2015, Vol. 36
2. 南开大学环境科学与工程学院, 天津 300071;
3. Department of Energy and Mineral Engineering, the Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA
2. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China;
3. Department of Energy and Mineral Engineering, the Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA
微生物降解是石油污染修复的主要方法之一，目前已有大量石油降解菌的分离研究报道[1, 2, 3]. 由于石油是一种复杂的碳氢混合物，水溶性较低，而通常单一菌株只对特定类型(如碳链长度、苯环数量等)烃类化合物具有降解效果，因而石油的微生物降解受到很大程度的限制[4,5]. 同时，由于石油降解是分步进行的，在石油降解过程中需要多种酶和微生物参与[6,7]，所以，在实际应用中，常采取多种混合菌降解石油[8, 9, 10, 11]. 微生物菌群通过协同作用，集合多种酶促体系促进酶解反应，能增加石油污染物质的降解水平[12]，Zhao等[13]构建由Rhizobiales sp.、Pseudomonas sp.、Brucella sp.、Bacillus sp.、Rhodococcus sp.、Microbacterium sp.和Roseomonas sp.组成的混合菌群能够去除71.4%的脂肪烃和36.0%的芳香烃； 张辉等[14]将芽胞杆菌(Bacillus sp.)和黄杆菌(Flavobacterium sp.)混合固定化后应用于地表水石油的降解，发现其效果明显优于单菌； 王志强等[15]将3株假单胞菌属、黄杆菌属和微球菌属组合在一起发现复合菌的降解率要高于3株菌的单一降解率； 赵硕伟等[16]将Rhodococcus sp.、Gordonia sp.和Pesudomonas sp.等比例组成复合菌群，其石油降解能力超过任何单一菌株，在5 d内能降解70.3%的石油； Hudcova等[17]比较了Bacillus cereus NDT4、Pseudomonas putida NDT1、Pseudomonas fluorescens NDT2 和 Achromobacter sp. NDT3这4株菌的混合菌及单菌对二硝基甲苯同分异构体的降解性能，结果表明混合菌比单菌的降解速度要快近50倍.
然而，微生物之间并非都是互惠共生关系，并不是所有的微生物组合都能促进污染物的降解，由于菌种之间存在着拮抗、竞争作用，微生物之间可能在一定程度上会对石油的降解起抑制作用，降低微生物组合的修复效果[18,19]，如何消除菌种间的抑制作用、构建出优势菌群是当前所要解决的一个主要问题之一. 目前研究已发现不同种属的石油降解菌株组合在一起能促进石油的降解，但微生物之间的相互关系却仍不清楚，其筛选和组合还是一个随机过程，特别是关于种间相互作用机制的认识还十分有限，虽然已有少量关于同种属微生物的研究报道，如Serebrennikova等[20]研究了固定化的两株红球菌属Rhodococcus ruber 和 Rhodococcus opacus在生物反应器中对石油烃的降解应用，Barsing等[21]筛选分离出矿化解磺化芳香胺的3株假单胞菌属(P. pseudoalcaligenes TJ21、 P. citronellolis TJ22 和P. testosterone TJ23)，通过构建混合菌群发现，三元混合菌效果要高于单菌和二元混合菌，其矿化效果高达90%，但是关于种间微生物对石油降解的相互作用机制仍不清楚，如何优化组合种间微生物有待进一步研究.
本研究从天津大港油田石油污染土壤和渤海海上钻井平台洗油污水中进行细菌分离富集，筛选出具有石油降解能力的菌株，通过细菌生理生化实验、16S rDNA序列分析对石油降解菌进行鉴定； 采用单因子变量法，对同菌属种间的石油降解菌进行排列组合构建石油降解微生物组，测定其石油降解效果，从而确定最优菌种组合，同时结合微生物基因系统进化树来分析探讨同菌属种间的相互作用，以加深对石油降解菌群的认识，以期为石油污染的生物修复提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 样品的采集与石油测定
样品采集：本实验所用土壤和含油废水分别取自于大港油田某输油管漏油口和中国渤海某钻井平台洗油污水.
