汞是唯一以液态存在的有毒金属，环境中的汞主要以无机汞的形态存在，在生物或非生物因素作用下，无机汞很容易转化为有机汞，其中毒性最强的甲基汞，其毒性是无机汞的50~100倍. 甲基汞对人体健康威胁最大，它主要通过水生食物链的富集放大作用进入人体内富集并且难以代谢^[1]，鱼体内的甲基汞含量可以达到水体中汞本底值的10⁶~10⁷倍^[2]，对人体健康造成严重危害甚至导致死亡^[3,4]. 汞的甲基化主要是生物和非生物的作用，尤其是微生物主导的甲基化是环境中汞甲基化的主要原因. 具有汞甲基化能力的微生物种类很多，分布广泛，所以汞的甲基化普遍存在于各种环境介质中. 微生物不仅可以使汞发生不同形态间的转化，还能引起汞在大气、 水体、 土壤、 沉积物等环境中的地球化学迁移^[5]，致使不同形态的汞在全世界范围内广泛分布，所以汞的微生物甲基化在汞的地球化学循环中意义重大，汞的微生物甲基化也越来越受到人们的重视.

异化铁还原菌是指在生长代谢过程中以氧化有机物获得能量，同时发生电子转移把Fe(Ⅲ)还原成Fe(Ⅱ)的一类微生物^[6]. 一般情况下，微生物以有机质为电子供体，氧气、 硝酸根等充当电子受体. 但是目前已发现自然界中有很多细菌可以通过还原铁氧化物来获取能量，从而维持自身的生长代谢活动^[7,8]. 微生物通过氧化有机物获得电子^[9,10]，再将电子转移至最终电子受体——铁氧化物，最终将铁氧化物还原.

奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)属于革兰氏阴性兼性厌氧细菌，是最先被阐明还原Fe(Ⅲ)并在铁的生物化学循环起重要作用的细菌^{[11, 12, 13]}，同时，S. oneidensis MR-1也被证实是一种汞甲基化微生物，能够将无机汞转化为甲基汞，引起环境中汞的不同形态间转化和地球化学迁移^{[14, 15, 16]}. 自然环境中含铁矿物丰富，铁氧化物溶解还原在地球化学循环中普遍发生，关于微生物对各种铁氧化物的异化还原作用已有大量研究报道，然而关于铁氧化物异化还原作用对汞甲基化影响的研究却鲜有报道，铁还原菌对铁氧化物的还原溶解是加速还是抑制汞甲基化尚不清楚，影响因素也没有被研究，阐明铁氧化物异化还原与汞甲基化之间关系，有利于利用铁的异化还原控制汞污染.

1 材料与方法

本实验通过对铁还原菌S. oneidensis MR-1进行纯培养，在实验室模拟条件下，探讨了S. oneidensis MR-1异化还原针铁矿对汞甲基化的影响，以及一些环境因素如pH、 腐殖酸浓度等对汞甲基化的作用，以期为环境中汞污染防治和修复提供科学依据. 实验设计的原理如图 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 S. oneidensis MR-1异化还原Fe(Ⅲ)对汞生物甲基化的影响 Fig. 1 Effect of dissimilatory reduction of Fe(Ⅲ) by S. oneidensis MR-1 on biological methylation of mercury

氯化汞(HgCl₂)，甲基汞(MeHg)，纯度95%以上，均购于Merck公司. MeHg溶于甲醇的1000 mg ·L^-1 贮备液，置于4℃冰箱中用棕色瓶保存，所需稀溶液用超纯水依次逐级稀释. 四丁基溴化铵(TBABr)，纯度≥99%，水为Mili-Q超纯水，其它试剂均为分析纯.

菌种来源： S. oneidensis MR-1由西北农林科技大学土壤微生物实验室提供.

针铁矿为实验室人工合成，方法参考文献^[17]所报道的方法. 具体步骤如下：向2 L聚丙烯容器中倒入100 mL新鲜配制的5 mol ·L^-1 Fe(NO₃)₃[未潮解的Fe(NO₃)₃ ·9H₂O溶于去离子水]，迅速加入180 mL 1 mol ·L^-1 KOH，搅拌. 迅速用去离子水稀释至2 L，加盖，70℃ 下保持60 h. 离心后倾去上清液，沉淀用去离子水洗涤至上清液电导率接近纯水，40℃ 烘干，所得固体即为针铁矿.

