抗生素废水是一类成分复杂、生物毒性大，含多种抑制物质的难降解高浓度有机废水. 由于其特殊的性质，在生物处理过程中会对活性污泥中的主要微生物功能种群产生较大的影响，不仅影响着种群的动态变化，同时也会造成污染物去除效果的变化^{[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}.

丝状菌(filamentous bacteria)是活性污泥中的重要功能种群，由于其自身特殊的表观形状及生理生化特性，一方面它作为絮体的主要骨架结构，保证菌胶团菌的附着生长并发挥活性污泥的功能与作用； 另一方面，丝状菌在一定环境因子条件刺激下发生显著的过量生长现象，引起絮体的解絮和菌胶团菌的流失，从而导致污泥膨胀现象的产生并最终影响出水水质^{[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]}.

本研究采用平行运行的好氧生物膜反应器，通过Eikelboom及Jenkins镜检、荧光原位杂交等分析方法，重点考察典型抗生素废水长期好氧生物去除过程中，活性污泥系统中丝状菌的优势种群类型、丰度变化及对出水水质的影响； 探讨在不同抗生素及不同浓度胁迫条件下，主要丝状菌与其的响应关系，以期为抗生素废水生物处理过程的稳定运行提供一定的科学基础.

实验采用4个平行好氧生物膜反应器(A、B、C、D)，材质为有机玻璃，有效容积均为2 L，水力停留时间(HRT)为24 h，接种污泥为北京某城市污水处理厂活性污泥，污泥浓度(MLSS)为3 000 mg ·L^-1. 本实验以目前生产及生活中广泛使用的三类抗生素：大环内酯类(螺旋霉素)、四环素类(土霉素)及氨基糖苷类(链霉素)为研究对象. 其中螺旋霉素为窄谱抗生素，主要作用于革兰阳性球菌、杆菌及少数革兰阴性球菌等； 土霉素为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用； 链霉素为广谱杀菌抗生素. 实验用水为人工配水，主要成分及水质指标如表 1所示. 其中反应器A为空白对照，未投加抗生素，反应器B投加螺旋霉素(大环内酯类)，反应器C投加土霉素(四环素类)，反应器D投加链霉素(氨基糖苷类). 初始抗生素浓度均为5mg ·L^-1(Ⅰ期)，连续稳定运行100d后，浓度提升至25mg ·L^-1(Ⅱ期)并连续稳定运行. 微量元素储备液浓度见表 2.

表 1(Table 1)

表 1 人工配水的主要成分及进水水质指标1) Table 1 Components and water quality indexes of synthetic antibiotic wastewater 主要成分 浓度/mg ·L-1 水质指标 浓度/mg ·L-1 羧甲基纤维素钠 50 COD 400 可溶性淀粉 100 NH4+-N 30 葡萄糖 150 螺旋霉素 5a/25b 胰蛋白胨 100 土霉素 5a/25b (NH4)2SO4 126 链霉素 5a/25b KH2PO4 31 微量元素储备液 1 mL ·L-1 1)a为Ⅰ期抗生素浓度； b为Ⅱ期抗生素浓度

表 1 人工配水的主要成分及进水水质指标1) Table 1 Components and water quality indexes of synthetic antibiotic wastewater

表 2(Table 2)

表 2 微量元素储备液 Table 2 Composition of trace element stock solution 主要成分 浓度/mg ·L-1 主要成分 浓度/mg ·L-1 H3BO3 50 CuSO4 ·5H2O 10 MnSO4 ·4H2O 40 CoCl2 10 ZnSO4 ·7H2O 40 KI 10 Na2MoO4 ·4H2O 20 NiCl2 10

表 2 微量元素储备液 Table 2 Composition of trace element stock solution

COD、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N的测定均采用文献^[19]中的标准方法. 丝状菌形态鉴定及丰度定量采用Eikelboom^[20]法(相差显微观察结合革兰氏和奈瑟氏染色)及荧光原位杂交技术(FISH)^[21]. 2 结果与分析 2.1 反应器运行