土壤含水率测定：重量法.
pH值测定：土壤用去CO2蒸馏水按1 ∶2.5比例稀释后用pH计法测定； 水样直接用pH计测定.
石油质量浓度测定：紫外分光光度法[22,23]. 用60～90石油醚溶解原油配制成0、1、2、4、6、8、10 mg ·L-1 质量浓度的原油标样，依据不同的吸收特性，分别测定烷烃和芳烃的最佳吸收波长(实验确定烷烃为227 nm，芳香烃为258 nm)，在最佳吸收波长下，制作烷烃和芳烃的标准吸光度曲线.
土样石油质量浓度测定：通过索氏提取法萃取土壤中石油烃，用紫外分光光度测定烷烃和芳烃的质量浓度.
水样石油质量浓度测定：称取80.00 mL水样至分液漏斗中，加入2.0 g NaCl和1 mL(1 ∶1)H2SO4，用60～90石油醚洗涤采样瓶并将洗液转至分液漏斗，充分振荡3 min，静置分层，将水相放入原采样瓶中； 在玻璃砂芯漏斗中内铺约1 cm左右厚度的脱脂棉，称取5.0 g无水Na2SO4放入脱脂棉上方，将萃取液滤入50 mL容量瓶中； 将采样瓶中的原水相重复萃取3次，萃取液滤入同一容量瓶中； 最后用15 mL石油醚洗涤漏斗，将洗液转移至容量瓶中、定容； 以石油醚为参比，测定样品中烷烃和芳烃的吸光度值，计算烷烃和芳烃的质量浓度.
1.2 石油降解菌的筛选及鉴定培养基Ⅰ：NaNO3 2.0 g ·L-1，KH2PO4 1.0 g ·L-1，K2HPO4 ·3H2O 0.5 g ·L-1，NaCl 0.5 g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.1 g ·L-1，CaCl2 0.01 g ·L-1，FeSO4 ·7H2O 0.01 g ·L-1，原油(取自大港油田)10.0 g ·L-1，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min.
培养基Ⅱ：牛肉浸出膏 3.0 g ·L-1，蛋白胨 10.0 g ·L-1，NaCl 5.0 g ·L-1，琼脂 20.0 g ·L-1，原油(取自大港油田)5.0 g ·L-1，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min.
降解菌富集：将石油污染土壤和污水分别用0.8%灭菌生理盐水按1 ∶10稀释、混合均匀，取10 mL稀释菌液加入90 mL培养基Ⅰ中，28℃、300 r ·min-1条件下培养7 d； 以10%接种含量加入新的培养基Ⅰ中循环接种培养3次进行富集培养.
降解菌纯化：将上述富集菌液用灭菌生理盐水稀释为10、100、1 000倍这3个梯度，分别取菌液1 mL于培养基Ⅱ中进行平板分离，37℃恒温培养. 待培养皿长出菌落后，根据形态、颜色等挑选典型菌落在培养基Ⅱ上划线纯化，重复3～4次，直至出现单菌落，将纯化后的单菌株接入液体培养基中扩大培养并保存菌种.
生理生化试验：对菌落的形态、颜色进行观察记录； 同时进行革兰氏染色和镜检，并对纯菌进行生理生化实验(甲基红、淀粉水解、葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、硝酸盐还原、柠檬酸利用、明胶、V-P试验).
16S rDNA鉴定：使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen，USA)试剂盒提取菌株DNA，具体步骤参见试剂说明书，采用27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)引物扩增16S rDNA，所用试剂为Go Taq Master Mix(Promega，USA)，PCR步骤和程序采用Wang等[24]的方法. PCR产物送交华大基因北京公司进行DNA测序. 将基因序列在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行同源序列搜索，使用MEGA Version 5.0软件对基因序列进行系统发育分析和进化树的构建.
1.3 单菌的降解性能 原油培养基：NH4NO3 2.0 g ·L-1，K2HPO4 0.5 g ·L-1，KH2PO4 1.0 g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.5 g ·L-1，无水CaCl2 0.02 g ·L-1，NaCl 5.0 g ·L-1，FeCl3 ·6H2O 0.02 g ·L-1，原油 5.0 g ·L-1，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min.培养条件：将降解菌以20%接种含量加入150 mL原油培养基中，在30℃、300 r ·min-1振荡培养7 d，设置一组空白对照，每组实验设置3个平行.