LB富集培养基(g ·L^-1)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH=7.0； 固体培养基再按1.5%～2%的比例加入琼脂粉，121℃灭菌30 min. 1.2 实验方法 1.2.1 S. oneidensis MR-1对针铁矿的还原溶解

在30 mL的棕色瓶中加入19 mL液体培养基，将1 mL S. oneidensis MR-1菌悬液接种至液体培养基中，溶液总体积为20 mL，分别投加1、 2、 5 g ·L^-1针铁矿，向棕色瓶中充N₂除氧后置于恒温培养箱中30℃避光静置培养15 d，分别于第1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 12、 15 d取样，测定溶液Fe²⁺、 Fe³⁺浓度. 实验同时以不加S. oneidensis MR-1菌悬液作为对照. 每处理3次重复. 1.2.2 针铁矿的溶解还原对汞甲基化的影响

在30 mL的棕色瓶中加入19 mL液体培养基，将1 mL S. oneidensis MR-1菌悬液接种至液体培养基中，分别投加0、 1、 2、 5 g ·L^-1针铁矿，再加入一定量的HgCl₂溶液使HgCl₂浓度为1 mg ·L^-1，向棕色瓶中充N₂除氧后置于恒温培养箱中30℃避光静置培养，不同时间取样，测定溶液中Fe³⁺和MeHg浓度. 1.2.3 影响因素实验

不同初始pH时针铁矿的异化还原对汞甲基化的影响：在30 mL的棕色瓶中加入19 mL液体培养基，液体培养基的pH分别为5.0、 6.0、 7.0、 8.0，将1 mL S. oneidensis MR-1菌悬液接种至液体培养基中，投加1 g ·L^-1针铁矿，再加入一定量的HgCl₂溶液使HgCl₂浓度为1 mg ·L^-1，向棕色瓶中充N₂除氧后置于恒温培养箱中30℃避光静置培养，不同时间取样，测定溶液中Fe³⁺和MeHg浓度.

不同浓度腐殖酸作用下针铁矿的异化还原对汞甲基化的影响：在30 mL的棕色瓶中加入19 mL液体培养基，将1 mL S. oneidensis MR-1菌悬液接种至液体培养基中，投加1 g ·L^-1针铁矿，同时加入腐殖酸溶液，腐殖酸浓度分别为0、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0 mg ·L^-1. 再加入一定量HgCl₂溶液使HgCl₂浓度为1 mg ·L^-1，向棕色瓶中充N₂除氧后置于恒温培养箱中30℃避光静置培养，不同时间取样，测定溶液中Fe³⁺和MeHg浓度. 1.3 样品处理与分析

样品经过4000 r ·min^-1离心分离后，测定溶液中Fe²⁺、 Fe³⁺和MeHg的浓度. 1.3.1 甲基汞的测定

上清液样品经25% KOH/甲醇溶液提取后，用0.22 μm滤膜过滤，再加入0.05 mol ·L^-1 TBABr溶液混合衍生成络合物，然后进样测定.

甲基汞的测定采用Agilent 1100高效液相色谱仪，配可变波长紫外检测器和HP化学工作站. 色谱操作条件^[8]：C18 Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为含0.01 mol ·L^-1 TBABr和0.025 mol ·L^-1 NaCl的水溶液 ∶甲醇=45 ∶55(体积比)，柱温35℃，流速1.0 mL ·min^-1，检测波长为225 nm，进样量为20 μL. 1.3.2 溶液中Fe²⁺、 Fe³⁺的测定

用邻菲啰啉紫外分光光度法测定水溶液中Fe²⁺、 Fe³⁺浓度. 取样时，充分摇匀避光小瓶，微生物混合培养实验采用自动取样器吸取1 mL(提前确定稀释比例)悬液置于含4 mL浓度为 0.5 mol ·L^-1的盐酸溶液中浸提，将浸提液过0.22 μm滤膜，转移至50 mL比色管中，依次分别加入 0.1%盐酸羟胺2.5 mL、 pH 4.6醋酸-醋酸钠缓冲溶液5 mL、 0.1%邻菲啰啉5 mL，稀释至刻度，摇匀，放置10 min. 以显色剂溶液作为参比，在最大吸收波长处分别测定，3次重复.