如表 3所示，随着抗生素浓度的升高，4个平行反应器的COD去除效果前后均无明显变化，但C反应器的COD出水浓度始终高于B、D反应器. 由此可知：相同抗生素浓度水平下，土霉素对微生物群落较先出现抑制作用. NH₄⁺-N 去除结果显示，在不同抗生素浓度条件下，NH₄⁺-N的去除存在一定变化：当I期进水抗生素浓度为5mg ·L^-1时，4个反应器NH₄⁺-N去除效果均在96%以上； 当Ⅱ期进水抗生素浓度升至25mg ·L^-1时，除B反应器NH₄⁺-N出水浓度没有明显变化，C、D反应器均出现一定程度的出水NH₄⁺-N浓度的上升，其中C反应器出水NH₄⁺-N上升无波动，较稳定，但D反应器在Ⅱ期初始NH₄⁺-N出水无明显变化在4 mg ·L^-1左右波动，之后NH₄⁺-N出水开始出现大波动，最高出水为20 mg ·L^-1左右. 由此可知：相同抗生素浓度水平下，链霉素对氨氧化细菌抑制较明显，其次为土霉素.

表 3(Table 3)

表 3 各反应器COD和NH4+-N去除率 Table 3 COD and NH4+-N removal performance of different reactors 项目 进水/mg ·L-1 去除率/% Ⅰ期 Ⅱ期 COD A(空白) 400 88.50 90.50 B(螺旋霉素) 400 85.00 88.25 C(土霉素) 400 84.75 84.50 D(链霉素) 400 89.50 90.75 NH4+-N A(空白) 30 99.17 99.23 B(螺旋霉素) 30 97.40 98.30 C(土霉素) 30 97.40 94.93 D(链霉素) 30 98.23 83.47

表 3 各反应器COD和NH4+-N去除率 Table 3 COD and NH4+-N removal performance of different reactors

利用Eikelboom及Jenkins法对种污泥、连续处理过程中生物膜及悬浮污泥中的丝状菌进行了系统镜检观察，结果如图 1，表 4，表 5所示. 镜检结果显示，活性污泥中主要优势丝状菌均为骨架丝状菌Type 0041和Type 0092，丰度均为0~1级，污泥性状良好. 随着反应器的长期运行及进水抗生素浓度的变化，4个反应器中生物膜、悬浮污泥性状及其丝状菌种群均发生了显著变化.

图 1

Fig. 1

图 1 丝状菌丰度变化(100×) Fig. 1 Changes in abundance of filamentous bacteria

表 4(Table 4)

表 4 生物膜各阶段污泥性状 Table 4 Sludge characteristics of biofilm at different stages 项目 A(空白) B(螺旋霉素) C(土霉素) D(链霉素) Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅰ期 Ⅱ期 丰度 4 4 4 2 1 1 4 3 丝状菌对絮体影响 无 无 小 无 无 无 打开絮体 无 絮体性状 略牢固 略牢固 略牢固 略牢固 牢固 牢固 松散 略牢固 粒径/μm ≥150 ≥200 100～200 ≥200 50～150 ≥300 50～200 ≥200

表 4 生物膜各阶段污泥性状 Table 4 Sludge characteristics of biofilm at different stages

表 5(Table 5)

表 5 各反应器内悬浮污泥性状 Table 5 Characteristics of suspended sludge in different react 项目 接种泥 A(空白) B(螺旋霉素) C(土霉素) D(链霉素) Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅰ期 Ⅱ期 丰度 1 5 4 5 3 1 1 5 3 丝状菌对絮体影响 无 打开絮体 打开絮体 打开絮体 小 无 无 打开絮体 小 絮体性状 牢固 松散 松散 松散 略牢固 牢固 牢固 松散 略牢固 粒径/μm ≥100 ≥150 ≥200 ≤150 100～200 50～150 100～300 100～200 100~300

表 5 各反应器内悬浮污泥性状 Table 5 Characteristics of suspended sludge in different react

Ⅰ期反应器连续运行90 d，抗生素进水浓度稳定在5mg ·L^-1. 由于填料作用，与接种污泥性状相比，4个反应器生物膜上的污泥粒径增加明显，均保持在100~200 μm. 空白反应器A生物膜上丝状菌数量增加显著，丰度由种污泥时的0~1级升至3级； 同期B、D生物膜上丝状菌也显著增长，丰度达到3~4级； C反应器生物膜中丝状菌丰度变化不大，仅为1~2级. 与接种污泥相比，4个反应器除D中生物膜絮体产生松散现象外，其余各反应器生物膜污泥絮体结构均为牢固或略牢固，未受丝状菌丰度增加而产生明显变化. 同期4个反应器池内的悬浮颗粒物浓度有所增加，悬浮颗粒物粒径较小，显微镜下悬浮颗粒物上丝状菌丰度与生物膜上较为一致. 与种污泥相比，除C中悬浮污泥絮体结构没有发生太大变化外，其余反应器悬浮污泥絮体结构均变为松散.

