2015, Vol. 36
目前，氮污染是水体中最常见的一类污染，是导致水体富营养化主要因素之一，脱氮是改善水环境质量和控制水环境污染的重要研究内容[1, 2]. 针对无锡市滨湖区蠡河氮污染问题，本研究从蠡河底泥中富集培养反硝化复合菌群，利用固定化后的土著反硝化复合菌群修复蠡河水体是具有优势的[3, 4, 5]，这为蠡河生态修复提供了技术和理论支持.
近年来，国内外学者进行了一些关于反硝化细菌分离和富集的研究，王兆阳等[6]以传统的微生物分离方法从垃圾渗滤液活性污泥中分离到1株好氧反硝化细菌； Kampman等[7]从生活污水活性污泥中富集出了能代谢甲烷的反硝化细菌； 王弘宇等[8]从武汉市东湖深层底泥中分离出1株铁基质自养反硝化细菌. 但这些研究多是从活性污泥中分离富集反硝化细菌，而且多为纯菌培养，而关于从天然水体中富集反硝化复合菌群的研究很少.
本研究的目的是从蠡河底泥中富集反硝化复合菌群，探讨其脱氮效率，分析中间产物NO2--N和NH4+-N浓度动态变化，以及释放气体的体积、速率和成分. 通过构建16S rDNA克隆文库研究得到反硝化复合菌群的菌落构成.
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 底泥底泥样品采集于无锡市滨湖区蠡河中游处(31°31.605′N,120°19.853′E).
1.1.2 富集培养基及克隆文库实验材料反硝化细菌培养基[9]：KNO3 2.0 g ·L-1，柠檬酸钾钠11.4 g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.2 g ·L-1，KH2PO4 1 g ·L-1，微量元素溶液2 mL，去离子水1 L，pH 7.0~7.5. 微量元素：EDTA ·2Na 57.1g ·L-1，ZnSO4 ·7H2O 3.9 g ·L-1，CaCl2 ·2H2O 7 g ·L-1，MnCl2 ·4H2O 5.1 g ·L-1，FeSO4 ·7H2O 5.0 g ·L-1，(NH4)6Mo7O24 ·4H2O 1.1 g ·L-1，CuSO4 ·5H2O 1.6 g ·L-1，CoC12 ·6H2O 1.6 g ·L-1(药品均为国药分析纯)，pH 6.0.
克隆文库实验材料：Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)，Dream Taq-TM DNA Polymerase(MBI)，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)，DNA Ladder Mix maker(上海生工)，通用引物[10]7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)(上海生工)，pMD18-t Vector连接试剂盒(Takara)，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)等.
1.1.3 实验仪器图 1为反硝化复合菌群厌氧富集反应装置，由厌氧富集反应器和气体收集器两部分组成. 厌氧富集培养反应器中有温度计和搅拌子，反应器下部侧壁设有采样口. 3310数字式pH计(WTW，德国)，2720 thermal cycler PCR仪(Applied Biosystems，美国)，3730XL测序仪(Applied Biosystems，美国)，DYCP-31DN DNA电泳槽(北京六一仪器厂，中国)，FR980凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司，中国)，TH2-C 恒温摇床(太仓市科教器材厂，中国)，DHP-9162恒温培养箱(太仓市实验设备厂，中国)，HC-2518R 冷冻高速离心机(BBI，美国)，GC-2014气相色谱仪(岛津，日本).
 | 1.厌氧富集培养反应器； 2.恒温磁力搅拌器； 3.水浴槽； 4.气体 收集器；5.便携式pH计； 6.温度计； 7.取样口； 8.磁力搅拌子 图 1 反硝化复合菌群富集厌氧反应装置示意 Fig. 1 Enrichment reactor of a denitrifiying bacteria consortium |
表 1为指标的检测方法.
 | 表 1 检测方法1) Table 1 Methods for determination |
(1) 缺氧富集反硝化复合菌群4个阶段
反硝化复合菌群富集反应器中接种样品底泥，于恒温与定时搅拌下运行. 富集培养条件，温度30℃，pH 7.2±0.2，搅拌间隔6 h. 富集实验分4个阶段(阶段1至阶段4)，阶段1和阶段2富集培养时间是240 h，阶段3与阶段4富集时间为72 h. 当每个富集阶段结束时，离心培养液，去上清液，再将富集出沉淀反硝化复合菌群接种于装有新鲜培养液反应器中再次进行富集培养.在实验过程中，检测分析每个阶段NO2--N、NH4+-N积累和转化，及TN、NO3--N和COD浓度变化和去除率. 去除率公式(R)：
(2) 气体收集实验
反应器上部使用氩气充气以去除空气，计数与分析4个培养阶段气体释放体积与速率，按时间节点采集反应器释放气体，检测分析阶段4不同时段气体成分及所占浓度.
1.2.3 16S rDNA克隆文库构建为分析反硝化复合菌群菌群多样性，构建16S rDNA克隆文库.