2 结果与分析 2.1 S. oneidensis MR-1对针铁矿的还原溶解

当温度为30℃，pH 7.0，针铁矿投加量分别为1、 2、 5 g ·L^-1，溶液中Fe³⁺浓度随时间的变化趋势如图 2所示. 从中可以看出，针铁矿投加量为1 g ·L^-1时，溶液中Fe³⁺浓度最大，投加量为5 g ·L^-1时溶液中Fe³⁺浓度最小. 第1 d内针铁矿投加量不同的3个反应体系中Fe³⁺浓度都呈上升趋势且趋势基本一致，2~6 d内1 g ·L^-1和2 g ·L^-1体系中Fe³⁺浓度保持上升趋势且在1 g ·L^-1体系中上升更快，6 d后两组体系中Fe³⁺浓度都开始下降. 而5 g ·L^-1反应体系中Fe³⁺浓度从第2 d开始就一直下降，但幅度很小. 3个反应组中都存在Fe³⁺，说明S. oneidensis MR-1对针铁矿有溶解作用，且对1 g ·L^-1针铁矿的溶解作用最强，对5 g ·L^-1的溶解作用最小.

图 2

Fig. 2

图 2 针铁矿还原溶解过程中Fe3+浓度变化 Fig. 2 Concentration changes of Fe3+ in the process of dissolution and reduction of goethite

图 3是反应过程中溶液Fe²⁺浓度变化曲线，三组体系中Fe²⁺浓度的变化趋势基本一致，1~10 d呈上升趋势，10 d后基本趋于平稳. 1 g ·L^-1反应体系中Fe²⁺浓度最大，5 g ·L^-1反应体系中Fe²⁺浓度最小. 溶液中存在Fe²⁺表明针铁矿在S. oneidensis MR-1的作用下发生了异化还原，在1 g ·L^-1体系中铁还原作用最大，在5 g ·L^-1体系中铁还原作用最小，说明针铁矿投加量在一定范围内，针铁矿越少，铁还原作用越大. 已有研究表明，当针铁矿较多的时候，矿物粒子间的团聚效应增强^[18]，针铁矿发生聚集使比表面积减小，进而使得铁还原微生物与针铁矿的直接接触受阻，抑制了针铁矿的还原溶解.

图 3

Fig. 3

图 3 针铁矿还原溶解过程中Fe2+浓度变化 Fig. 3 Concentration changes of Fe2+ in the process of dissolution and reduction of goethite

当温度为30℃，pH 7.0，Hg²⁺浓度为1.0 mg ·L^-1，分别向反应体系中投加1、 2、 5 g ·L^-1针铁矿，以不添加针铁矿的反应体系作为对照组，各反应体系中MeHg的生成量随时间的变化趋势如图 4所示. 从中可以看出，投加针铁矿的三组反应体系中甲基汞的生成量都比对照组大，投加1 g ·L^-1针铁矿时汞的甲基化率最大，随着针铁矿的增多，甲基化率下降. 图 5是不同针铁矿投加量时溶液中生成甲基汞的最大浓度和Fe³⁺浓度，结合图 2和图 4，针铁矿的投加量在一定范围内减小，Fe³⁺的浓度越大，甲基汞的生成量也最大. Kerin等^[19]研究发现，虽然铁还原菌的汞甲基化可以利用其它电子受体(富马酸、 硝酸盐等)进行，但当Fe³⁺作为电子受体时汞的甲基化效率最高.

