长期以来，抗生素被大量用于医疗和畜禽养殖，在保障人类健康和促进畜牧业发展方面起了重要作用. 但研究表明，抗生素摄入后在体内残留量极少，85%以上以原药和代谢产物的形式经由病人和动物的粪尿排出体外^[1]. 这些含有喹诺酮类抗生素的畜禽废弃物或以有机肥形式施入农田，导致土壤和表层水抗生素污染，破坏土壤微生物群落结构和功能，并被农作物吸收累积，最终通过食物链影响其中的植物、 动物和微生物的正常生命活动^[2,3]. 喹诺酮类抗生素已在环境、 动物性食品和食用蔬菜中有不同程度的检出^{[4, 5, 6, 7]}. 在喹诺酮类抗生素中，环丙沙星、 氧氟沙星和诺氟沙星的生产量最大，约占生产总量的98%^[8,9]. 因此，环境中的此类抗生素对植物的生态风险性更高，尤其是对水稻等农作物的危害更大，进而可能通过食物链对人类产生影响.

植物为了适应淹水条件，根系会生成大量通气组织，将大气中的氧气通过叶片输送到根系，其根系一般具有氧化能力，可在根际形成氧化环境. 研究表明，淹水环境会有大量的Fe²⁺存在，耐淹水植物如水稻等，其根系的氧化作用可在根表形成明显的铁氧化物胶膜^{[10, 11, 12, 13]}，铁膜也被认为是水稻应对长期淹水造成的还原状态下高浓度Fe²⁺的一种适应机制^{[14, 15, 16]}. 铁膜是一种两性胶体，可通过吸附和共沉淀等作用，影响某些阴、 阳离子在土壤中的化学行为和生物有效性，从而影响植物对这些元素的吸收^[17]，已有很多研究报道了根表铁膜对水稻吸收累积P、 Zn、 As的影响^{[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]}. 目前对于铁胶膜对抗生素迁移转化的影响的研究鲜有报道. 诺氟沙星是两性化合物^[25]，可能更容易被氧化物胶膜吸附，因此本试验采用溶液培养法，研究不同Fe²⁺质量浓度和不同诺氟沙星质量浓度对水稻根表铁膜形成的影响，进而探究根表铁膜含量及不同质量浓度诺氟沙星对水稻根表、 根内及地上部吸收诺氟沙星的规律，以期为抗生素在作物体内吸收累积的界面调控提供借鉴.

1 材料与方法 1.1 供试材料

诺氟沙星标准品(纯度99.0%，购自天津鼎国生物技术有限责任公司)； 乙腈为HPLC级试剂，购自天津康科德科技有限公司； 其他化学试剂均为分析纯； 试验用水：营养液用水为蒸馏水，高效液相测定用水为Milli-Q超纯水仪制备. 1.2 试验设计

将水稻种子(品种 津原E28)用30% H₂ O₂消毒30 min后，用蒸馏水浸泡24 h，播于润湿的单层纱布上，水稻出苗10 d后，挑选出生长一致的幼苗移栽到1.2 L的塑料盆中，每盆6株幼苗，每个盆中供应1/4强度的国际水稻所水稻营养液，体积为1 L. 营养液组分为：NH₄NO₃ 114.3 mg ·L^-1、 NaH₂PO₄ ·2H₂O 50.4 mg ·L^-1、 K₂SO₄ 89.3 mg ·L^-1、 CaCl₂ 158.2 mg ·L^-1、 MgSO₄ ·7H₂O 405 mg ·L^-1、 MnCl₂ ·4H₂O 7.5 mg ·L^-1、 (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ·2H₂O 0.37 mg ·L^-1、 H₃BO₃ 4.62 mg ·L^-1、 ZnSO₄ ·7H₂O 0.175 mg ·L^-1、 CuSO₄ ·5H₂O 0.155 mg ·L^-1、 Fe-EDTA 1.128 mg ·L^-1. 营养液pH 值调至5.0，每3 d更换一次营养液. 从第二次营养液开始，分4个质量浓度加入Fe-EDTA，使得Fe²⁺质量浓度为1.128、 10、 50、 70 mg ·L^-1，第3 d观察即有铁膜在水稻根表形成，更换第六次营养液之前，取一批水稻测根表形成的铁氧化物胶膜含量. 从第6次营养液开始，停止添加不同质量浓度的Fe²⁺，分3个质量浓度0、 10、 50 mg ·L^-1加入诺氟沙星，培养一个月后收获. 每次试验均以每盆中6株水稻进行测定.