(1) 反硝化复合菌群DNA提取
DNA提取于反硝化复合菌群富集培养阶段4，DNA抽提步骤按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提操作说明进行[12].
(2) PCR扩增
反硝化复合菌群细菌用引物7F和1540R扩增[13]. PCR反应体系如表 2所示.
| 表 2 PCR反应体系 Table 2 Reaction system of PCR |
PCR循环反应：94℃预变性9 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，72℃修复延伸10 min. 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果，150 V、100 mA和20 min电泳观察.
(3) PCR产物纯化回收
采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化[14].
(4) PCR产物链接
按pMD18-t Vector连接试剂盒操作说明进行链接.
(5) 16S rNDA基因序列系统发育分析
由上海生工生物有限公司完成测序反应，将测序后结果在GenBank中Blast进行比对. 利用软件MEAG6中邻位连接法(Neighbor-Joining)构建反硝化细菌和产甲烷菌系统发育树[15].
2 结果与讨论 2.1 富集培养4阶段 缺氧富集反硝化复合菌群实验分4个阶段,检测每个阶段TN、NO3--N和COD值变化及其去除率，同时分析中间产物NO2--N和NH4+-N浓度积累变化，如图 2所示.
 | 图 2 反硝化复合菌群富集实验TN、NO3--N、NO2--N、NH4+-N 和COD动态变化 Fig. 2 Dynamics of total nitrogen,nitrate,nitrite,ammonium,COD during the enrichment of the denitrifiying bacteria consortium |
反硝化复合菌群富集实验4个阶段TN起始浓度均在320~350 mg ·L-1之间. 图 2(a)说明，富集反硝化复合菌群在阶段1和阶段2时，216 h内，TN分别去除59.25 mg ·L-1和231.4 mg ·L-1，去除率为21.24%和73.23%； 当实验进行至阶段3和阶段4时，仅经过12 h，TN分别去除289 mg ·L-1和316.5 mg ·L-1，去除率达86.01%和90.9%. 这说明在阶段4时TN去除率达到最大值，阶段4得到最大活性反硝化复合菌群. 阶段3和阶段4在相同且最短时间内TN去除率接近，说明富集培养反硝化复合菌群在阶段4已近进入稳定时期，此时复合菌群活性最大，TN去除率稳定.
NO3--N是富集培养时添加唯一氮源，同时也是反硝化细菌生长代谢营养物质，检测分析NO3--N能更好地说明反硝化复合菌群富集培养效果. 如图 2(b)所示，NO3--N在阶段1和阶段2去除率均未达到最大值，但在阶段3和阶段4时，NO3--N去除率分别在12 h和9 h达到最大值，为99.01%和100%. 这进一步说明反硝化复合菌群富集实验在阶段4时进入稳定阶段. 这比Yao等[16] 在硝态氮起始浓度仅为70 mg ·L-1(阶段4 NO3--N起始浓度为297 mg ·L-1)下，富集培养且优化培养条件后得到的反硝化复合菌群，运行9 h的NO3--N 100%去除率脱氮效果要好. 同时，这也比李涵[17]筛选的2株好氧反硝化细菌ADB4A和ADB7培养4 d后NO3--N去除率均达95%以上的脱氮效果要好.
在反硝化过程中，中间产物积累很大程度上影响脱氮效果，跟踪中间产物形成与转化能更好解释与解决生物脱氮系统运行状况[18]，因此实验检测分析反硝化过程中NO2--N和NH4+-N的动态变化规律. 如图 2(c)所示,在富集实验阶段1，NO2--N和NH4+-N都是持续在积累，但积累量不大,分别为2.57 mg ·L-1和9.31 mg ·L-1； 但在阶段2后期，富集培养反应器内NO2--N和NH4+-N出现大量积累，最终积累量达28.25 mg ·L-1和22.15 mg ·L-1； 阶段3和阶段4中NO2--N和NH4+-N浓度变化趋势均在各时间点近似，积累量较阶段2明显减少，而且富集时间仅为72 h，阶段4中NO2--N和NH4+-N最终积累量分别为3.39 mg ·L-1和16.64 mg ·L-1，这与Yang等[19]获得纯种反硝化细菌Pseudomonas stutzeri D6优化培养后中间产物NO2--N和NH4+-N积累量接近，说明反硝化复合菌群富集实验获得很好效果[20]. 阶段2、阶段3和阶段4 NO2--N浓度发生明显起伏，阶段3和阶段4 NO2--N最大积累浓度发生在富集反应3 h，浓度分别达36.24 mg ·L-1和29.77 mg ·L-1，在随后富集实验中又开始下降. 这可能是因为在富集反应实验各个阶段后期，反硝化细菌可利用营养物质浓度减少，积累后NO2--N再次被其利用代谢.
碳源是异养反硝化细菌生长代谢利用营养物质，是异养反硝化细菌实现脱氮过程中电子转移系统电子供体[21, 22, 23]. 有报道指出，反硝化细菌对柠檬酸钠利用效果最好，能实现最大脱氮率和最少中间产物积累[24]. 因此，实验采用柠檬酸钠作为唯一碳源供给. 如图 2(d)所示，阶段1与阶段2 COD去除率低，阶段2去除率仅为57.5%，然而在阶段4 COD去除率达到85%，这也比阶段3 COD的去除率要高.