Ⅱ期反应器连续运行180 d，抗生素进水浓度稳定在25mg ·L^-1.与Ⅰ期相比，空白反应器A生物膜污泥性状及丝状菌丰度无明显变化； B、D反应器中生物膜上丝状菌丰度与低浓度期相比显著减少，丰度降至2级； C反应器生物膜中丝状菌丰度保持1~2级不变. 与空白反应器A相比，B、C、D反应器生物膜污泥性状发生明显变化，污泥粒径显著增加，均大于200 μm. 同时，A、B、C生物膜絮体结构继续保持牢固状态，而D中絮体结构也转为牢固. 同期4个反应器池内悬浮颗粒物粒径增加，丝状菌丰度与生物膜上较为一致. 除A反应器因未投加抗生素絮体结构保持松散外，B、D均由Ⅰ期时的松散转为牢固. 2.3 各反应器内优势丝状菌的种类及其丰度变化

根据Eikelboom法镜检观测并结合FISH定性技术，对接种污泥及4个反应器内不同阶段的优势丝状菌进行了定性分析，其定性鉴定如图 2 所示，丰度变化如图 3所示.

图 2

Fig. 2

(a)相差1 000×下的ThiothrixⅡ、N.limicolaⅡ、Sphaerotilus natans； (b)奈瑟氏染色1 000×下的ThiothrixⅡ、N.limicolaⅡ、Sphaerotilus natans； (c)为FISH1 000×下的ThiothrixⅡ(GAM42a，5′-cy3)、N. limicolaⅡ(ALF968，5′-cy3)、Sphaerotilus natans(BET42a，5′-cy3) 图 2 反应器内优势丝状菌的鉴定 Fig. 2 Identification of dominant filamentous bacteria in reactors

图 3

Fig. 3

图 3 各反应器内生物膜丝状菌丰度 Fig. 3 Abundance of filamentous bacteria in biofilms of different reactors

从图 3 和图 4可以看出，种污泥中的优势丝状菌为Type 0041、N.limicolaⅡ及Type 021N，多样性较高且丰度较低(均为1级)，是丝状菌整体丰度的主要贡献者. A反应器未投加抗生素，其生物膜中的丝状菌在Ⅰ期时演替为N.limicola Ⅱ和Thiothrix Ⅱ，并将优势保持至Ⅱ期； 优势丝状菌的丰度也从种污泥时的未到1级分别迅速增至Ⅰ期时的4级与3级，并在Ⅱ期保持. 文献^[22]报道高浓度快速生物降解COD存在情况下易引起N.limicolaⅡ及ThiothrixⅡ的快速生长，而N缺乏的条件更适宜ThiothrixⅡ的生长. 反应器的进水为人工配水，且含有较高的可溶性COD(可溶性淀粉及葡萄糖占总进水体积比为1 ∶4)，C/N比为13.3/1，这是造成这两类丝状菌占据优势而并使之取代原有骨架丝状菌成丝状菌整体丰度主要贡献者的原因. A反应器悬浮污泥中Ⅰ期与Ⅱ期的主要优势丝状菌为ThiothrixⅡ，丰度为5级，这主要是相比于生物膜，悬浮污泥与进水有更好的传质接触，从而造成丝状菌更好地优势生长.

