传统的生物脱氮工艺即自养硝化-厌氧反硝化工艺，存在基建费用高、 水力停留时间长、 能耗大、 抗冲击能力弱等不足. 近年越来越多的异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HN-AD)菌被发现，主要包括泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)^[1]、 产碱菌属(Alcaligenes)^[2]、 假单胞菌属(Pseudomonas)^[3]、 芽孢杆菌(Bacillus)^[4]、 不动杆菌(Acinetobacter)^[5]等. 这些细菌因具有生长快、 活性高、 增殖底物广泛、 能同时进行异养硝化和好氧反硝化等优势而具有显著的工程应用价值. Joo等^[6]将Alcaligenes faecalis strain No. 4应用于养猪场废水处理，在高有机和高氨负荷下取得了良好的碳氮去除效果； Yao等^[7]通过向实验室人工配水SBR反应器中投加耐寒HN-AD菌，显著改善了低温时氮的去除. 但是国内外对HN-AD菌的研究尚处于起步阶段，因此筛选出更多可同步脱氮除碳的HN-AD菌并对其生物学特性进行深入研究，对丰富生物脱氮理论和指导工程实践具有重要意义.

本研究从实验室长期稳定运行的SBR反应器中筛得1株异养硝化菌株YL并对其进行了鉴定，同时对其脱氮特性进行了分析.

1 材料与方法 1.1 菌株的分离及鉴定

从稳定运行的SBR反应器(进水NH⁺₄-N 100 mg ·L^-1,COD 1200 mg ·L^-1)中取活性污泥样品10 mL充分悬浮于90 mL 0.9%的无菌生理盐水中，在异养硝化培养基上进行稀释涂布，于生化培养箱30℃下培养. 进行多次纯化分离，挑选出形成的单菌落进行异养硝化能力测试^[8]. 将筛选出的具有较高异养硝化特性的菌株悬浮在25%的甘油中，于-80℃保存.

观察菌株的菌落特征，个体形态和革兰氏染色结果. 菌株的DNA提取采用细菌基因组提取试剂盒(MO BIO,USA)，将提取菌株的DNA作为16S rDNA的扩增模板，采用德国Eppendorf银制梯度PCR仪(型号： 5345 000.579)进行扩增，反应引物为27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3′和1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′. 采用北京六一仪器厂生产的DYY-6D DYCP-31DN水平电泳系统琼脂糖凝胶电泳分离检测PCR产物，产物的测序由上海生工生物技术有限公司完成. 测序结果用BLAST程序和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较,然后应用MEGA 5.0软件构建该菌株系统发育树.

异养硝化培养基(g ·L^-1)： (NH₄)₂SO₄ 0.47，琥珀酸钠5.62，维氏盐溶液50 mL，C/N=10，pH=7.0.

羟胺培养基(g ·L^-1)： HONH₃Cl 0.25，琥珀酸钠 2.81，维氏盐溶液50 mL，pH=7.0.

亚硝氮培养基(g ·L^-1)： NaNO₂ 0.49，琥珀酸钠 5.62，维氏盐溶液50 mL，pH=7.0.

硝氮培养基(g ·L^-1)： KNO₃ 0.72，琥珀酸钠 5.62，维氏盐溶液50 mL，pH=7.0.

维氏盐溶液(g ·L^-1)： K₂HPO₄ 5.0，MgSO₄ ·7H₂O 2.5，NaCl 2.5，MnSO₄ ·4H₂O 0.05，FeSO₄ ·7H₂O 0.05.