2.2 反硝化过程中气体释放反硝化复合菌群在富集培养中释放气体，释放体积和速率在不同富集阶段存在差异，而且同一阶段不同时间释放不同气体成分比例也存在差异. 本研究分析了反硝化复合菌群在富集培养中气体释放体积和释放速率.
图 3(a)为反硝化复合菌群培养4个阶段气体释放总量变化. 阶段1总量为28 mL，阶段2总量为190 mL，阶段1和阶段2气体释放最大速率分别为0.13 mL ·h-1和1.75 mL ·h-1，最大速率分别出现在第144~168 h和第72~96 h内，如图 3(c)所示. 这说明阶段2富集培养效果优于阶段1. 阶段4气体释放总量比阶段3高，达到最大的260 mL，但阶段3在0~3 h培养时间内，气体释放速率最高，即12 mL ·h-1，这比阶段4在3~6 h内的最大气体释放速率9.3 mL ·h-1出现的早且速率高，如图 3(d)所示，出现这种现象的原因可能是初始NO3--N浓度不同，也可能是阶段4的实验结果较阶段3存在波动性.
 | 图 3 反硝化复合菌群富集培养中气体释放总量气体成分和气体释放速率 Fig. 3 Total volume,composition,rate of gas releasing during the enrichment process of the denitrifiying bacteria consortium |
富集实验阶段4在不同培养时间内气体释放总量不同，气体成分也不同. 通过分析图 3(b)可知，气体主要在0~24 h内释放，约占气体总量86%. 通过分析阶段4释放气体成分，得到了气体主要是由N2、CH4、CO2和未知气体组成，其中N2是整个富集培养阶段主要产物，然而随着培养时间增加，CH4和CO2释放比例逐渐增加，这说明富集培养过程中有产甲烷菌的出现，以及好氧呼吸发生. 其中未知气体可能是准备实验阶段充气-氩气和少量残余空气中氧气组成.
2.3 16S rDNA克隆文库构建实验获得反硝化细菌34个克隆(8 OTUs)和产甲烷菌4个克隆(2 OTUs)，产甲烷菌克隆的获得解释了在富集阶段3释放气体中甲烷出现的现象. 表 3为富集反硝化复合菌群与产甲烷复合菌群16S rDNA克隆文库. 反硝化复合菌群细菌分别属Rhodocyclaceae科和Pseudomonadaceae科，属于Proteobacteria门. 产甲烷菌复合菌群属Spirochaetaceae科和Porphyromonadaceae科,分别属于Spirochaetes门和Bacteroidetes门. 以上各种细菌类群的脱氮和产甲烷能力均有研究报道[25, 26, 27, 28]. 图 4为富集培养蠡河底泥中反硝化复合菌群和产甲烷菌群系统发育树.
| 表 3 反硝化复合菌群与产甲烷复合菌群16S rDNA克隆文库 Table 3 16S rDNA clone library of the denitrifiying bacteria and methanogens consortium |
 | 图 4 富集培养蠡河底泥中反硝化细菌和产甲烷菌系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of denitrifiers and methanogens enriched from Lihe River's sendiment |
如表 3所示，DN-1反硝化细菌克隆数为3个，占38个总阳性克隆数(总克隆数为50)的比例是7.9%，DN-2和DN-6有克隆数为4，各占总阳性克隆比例均为10.5%，DN-3克隆数为5个，所占比例为13.2%，DN-4和DN-5分别有8个和6个克隆，分别占21%和15.8%的比例，为复合菌群中的优势类群. ME-1和ME-2是产甲烷菌均有2个克隆，各占阳性克隆比例均为5.3%. Pseudomonadaceae科为富集培养反硝化复合菌群优势菌群，OUT丰度为57.8%，Rhodocyclaceae科OUT丰度为31.6%，Spirochaetaceae科和Porphyromonadaceae科OTU丰度各为5.3%.
3 结论(1)通过分析反硝化复合菌群富集培养4个阶段的脱氮效果，结果表明阶段4脱氮效果最好，反应9 h后，TN去除率达90.9%，NO3--N去除率达100%，中间产物NO2--N和NH4+-N积累量最少，分别为3.39 mg ·L-1和16.64 mg ·L-1，反硝化复合菌群活性最大，脱氮效果最好.
(2)反硝化复合菌群富集培养在阶段4出现最大气体释放体积，为260 mL. 然而在富集培养阶段3的0~3 h内，出现最大释放气体速率为12 mL ·h-1. 阶段4释放气体主要成分是N2，同时还有少量的CH4和CO2等.
(3)通过构建16S rDNA克隆文库分析，富集培养的反硝化复合菌群细菌分Pseudomonadaceae科和Rhodocyclaceae科，OTUs丰度分别为57.8%和31.6%.
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