图 4

Fig. 4

图 4 各反应器内悬浮污泥丝状菌丰度 Fig. 4 Abundance of filamentous bacteria in suspended sludge of different reactors

B、C、D反应器生物膜及悬浮污泥上的优势丝状菌则受到抗生素种类及浓度的影响，演替趋势和丰度变化规律各不相同. B、D反应器生物膜上优势丝状菌尽管也为N.limicolaⅡ及ThiothrixⅡ，但在Ⅰ期时丰度仅增至3级，明显低于A反应器. 当进水抗生素浓度提高时，B中优势丝状菌在Ⅱ期中的丰度则均降至2级； 而D中N. limicolaⅡ的丰度下降更为明显，为1级，ThiothrixⅡ的丰度降至2级. B、D反应器悬浮污泥中优势丝状菌的种类及丰度均与A反应器相同，Ⅰ期为ThiothrixⅡ，丰度5级，而在Ⅱ期中的丰度则分别下降至3级与2级，与各自生物膜上的丰度变化趋势相同. C反应器生物膜上的优势丝状菌尽管在Ⅰ期和Ⅱ期均为N.limicola Ⅱ，但丰度很低，均仅为1级； 悬浮污泥中优势丝状菌Ⅰ期为N.limicolaⅡ及ThiothrixⅡ，丰度为1级； 而Ⅱ期时仅剩ThiothrixⅡ，丰度也维持在1级的较低水平. B反应器投加抗生素为螺旋霉素，是一种窄谱抑菌抗生素，对革兰阳性球菌、杆菌及少数革兰阴性球菌等细菌的生长有抑制作用. 尽管进水的组成成分有利于N.limicolaⅡ及ThiothrixⅡ的生长，与A反应器相比，两类优势革兰氏阴性丝状菌的生长均受到抗生素的明显抑制，且抑制作用随着抗生素浓度升高而更为显著； 同时螺旋霉素对N.limicola Ⅱ抑制较ThiothrixⅡ更为显著. D反应器投加广谱杀菌抗生素链霉素，其对优势革兰氏阴性丝状菌及丰度抑制过程与B反应器较为类似. C反应器中投加广谱抑菌抗生素土霉素，该类抗生素对革兰氏阳性及阴性菌均有抑制作用. 在本实验中，无论Ⅰ期的低浓度还是Ⅱ期的高浓度，土霉素对生物膜上及池内悬浮丝状菌均产生了较强的抑制作用.

因此，当存在高浓度易生物降解的有机物且进水C/N比较高的情况下，N.limicolaⅡ和Thiothrix Ⅱ菌快速生长，同时造成生物膜反应器内悬浮颗粒浓度增加，且悬浮颗粒粒径较小. 随着抗生素的进入，尽管其进水浓度均超过螺旋霉素、土霉素和链霉素对敏感菌的最低抑制浓度(螺旋霉素为1 mg ·L^{-1[23]，土霉素为250 μg ·L-1[24],链霉素为190 μg ·L-1[25])，但对两类优势丝状菌的抑制作用效果并不相同，土霉素抑制效果最为明显，而链霉素强于螺旋霉素； 抗生素对丝状菌的抑制作用均随浓度升高而升高. 同时比较A与其余3个反应器中悬浮污泥性状，投加抗生素的污泥紧固程度明显要高于未投加抗生素的污泥. 值得注意的是，本实验采用生物膜反应器，其水力停留时间(HRT)及污泥停留时间(SRT)均较长，工艺条件适合硝化细菌的生长，出水NH₄+-N浓度的变化与丝状菌变化并未呈现出明显关联，可能是由抗生素投加所造成，且投加链霉素的反应器影响较为显著. 3 结论}

(1)不同抗生素种类胁迫下，反应器中丝状菌丰度发生了明显的变化，不同抗生素对丝状菌的抑制程度并不相同，土霉素对丝状菌的抑制程度最为明显.

(2)不同抗生素浓度胁迫下，螺旋霉素、土霉素、链霉素均对优势丝状菌N.limicolaⅡ 、ThiothrixⅡ 产生较强的抑制作用，且抑制作用随抗生素浓度升高而升高； 抗生素对其抑制作用顺序为：土霉素＞链霉素＞螺旋霉素.

(3)土霉素对丝状菌有较好的抑制作用，低浓度时(投加浓度为5mg ·L^-1)，丝状菌丰度为1级，且对出水水质无较大影响

(4)抗生素对丝状菌的抑制作用机制仍需后续深入的研究，且会对目前一些实际问题，如丝状菌形成的膜污染控制提供帮助.