图 12 MIP的吸附-解吸次数Fig. 12 Adsorption-desorption cycle of MIP

MIP的选择性吸附取决于刚果红分子中氨基上的H 与功能单体MAA中的羰基上的O形成氢键，从而形成模板分子与功能单体的主客体复合物. 在聚合的时候，交联剂EGDMA分散在刚果红和MAA的周围，在引发剂的作用下，EGDMA中的C C和MAA上的C C发生自由基聚合，在刚果红周围形成高度交联的聚合物网络结构，刚果红被镶嵌在其中，当刚果红被洗脱后，在聚合物中就留下了与刚果红在空间结构和功能基团上高度吻合的三维孔穴. 当将MIP应用于复杂体系的吸附时，只有当空间结构和功能基团与孔穴匹配的分子才能够更容易地进入孔穴，从而实现复杂样品中选择性地吸附模板分子. 印迹与吸附过程如图 13所示.

图 13

Fig. 13

图 13 印迹与吸附过程示意Fig. 13 Schematic diagram of imprinting and adsorption process

采用沉淀聚合法制备的刚果红分子印迹聚合物，呈均匀球形，不需要研磨，避免了在研磨过程中破坏聚合物上结合位点的可能； 粒径小，达纳米级别，比表面积大，具有与刚果红分子互补的官能团结构，对刚果红分子具有高度的选择性识别能力和优良的结合亲和性，并且洗脱性能良好，稳定性高，可以长期、 多次循环使用. 可用于环境染料废水中刚果红的吸附，达到污水净化的目的； 也可用于食品中刚果红的分离与富集，为后续检测分析食品中的刚果红提供了一个简便易行的样品预处理的方法.