上述各处理均重复3次. 1.3 研究方法 1.3.1 根表铁膜和诺氟沙星测定

将植株从营养液中取出，用去离子水冲洗3次，然后从茎基部将水稻根系和地上部分开. 地上部装入袋中. 根系用DCB(dithionite-citrate-bicarbonate method)法^[26]提取根表铁膜中的Fe和诺氟沙星，具体方法为：将用去离子水洗干净后的水稻根系放入150 mL三角瓶中，加入0.3 mol ·L^-1的Na₃C₆H₅O₇ ·2H₂O 40 mL，1 mol ·L^-1 NaHCO₃ 5 mL，3 g Na₂S₂O₄，振荡3 h，将根用去离子水洗净后装入袋中，溶液转移至100 mL容量瓶中定容. 用火焰法原子吸收测定其中的铁含量，用高效液相色谱仪(HPLC)测定其中的诺氟沙星. 1.3.2 植株中诺氟沙星含量测定

水稻的根系及地上部植株样品放入冷冻干燥机，于-65℃冷冻干燥24~48 h^[27,28]. 取适量干燥后的作物样品置于瓷质研钵中，加入少许石英砂，制备作物浆液于50 mL离心管中，加入乙腈 ∶丙酮 ∶冰乙酸(体积比)=80 ∶20 ∶4的提取液10 mL，旋涡振荡均匀后，置于振荡器上提取25 min，离心(2500 r ·min^-1)20 min，取上清液，离心管中剩下的残渣用上述方法重复提取一次. 合并上清液，用10 mL乙腈饱和的正己烷液-液萃取上清液2次，去除脂类物质，提高回收率. 收集下层液体于浓缩瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用乙腈/0.086 mol ·L^-1磷酸(15/85，体积比)定容至5 mL隔夜沉渣. 吸取1 mL过0.22 μm滤膜后待测^[29]. 此方法对水稻植株中诺氟沙星的回收率可达到74.4%±4.9%. 1.3.3 诺氟沙星测定的高效液相色谱条件

Waters高效液相色谱仪，具荧光检测器； 色谱柱为C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)； 激发波长280 nm，发射波长450 nm； 柱温35℃； 进样量20 μL； 流动相：乙腈/磷酸(0.086 mol ·L^-1，15/85体积比)； 流速：1.0 mL ·min^-1，分析时间为15 min. 1.4 统计分析

图表制作采用Origin 8.5，所有结果为3次平行试验数据的平均值，差异显著性和相关性分析采用IBM SPSS Statistics 20(Duncan法)进行检验，统计显著性设为P<0.05.

2 结果与讨论 2.1 水稻株高、 根长、 根系及地上部干重

诺氟沙星未存在条件下，对于溶液中Fe²⁺对水稻生长的影响，当Fe²⁺的质量浓度在1.128~10 mg ·L^-1范围内，随着Fe²⁺质量浓度的增加，水稻株高、 根系干重、 地上部干重均显著性增加，而对根长并无显著影响. 当质量浓度超过这个范围，并未对水稻上述指标产生显著性影响(表 1). 营养液中添加的Fe²⁺质量浓度相同的情况下，随着添加的诺氟沙星质量浓度的增加，株高、 根长、 根系及地上部干重基本都呈减小的趋势，对株高达到了显著性差异，而对根长、 根系及地上部干重仅在个别处理组产生显著影响； 营养液中诺氟沙星质量浓度相同时，株高、 根长、 根系及地上部干重随着溶液中Fe²⁺质量浓度的增加呈先增加后减小的趋势. 可见溶液中诺氟沙星的存在会对水稻的生长产生抑制作用，且这种抑制作用与诺氟沙星的质量浓度呈正相关. 在诺氟沙星质量浓度相同的条件下，Fe²⁺的质量浓度在一定范围内，随着Fe²⁺质量浓度的增加，会促进水稻的生长，当质量浓度超过这个浓度范围，高质量浓度的Fe²⁺会对水稻的生长产生抑制作用(表 1).