降解率测定：参照1.1节中方法测定7 d后液体培养基中的残余烷烃和芳烃的质量浓度. 为了消除石油灭菌和自然光降解等所引起的误差，菌株对原油(烷烃和芳烃)的降解率以空白组为参照，降解率计算公式如下：
根据烷烃和芳烃降解率，选取4株芽胞杆菌根据排列组合(C24+C34+C44)构建11个微生物组，以20%总接菌含量(每种细菌具有相同的比重)进行降解实验，培养条件为：150 mL 5.0 g ·L-1原油培养基，30℃、300 r ·min-1恒温振荡培养7 d，设置一组空白对照，每组设置3个平行. 微生物组的石油降解率测定方法按照1.3节中所述方法进行，最后计算出微生物组烷烃和芳烃的降解率，使用方差分析比较数据间的差异. 2 结果与分析 2.1 菌株的分离鉴定及降解性能
大港油田石油污染土壤呈碱性(pH=8.1)，芳烃含量(以干土计)为(10.10±4.64)mg ·g-1，烷烃含量(以干土计)为(9.55±5.05)mg ·g-1； 石油废水呈酸性(pH=6.3)，其芳烃含量为(5.65±2.37) mg ·L-1，烷烃含量为(5.47+2.57) mg ·L-1. 本实验通过富集分离得到6株细菌，经显微镜形态观察和生理生化试验进行初步鉴定，其结果如表 1所示，从土壤中分离出的S1、S2、S3和S4是革兰氏阳性细菌，从废水中分离出的W1和W2是革兰氏阴性细菌.
细菌16S rDNA基因系统进化树(图 1)分析鉴定进一步表明，从土壤分离的4株菌(S1、S2、S3、S4)属于Firmicutes厚壁菌门中的Bacillus芽胞杆菌属，其同源性分别为100%、100%、97%和100%，从废水中分离的2株菌W1和W2分别属于Proteobacteria变形菌门中的Pseudomonas假单胞菌属和Ochrobactrum苍白杆菌属，其同源性分别为100%和99%.
 | 表 1 石油降解菌株的形态和生理生化试验特性 Table 1 Morphologic,physiological and biochemical characteristics of petroleum-degrading microorganisms |
 | 图 1 分离石油降解菌株的16S rDNA基因系统进化树 Fig. 1 16S rDNA phylogenetic tree of isolated petroleum-degrading microorganisms |
分离菌株的7 d石油降解率如图 2所示，各细菌降解率具有显著的差异(P<0.05)，从土壤中分离出的芽胞杆菌属S3对烷烃和芳烃降解率最高，分别为41.3%和30.9%，同时，除W1外，各菌对烷烃的降解率要高于芳烃的降解率，这与已有研究报道关于石油烃类的可降解性基本相一致，即直链烷烃>分链烷烃>单环芳烃>多环芳烃[2,25]. 此外，单菌石油降解结果还显示，从中海油污水中分离出的Pseudomonas假单胞菌属(W1)和Ochrobactrum苍白杆菌属(W2)对大港油田石油的降解率低于从大港油田土壤中分离出的Bacillus芽胞杆菌属S3和S4，这表明，从石油污染场地中筛选出的内源微生物对本油田石油的降解效果要优于外源物种.
 | 图 2 分离菌株的7 d石油降解率 Fig. 2 The 7 days-degradation rates of petroleum by the isolated microorganisms |
实验从土壤中筛选出4株芽胞杆菌属菌株构建 11个微生物组进行石油降解，分析同菌属微生物之间对石油降解的相互作用，其降解率如图 3所示. 结果显示即使是同菌属间的微生物组合也具有极显著不同的石油降解率(P<0.01)，构成的11个微生物组对石油降解有着不同的效果. 在5.0 g ·L-1原油培养基中，经过7 d培养后，由S1和S4构成的微生物组F3具有最高的烷烃(50.5%)和芳烃(54.0%)降解率，而由S2和S3构成的微生物组F4对烷烃和芳烃的降解率最低，分别为18.5%和18.9%.