分别研究碳源、 C/N、 pH、 温度和转速对氨氮去除效果的影响. 碳源包括葡萄糖、 乙酸钠、 蔗糖、 柠檬酸钠和琥珀酸钠； C/N分别为2、 5、 10和15； pH分别为4、 5、 6、 7、 8、 9、 10和11； 温度分别为10、 20、 30和37℃； 摇床转速分别为80、 120、 160和200 r ·min^-1； 其中氨氮浓度均为100 mg ·L^-1. 固定单一影响因子，其余条件分别为温度30℃、 pH=7.0、 C/N=10以及转速160 r ·min^-1. 将处于对数生长期的菌液(D600=1.000)以1%接种量接种于100 mL的不同培养基中，各培养基分装于250 mL锥形瓶中经高压灭菌. 摇床培养约24 h，测定D600、 氨氮和TOC浓度变化.

碳源为琥珀酸钠，氮源分别为氨氮、 羟胺、 亚硝酸盐和硝酸盐，培养基对应的浓度为： 氨氮100 mg ·L^-1、 羟胺50 mg ·L^-1、 亚硝氮和硝氮均为200 mg ·L^-1. 接种量为1%、 C/N=10、 30℃、 160 mg ·L^-1条件下培养48 h，定时测定其D600、 pH、 TOC以及氮浓度，判断菌株YL对4种氮源的利用情况.

为优化菌株YL好氧反硝化性能的条件，以硝酸盐为利用氮源，设计L¹⁶ (4⁴)正交试验，因素水平表见表 1. 将菌液以1%的接种量接种于装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，采用恒温摇床培养，取上清液测定硝氮浓度及总氮浓度.

表 1(Table 1)

表 1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment 因素 转速/r ·min-1 C/N 温度/℃ pH 水平1 80 5 15 6 水平2 120 10 20 7 水平3 160 15 30 8 水平4 200 20 37 9

表 1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

NH⁺₄-N、 NO^-₂-N、 NO^-₃-N和 TN浓度均采用标准方法测定^[9]； NH₂OH-N浓度采用间接分光光度法^[10]； 菌体生长吸光度(D600)采用吸光度法测定； TOC采用日本岛津TOC-LCPN分析仪测定； pH值采用雷磁DHS-3D pH计测定.

2 结果与讨论 2.1 菌株的鉴定

YL的菌落表面扁平湿润、 不透明，光泽度好. 菌落颜色为蓝绿色，表明在培养过程中菌株分泌了某种色素. 革兰氏染色为阴性，大小为0.5 μm×(1.0~1.5)μm. 电镜扫描照片见图 1.

图 1

Fig. 1

图 1 菌株YL的电镜扫描照片Fig. 1 Scanning electron micrograph of strain YL

经16S rDNA测序(序列号： KJ765709)BLAST同源性检索，发现YL与Pseudomonas aeruginosa(M34133)的相似性在99%以上，结合菌株的形态学特征，可以初步确定菌株为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomonas aeruginosa YL. 使用MEGA 5.0核酸分析软件将菌株YL与某些异养硝化细菌和其他假单胞菌属进行系统发育分析，得到YL的系统进化树(图 2)，进一步表明菌株YL为Pseudomonas aeruginosa.

图 2

Fig. 2

图 2 YL的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of strain YL

图 3(a)表明，当碳源是乙酸钠、 琥珀酸钠和柠檬酸钠时，24 h后氨氮去除率均达到90.0%以上，TOC去除率均达到80%以上，D600均在0.735以上. 其中利用琥珀酸钠时氨氮去除率为98.9%、 TOC去除率为90.8%，且D600达到最大1.382. 而碳源为葡萄糖和蔗糖时，氨氮去除率仅为26.3%和16.8%，TOC去除率仅为8.1%和8.9%. 可见菌株YL利用有机酸优于像葡萄糖和蔗糖这种常用糖类，这与姜磊等^[11]研究的菌株Pseudomonas sp. N6对乙酸钠和琥珀酸钠利用率高于对大分子有机物的利用一致. 所以琥珀酸钠可作为菌株YL的最佳碳源.