图 4

Fig. 4

图 4 不同剂量针铁矿的异化还原对汞甲基化的影响 Fig. 4 Effects of dissimilatory reduction of different goethite dosages on mercury methylation

图 5

Fig. 5

图 5 针铁矿不同投加量时溶液中MeHg和Fe3+浓度 Fig. 5 Concentrations of MeHg and Fe3+ in solution under different dosages of goethite

当温度为30℃，初始pH分别为5.0、 6.0、 7.0、 8.0，针铁矿投加量为1 g ·L^-1，氯化汞浓度为1 mg ·L^-1 时，在S. oneidensis MR-1作用下，溶液中甲基汞浓度随时间的变化趋势如图 6所示. 从中可以看出，当初始pH 6.0时，溶液中甲基汞平衡浓度最高，为413.76 μg ·L^-1. 初始pH 5.0时，甲基化率有所下降，初始pH大于6.0且增大时，甲基汞生成量持续下降. 不同初始pH下，甲基汞浓度均在前4 d快速增大，之后趋于稳定. pH不仅能影响针铁矿的溶解，酸性条件有利于针铁矿的溶解，而且能影响S. oneidensis MR-1的生长代谢活动，从而影响汞的甲基化. 通常认为酸性条件有利于甲基汞的形成,而中性和碱性条件则更利于二甲基汞 (DMHg) 的形成，但过低的pH不利于甲基汞的形成. 经检测发现酸性水体中的鱼体内甲基汞含量偏高，要高于碱性水体中的鱼. 有研究表明，当溶液pH为5.5时，甲基汞的浓度约是pH为8.5时的7倍^[20,21]，但是当pH小于5.5时，甲基汞的浓度又相对较低，可能是过酸的条件会影响汞的有效性或者微生物的活性，从而抑制了甲基化反应的进行^[10,22]. 图 7是在不同初始pH条件下溶液中生成甲基汞的最大浓度和Fe³⁺浓度，随着pH的升高，溶液中Fe³⁺浓度逐渐降低，说明S. oneidensis MR-1在弱酸性条件下对针铁矿有更好的溶解还原作用. 而当初始pH 5.0时，溶液中甲基汞的浓度小于初始pH 6.0时的甲基汞浓度，可能是因为较低的pH影响了汞的有效性.

图 6

Fig. 6

图 6 不同初始pH时针铁矿的异化还原对汞甲基化的影响 Fig. 6 Effects of dissimilatory reduction of goethite on mercury methylation under different initial pH

图 7

Fig. 7

图 7 不同pH时溶液中MeHg浓度和Fe3+浓度 Fig. 7 Concentrations of MeHg and Fe3+ in solution under different pH

当温度为30℃，pH 7.0，腐殖酸浓度分别为0、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0 mg ·L^-1时，溶液中甲基汞浓度随时间的变化趋势如图 8所示. 从中可以看出，甲基汞浓度在第4 d或第5 d达到最大值，随后趋于稳定. 图 9是不同腐殖酸浓度时溶液中生成MeHg的最大浓度和Fe³⁺浓度，随着腐殖酸浓度的增大，溶液中Fe³⁺浓度逐渐上升. 当腐殖酸浓度为2.0 mg ·L^-1时，针铁矿的异化还原对汞甲基化的促进作用最强，生成甲基汞的最大浓度为434.58 μg ·L^-1. 腐殖酸浓度在1.0~2.0 mg ·L^-1时，甲基汞浓度呈上升趋势且比无腐殖酸时大，当腐殖酸浓度为5.0 mg ·L^-1时，溶液中甲基汞浓度比无腐殖酸时小，腐殖酸浓度在5.0~10.0 mg ·L^-1时，溶液中甲基汞浓度持续降低.

图 8

Fig. 8

图 8 不同浓度腐殖酸作用下针铁矿的异化还原对汞甲基化的影响 Fig. 8 Effects of the reduction of goethite on mercury methylation under different concentrations of humic acid

图 9

Fig. 9

图 9 不同浓度腐殖酸作用下溶液中MeHg浓度和Fe3+浓度 Fig. 9 Concentrations of MeHg and Fe3+ in solution under different concentrations of humic acid

腐殖酸促进针铁矿的溶解，而Fe³⁺对汞的甲基化起促进作用，所以在一定浓度范围内的腐殖酸能促进汞的甲基化，但是由于腐殖酸会与Hg²⁺结合形成不溶性Hg，进而降低Hg的生物可利用性，因此，当腐殖酸浓度持续增大时，底物可溶性Hg²⁺浓度变小，汞的甲基化作用减弱^[23,24].