 | 图 3 微生物组的7天石油降解率 Fig. 3 The 7 days-degradation rates of petroleum by the microbiomes |
如图 4所示，与构成微生物组中具有最高降解率的单菌相比，微生物组烷烃和芳烃降解有显著增强的分别有1个和5个，而降解效果显著降低的分别有7个和4个，其余微生物组对石油的降解没有显著促进和抑制作用. 微生物组F3
(S1和S4)对烷烃和芳烃降解的促进效果最高，比单菌(S4)的降解率分别提高了69.9%和156.1%，同时比最优降解单菌S3的降解率也分别高出22.1%和74.6%； 微生物组F4(S2和S3)对烷烃和芳烃降解的抑制作用最高，比单菌(S3)的降解率分别降低了55.3%和39.0%. 上述结果表明，同菌属微生物之间对石油的降解同时存在协同促进和抑制作用； 同时，尽管大部分微生物组对烷烃的降解表现为抑制作用，而对芳烃降解起抑制和促进作用的微生物组几乎各占一半，但仍然都存在最佳优势微生物组，即通过优化组合后仍可筛选出比最优降解单菌具有更高烷烃和芳烃降解率的微生物组； 此外，结果还显示，虽然S3具有最高烷烃和芳烃降解率，但是与其他菌组合时并非是具有最高降解率的微生物组.
 | 图 4 微生物组的石油降解效果Ven图 Fig. 4 Ven figure for microbiome degradation efficiency of petroleum |
经过长期的适应和驯化，在受石油污染的环境中存在着许多可以降解石油的微生物，目前已报道发现能够降解石油烃类物质的微生物有100多个属200多个种[1]，本研究分离出的芽胞杆菌属和假单胞菌属属于常见石油降解菌属[26]，而Ochrobactrum苍白杆菌属则鲜有报道，Sayavedra-Soto等[27]研究曾发现Ochrobactrum虽然不能降解烷烃，但是能够形成高细胞聚合体絮凝剂来增加烷烃的捕获从而促进降解，本研究所分离的苍白杆菌属W2，在5.0 g ·L-1原油培养基中，其烷烃和芳烃7 d降解率分别为12.3%和8.8%，高于国内现有的报道，李宝明等[28]从胜利油田石油污染土壤中分离出两株苍白杆菌属，在相同的5.0 g ·L-1原油质量浓度下(28℃、150 r ·min-1)，其5 d石油降解率不到3%. 因此，本研究中筛选的苍白杆菌属W2有待做更深入地研究.
单菌降解实验显示，石油场地的内源微生物(S3和S4)对本土石油的降解率高于外源微生物(W1和W2)，这表明在污染土壤的石油老化过程中，微生物的适应驯化使得内源微生物对不同类型石油烃的降解能力跟本场地石油烃的组分形成了一定相关性； 同时，内源微生物比外源微生物更适应本场地的污染环境，而表现出更高的代谢活性，徐智等[29]研究显示内源微生物接种剂更有利于堆肥的快速启动； 宋雪英等[30]研究石油污染土壤生物修时也发现，外源专性细菌和真菌的加入对矿物油和多环芳烃的降解没有显著的促进效果. 因而在实际应用中，从石油污染场地中强化筛选出土著石油降解菌，再返投至污染场地后能够较快地适应原位污染场地的特殊环境，能有效解决菌剂修复周期长适应性差等问题.
3.2 种间微生物的相互影响由于不同微生物对石油烃具有不同的利用率，以及石油烃类化合物的复杂性，通过组合不同微生物促进石油烃降解已成为石油污染修复的重要手段之一，但是也有部分研究报道发现微生物的相互作用能够抑制石油降解，王丽娟等[31]曾在研究中发现有些混合菌明显低于各种单菌对石油的降解效果； 王鑫等[32]从石油污染海水中分离出6株石油降解菌，发现构建的六元混合菌的降解能力优于单一菌株，对C13至C19的组分几乎能全部降解，微生物之间表现出明显的协同作用，但是不同的二元混合菌中对柴油降解存在着协同和拮抗作用.