表 1(Table 1)

表 1 水稻株高、 根长、 根系及地上部干重 1) Table 1 Plant height,root length and dry masses of root and shoot of the rice plant 处理组 水稻植株特征 Fe2+质量浓度/mg ·L-1 诺氟沙星质量浓度/mg ·L-1 株高/cm 根长/cm 根系干重/mg 地上部干重/mg 1.128 0 36.1±1.72 b 21.4±1.66 a 56.40±2.570 bcd 235.9±18.87 cd 10 27.9±1.50 cd 14.6±0.460 bc 35.37±4.500 d 184.4±38.07 de 50 25.7±0.450 de 14.8±0.930 bc 34.17±5.300 d 149.4±33.36 e 10.0 0 41.3±0.970 a 22.5±0.650 a 80.63±10.39 a 353.3±55.01 a 10 31.2±2.37 c 13.4±0.800 cd 45.73±7.220 cd 302.6±45.48 ab 50 26.1±0.810 de 16.3±1.88 b 46.90±9.350 cd 203.5±28.66 cde 50.0 0 35.9±2.84 b 21.3±1.36 a 72.80±8.180 ab 237.6±30.09 cd 10 27.7±2.89 cd 12.4±1.37 cd 44.90±4.260 cd 173.6±50.46 cd 50 23.1±2.67 e 12.5±1.41 cd 47.03±2.890 cd 143.9±19.58 e 70.0 0 34.9±1.71 b 20.9±0.670 a 72.47±13.44 ab 255.5±40.81 bc 10 27.9±1.31 cd 11.7±1.63 d 44.27±10.32 cd 221.1±27.62 cd 50 25.3±1.50 de 11.7±1.67 d 64.90±30.58 abc 187.8±24.07 cde 1)多重比较采用Duncan法，不同小写字母表示同一Fe2+水平下不同诺氟沙星添加或同一诺氟沙星水平不同Fe2+添加条件下，水稻株高或根长或根系或地上部干重具有显著性差异(P<0.05)

表 1 水稻株高、 根长、 根系及地上部干重 1) Table 1 Plant height,root length and dry masses of root and shoot of the rice plant

研究结果表明，在营养液中添加Fe-EDTA之后，水稻根表可形成红色的铁氧化物胶膜. 图 1是加入不同质量浓度的Fe²⁺后，用DCB从水稻根表提取出的铁量. 从中可以看出，由于加入的Fe²⁺质量浓度不同，水稻根表铁氧化物的淀积量也不相同，加入的Fe²⁺质量浓度越大，根表沉积的铁氧化物越多，这与之前的报道一致^[30]. 根表铁膜含量与添加Fe²⁺质量浓度呈对数相关，相关性系数为0.9996(n=4，P<0.01)(图 1).

图 1

Fig. 1

图 1 不同Fe2+质量浓度诱导生成的水稻根表铁氧化物胶膜含量 Fig. 1 Effect of different Fe2+mass concentration in culture solution on the content of iron plaque on the root surface of the rice plant

根表铁膜形成且稳定一段时间之后，在营养液中停止添加Fe-EDTA，加入不同质量浓度诺氟沙星，培养一个月. 用DCB从水稻根表提取铁，从试验结果可以看出，水稻根表的铁膜含量较停止添加Fe-EDTA之前有明显减少，且随着添加的诺氟沙星质量浓度的增加，根表铁膜的减少量有所增加(图 2). 根表铁膜减少量与诺氟沙星质量浓度的相关性系数为0.854(Fe²⁺质量浓度为1.128 mg ·L^-1，n=9)，0.982(Fe²⁺质量浓度为10 mg ·L^-1，n=9)，0.992(Fe²⁺质量浓度为50 mg ·L^-1，n=9)，0.290(Fe²⁺质量浓度为70 mg ·L^-1，n=9)，可见在Fe²⁺质量浓度添加为1.128、 10、 50 mg ·L^-1时，根表铁膜减少量与诺氟沙星质量浓度呈显著相关. 在未添加诺氟沙星的条件下，水稻根表铁膜含量在Fe²⁺添加质量浓度为1.128~50 mg ·L^-1时，保持和添加诺氟沙星之前一样的增加趋势，在Fe²⁺为70 mg ·L^-1时，根表铁膜含量突然下降，与添加诺氟沙星的质量浓度为10 mg ·L^-1时一致. 在诺氟沙星质量浓度为50 mg ·L^-1时，根表铁膜含量没有很好的规律性(图 2). 据报道，铁氧化物能够通过络合作用对四环素类抗生素具有强烈的吸附和固定作用^{[31, 32, 33]}. 由于铁氧化物胶膜是两性胶体，诺氟沙星与四环素类抗生素一样均为两性化合物，所以可能是由于诺氟沙星与铁离子形成了络合物，促进了根系铁胶膜的释放. 值得注意的是，当Fe²⁺和诺氟沙星添加质量浓度较高时，对水稻，尤其是水稻根部的正常生长产生了很大影响，所以测定根表各项指标时，这些处理组的规律与其他正常生长的水稻会有一定的差别.