3 讨论

针铁矿是不溶性铁矿，但是在S. oneidensis MR-1的作用下，溶液中有Fe²⁺和Fe³⁺生成，表明针铁矿在S. oneidensis MR-1作用下可以发生溶解作用并且被还原. 很多研究表明^{[25, 26, 27]}，S. oneidensis MR-1可以通过氧化有机物获得生长代谢所需能量，同时发生电子转移将Fe(Ⅲ)还原成Fe(Ⅱ). 在针铁矿投加量少的反应体系中，溶解作用和还原作用都要强于针铁矿多的反应体系，随着针铁矿投加量的增加，铁还原作用减弱. 已有研究表明，当针铁矿较多时，矿物粒子间的团聚效应增强，针铁矿发生聚集使比表面积减小，使得铁还原微生物与针铁矿的直接接触受阻，进而抑制了针铁矿的还原溶解.

S. oneidensis MR-1也是一种汞甲基化细菌^[28]，能够将无机汞转化为甲基汞，汞的微生物甲基化是在各种因素共同作用下的一个复杂过程. 针铁矿的异化还原对汞的生物甲基化有促进作用，溶液中针铁矿投加量为1 g ·L^-1时，汞甲基化率最高，随着针铁矿投加量的增大，汞甲基化率逐渐减小. Kerin等^[19]的研究发现，虽然铁还原菌可以利用很多电子受体(富马酸、 硝酸盐等)，但当Fe³⁺作为电子受体时汞的甲基化效率最高，因此针铁矿的溶解还原使得溶液中生成Fe³⁺,从而促进汞的生物甲基化，而溶液中Fe³⁺浓度随着针铁矿的增多而降低，所以当针铁矿投加量增大时，汞甲基化作用减小. pH对汞生物甲基化的作用相对较复杂^[29]，pH不仅可以直接促进不溶性针铁矿的溶解，而且对S. oneidensis MR-1的生长代谢活性都有一定的影响，弱酸性环境比中性和碱性条件更有利于甲基汞的生产，但过酸条件不利于汞甲基化.

总体上看，甲基汞的生成量与溶液中Fe³⁺浓度呈正比. 文献^[30]指出腐殖酸能直接还原溶解含Fe(Ⅲ)矿物，对不同含Fe(Ⅲ)矿物的还原溶解效果依次为针铁矿>赤铁矿>磁铁矿>钢渣，说明腐殖酸对针铁矿有很好的还原溶解效果，进而甲基汞的生成量理应与溶液中腐殖酸的浓度呈正比，然而腐殖酸对汞生物甲基化的作用并非如此，腐殖酸仅在低浓度时对汞甲基化起促进作用. 当溶液中腐殖酸浓度达到2 mg ·L^-1时，汞甲基化率最大，但当腐殖酸浓度继续增大时^[31]，甲基汞浓度减小，虽然高浓度腐殖酸能促进针铁矿的溶解，但是由于腐殖酸能与可溶性Hg²⁺结合^[32]，形成不溶性Hg，进而导致Hg的生物可利用性降低，再者高浓度的腐殖酸会使反应体系变为不利于微生物生长的过酸环境^[33]，从而抑制汞的生物甲基化.

4 结论

(1)针铁矿在S. oneidensis MR-1作用下发生溶解还原，且针铁矿投加达到一定量后，随着针铁矿投加量的增大，针铁矿的溶解作用和还原作用都将减小.

(2)S. oneidensis MR-1还原溶解针铁矿对汞生物甲基化起促进作用，生成Fe³⁺浓度越高，汞甲基化率越高.

(3)弱酸性条件比中碱性和强酸条件更有利于汞的生物甲基化.

(4)腐殖酸在一定浓度范围内促进汞的甲基化，浓度过高则会抑制汞的甲基化.