在本研究中，同菌属种间微生物在石油降解过程中表现出复杂的相互关系. 在烷烃的降解中[图 4(a)]，虽然S3具有最高的单菌烷烃降解率，但是S3与其他菌之间表现出对烷烃降解的显著抑制作用，如在与S1/S2/S4构成微生物组的烷烃降解率中，除了单独与S4构建的F6没有显著变化外(F6的烷烃降解率仍略低于S3，但P>0.05)，其余均出现了极显著地降低(P<0.01)，尤其S1和S4构成的微生物组F3具有最高烷烃降解率，而当S3与S1和S4共同构成微生物组F9后，烷烃降解率从50.5%极显著地降低至20.2%，这表明在F9中，3株同菌属微生物相互之间对烷烃降解的抑制效果要大于协同促进作用(在F8中也表现出相似的变化规律). 在芳烃降解中[图 4(b)]，微生物之间的相互作用表现得更为复杂，例如，由S3参与构成的微生物组F2(S1/S3)、F4(S2/S3)和F7(S1/S2/S3)对芳烃降解表现出极显著的抑制作用(P<0.01)，S3与S4组合时对芳烃降解表现出极显著的促进作用(P<0.01)，而构成的三元微生物组F9(S1/S3/S4)和F10(S2/S3/S4)对芳烃降解的促进作用消失，但是当4种菌组合在一起时(F11)，对芳烃降解又表现为显著的促进作用(P<0.05)，这表明同菌属不同种间微生物对芳烃降解的抑制和促进作用各不相同； 又如，S1/S4和S2/S4均表现为对芳烃降解的促进作用(其中，S1和S4组合后具有最大的芳烃降解率，即具有最高促进作用)，但当3种菌组合在一起时对芳烃降解既没有促进作用也没有抑制作用.
在构建的微生物组中，各菌之间对石油的降解并非仅是加和效应，如微生物组F3(S1+S4)对芳烃和烷烃的降解率均大于S1和S4两菌的单独降解率之和，同时其烷烃和芳烃降解率要显著高于其他微生物组，说明两株菌间存在着协同促进作用. S1和S4之间主要存在着促进作用这可能是因为：S1和S4属于同一进化分支，而与S2和S3分属3个不同分支(图 1)，这表明亲缘性近的芽胞杆菌属种间微生物相互作用是协同互惠，从而对石油的降解表现出促进效果； 而随着物种亲缘性减少(即进化距离增加，在16S rDNA系统进化树中表现为不同的分支)，微生物之间开始出现拮抗或竞争，对石油的降解效果也表现为抑制作用. 有研究发现某些细胞能释放出一种细胞毒素，它们具有很窄的杀菌效果，这种细胞素对协调自然界中微生物的种间相互作用具有重要作用，从而导致了物种相互作用的微妙变化[33]； Gong等[34]也曾指出在物种分类属的水平上，相似的外源细菌能够刺激相似的内源细菌，从而促进原油强化或微生物强化石油回收率技术的效果. 因此，当构建混合菌降解石油时，在选择芽胞杆菌属的种间微生物过程中，应选择亲缘性近、进化距离小的微生物，才能避免微生物之间抑制作用，达到增强污染修复的效果. 4 结论
(1)研究从石油污染土壤和废水中分离出6株具有石油降解能力的细菌，经形态观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析鉴定表明，它们分别属于Bacillus芽胞杆菌属(S1、S2、S3、S4)、Pseudomonas假单胞菌属(W1)和Ochrobactrum苍白杆菌属(W2)，其中，S3对大港油田原油具有最高的烷烃和芳烃降解率，从废水中分离出的苍白杆菌属W2的降解率要高于国内现有报道的降解率.
(2)石油污染场地中筛选出的内源微生物对本油田石油的降解效果要优于外源物种，内源微生物对不同类型石油烃的降解能力跟本场地石油烃的组分具有一定的相关性.
(3)4株芽胞杆菌属细菌构建微生物组对本场地石油降解实验的结果表明，同菌属微生物种间对石油的降解同时存在协同促进和拮抗抑制作用，亲缘性近的芽胞杆菌属之间对石油降解主要表现为促进作用.
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