图 2

Fig. 2

图中不同小写字母表示各处理间差异显著( P<0.05)，下同 图 2 诺氟沙星对水稻根表铁氧化物胶膜含量的影响 Fig. 2 Effect of norfloxacin in culture solution on the content of iron plaque on the root surface of the rice plant

营养液中添加诺氟沙星培养一个月后，测定DCB从根表提取的诺氟沙星以及水稻根内及地上部的诺氟沙星. 对于水稻根表的诺氟沙星含量，随着根表沉积的铁氧化物越多，其富集量也越大. 水稻根内和地上部的诺氟沙星随着根表铁膜含量的变化以及根表诺氟沙星富集量的变化，并没有表现出很好的规律性. 根表、 根内以及地上部的诺氟沙星含量都随着介质中添加诺氟沙星含量的增加而有所增加，除了Fe²⁺添加为70 mg ·L^-1时的根表诺氟沙星和地上部诺氟沙星，其他处理组的增加均达到显著水平. 这种结果的出现可能由于较高质量浓度的Fe²⁺诱导生成的铁膜含量增加，但是水稻根表铁膜覆盖的根表面积并没有增加且由于水稻的生长状况较差，根表面积较其他处理组有所减少，使得诺氟沙星与根表铁膜结合的量减少，地上部吸收的诺氟沙星含量也受到影响. 已有报道指出，根表铁膜的形成可以富集介质中的Zn和P，但是对水稻吸收Zn和P并不总是其促进作用，这取决于根表铁膜的含量，根表铁膜太厚或者太薄均不利于水稻对这些物质的吸收^[18]. 由结果可以看出(图 3)，水稻根表沉积的氧化物胶膜对水稻根部及地上部吸收诺氟沙星没有明显的影响. 对于铁氧化物胶膜，一方面，可以吸附、 氧化还原、 固定土壤溶液中存在的大量金属阳离子，并成为这些离子进入根系组织的障碍层，减少植物对其进行吸收和转运； 另一方面，作为两性胶体，胶膜表面也可以吸附土壤中的金属阴离子等. 但是，对于铁氧化物胶膜对于诺氟沙星在根系向植物体内的传输仍需要进一步机制性的讨论.

图 3

Fig. 3

图 3 水稻根表、 根内及地上部诺氟沙星含量 Fig. 3 Norfloxacin concentrations in DCB,roots and shoots of the rice plant

当溶液中添加的诺氟沙星质量浓度为10 mg ·L^-1以及50 mg ·L^-1时，根表铁膜含量与根表诺氟沙星含量均具有显著相关性，表明随着胶膜量的增加，胶膜内诺氟沙星量增加. 根表铁膜含量与根内诺氟沙星含量的相关系数在诺氟沙星质量浓度为10 mg ·L^-1时为0.682，诺氟沙星质量浓度为50 mg ·L^-1时为-0.606； 根表铁膜含量与地上部诺氟沙星含量的相关系数在诺氟沙星质量浓度为10 mg ·L^-1时为0.045，诺氟沙星质量浓度为50 mg ·L^-1时为0.000，表明根内及地上部的诺氟沙星含量与根表铁膜含量没有显著相关性. 根内诺氟沙星与地上部诺氟沙星含量也没有显著相关性(表 2). 结果表明，根表铁膜可以富集介质中的诺氟沙星，但是对水稻根部及地上部吸收诺氟沙星并没有起到明显的促进或者抑制作用.

表 2(Table 2)

表 2 根表铁氧化物胶膜量与根表、 根内、 地上部的诺氟沙星含量的相关系数 1) Table 2 Correlation coefficients among the content of iron plaque on the root surface and norfloxacin concentrations in DCB,roots and shoots of the rice plant 诺氟沙星 类型 根表铁膜 根表诺氟沙星 根内诺氟沙星 地上部诺氟沙星 根表铁膜 1.000* 0.959* 0.682 0.045 10 mg ·L-1 根表诺氟沙星 1.000* 0.637 -0.240 根内诺氟沙星 1.000* 0.131 地上部诺氟沙星 1.000* 根表铁膜 1.000* 0.987* -0.606 0.000 50 mg ·L-1 根表诺氟沙星 1.000* -0.625 -0.070 根内诺氟沙星 1.000* 0.775 地上部诺氟沙星 1.000* 1)±标准误差(n=12)，*表示P<0.05

表 2 根表铁氧化物胶膜量与根表、 根内、 地上部的诺氟沙星含量的相关系数 1) Table 2 Correlation coefficients among the content of iron plaque on the root surface and norfloxacin concentrations in DCB,roots and shoots of the rice plant

试验结果表明，当营养液中添加的诺氟沙星质量浓度相同时，随着营养液中Fe²⁺质量浓度的增加，根表诺氟沙星所占百分比逐渐增加，而根内和地上部诺氟沙星所占百分比逐渐减少. 当添加的Fe²⁺相同时，随着营养液中诺氟沙星质量浓度增加，根表诺氟沙星所占百分数减少，根内和地上部诺氟沙星所占百分数增加. 对于所有的处理组，根表诺氟沙星所占的百分比为87.7%~97.6%，根内诺氟沙星所占百分比为0.8%~4.8%，地上部诺氟沙星所占百分比为1.5%~7.5%. 对于任意处理组来说，根表诺氟沙星所占百分比远大于根内及地上部的诺氟沙星百分比，同时，地上部诺氟沙星所占百分比均大于根内诺氟沙星所占百分比. 随着诺氟沙星质量浓度增加，根内和地上部诺氟沙星质量分配百分比增加，可能是由于溶液中较高质量浓度的诺氟沙星使得根表铁膜的下降量增加，最终导致根表富集的诺氟沙星降低(图 4).

图 4

Fig. 4

图 4 诺氟沙星在水稻根表、 根内以及地上部质量分配的百分比 Fig. 4 Quality percentage distribution of norfloxacin in DCB,roots and shoots of the rice plant

(1)溶液中存在诺氟沙星会对水稻的生长产生抑制作用，且这种抑制作用与诺氟沙星的质量浓度呈正相关. 在诺氟沙星质量浓度相同的条件下，Fe²⁺的质量浓度在一定范围内，随着Fe²⁺质量浓度的增加，会促进水稻的生长，当质量浓度超过这个范围，高质量浓度的Fe²⁺会对水稻的生长产生抑制作用.

(2)随着溶液中添加Fe²⁺质量浓度增加，在水稻根表形成的铁氧化物胶膜含量增加，且根表铁膜含量与添加Fe²⁺质量浓度呈对数相关，相关性系数为0.9996. 溶液中添加诺氟沙星之后，根表铁膜的含量会降低，且铁膜下降量随着诺氟沙星质量浓度增加而增加.

(3)添加相同质量浓度的诺氟沙星，水稻根表诺氟沙星含量随着水稻根表铁膜含量的增加而增加，但是根内及地上部诺氟沙星含量与水稻根表铁膜没有相关性. 添加不同质量浓度的诺氟沙星，水稻根表、 根内以及地上部诺氟沙星质量分配的百分比为： 水稻根表87.7%~97.6%，根内0.8%~4.8%，地上部1.5%~7.5%，根表诺氟沙星远远大于根内以及地上部的诺氟沙星含量. 由此可以看出，水稻根表铁氧化胶膜在一定程度上是一个诺氟沙星富集库，但对诺氟沙星迁移到根内及地上部没有明显的促进或者抑制作用.