图 3

Fig. 3

图 3 不同反应条件对菌株YL异养硝化的影响Fig. 3 Effects of various reaction conditions on heterotrophic nitrification of strain YL

从图 3(b)可以看出，C/N=2和C/N=5时，D600分别为0.303和0.707，氨氮去除率仅为39.4%和67.6%，TOC几乎完全去除，说明碳源不足会使菌体的生长受到抑制，氨氮去除效果差. C/N为10和15时，氨氮去除率分别为98.9%和99.2%，TOC去除率分别为90.8%和90.1%，对应的D600分别为1.382和1.229. 菌体在较高C/N=15下生长快速，更快进入内源呼吸期，D600较C/N=10时有所下降. 所以适宜菌株YL生长及反应的C/N为10.

由图 3(c)可知，在弱碱环境(pH 7~9)下，菌株YL有着很好的氨氧化效果，对应D600值分别为1.382、 1.387和1.476，氨氮去除率分别高达98.9%、 98.3%和97.8%，TOC去除率分别为90.8%、 85.6%和80.3%. 在偏酸条件(pH=5)及碱性条件(pH=10)下，氨氮去除率降至85.5%和65.5%. 而在pH<5以及pH>10这种过酸过碱的环境下，菌株YL几乎不生长. 可见菌株YL耐受pH范围为5~10，最佳pH为7.0. 菌株YL适应的pH范围与王兆阳等^[12]研究的耐冷兼性嗜碱性菌株Pseudomonas sp. GL19 (pH 6~10)大致相同.

由图 3(d)可见，温度为10℃时，菌株YL几乎不生长. 随着温度升高，菌体生长量和氨氮去除率增加，30℃下氨氮去除率为98.9%，TOC去除率为90.8%，D600值为1.382. 但在37℃，D600明显降低，氨氮和TOC去除率也下降，这是因为随着温度升高，生物活性物质变性，细胞功能下降甚至死亡，从而影响反应效果^[13]. 可见菌株YL最适温度为30℃.

如图 3(e)所示，随着转速的增加，菌体的D600和氨氮去除率增加. 在转速为160 r ·min^-1和200 r ·min^-1时，氨氮都接近完全去除，去除率分别为98.9%和99.0%，TOC去除率分别为90.8%和90.2%. 但转速200 r ·min^-1下的D600相比略低，分别为1.382和1.362. 转速太低，溶解氧不足，反应效果差； 提高转速可以加快氧的传递，反应完全. 所以，转速在160~200 r ·min^-1之间，菌株生长、 氨氧化效果及TOC去除效果好.

分别以硫酸铵、 亚硝酸钠、 硝酸钾和盐酸羟胺作为单一氮源培养48 h，考察菌株YL对不同氮源的利用情况，结果见图 4.

图 4

Fig. 4

图 4 菌株YL对不同氮源的降解 Fig. 4 Biodegradation of nitrogen sources by strain YL

图 4(a)表明，氨氮和总氮在18 h去除率均达到100%. 反应24 h后D600值达到最大1.382，pH从7.0增至9.0. TOC随着氨氮的降解而显著下降，TOC去除率和TOC转化速率分别为90.8%和50.55 mg ·(L ·h)^-1 [45.95 mg ·(g ·h)^-1]. 反应过程中出现明显的羟胺转化，9 h时NH₂OH-N浓度达到最大，积累量为2.06 mg ·L^-1，此后逐渐降低. 反应20 h后氨氮浓度逐渐增加，说明此时菌群进入内源呼吸期，之前用于细胞合成的氮源分解为氨氮再次回到水中. 通过菌生长合成所去除的氨氮占总去除氨氮的50.2%. 菌株YL最大比生长速率为0.19 h^-1，而自养硝化细菌的比生长速率通常为0.008~0.045 h^-1[14]，可见菌株YL增殖速率较自养硝化细菌高出一个数量级； 最大氨氮降解速率在12~18 h时，为8.37 mg ·(L ·h)^-1 [7.61 mg ·(g ·h)^-1]，平均氨氧化速率为5.55 mg ·(L ·h)^-1 [5.05 mg ·(g ·h)^-1]，与自养硝化细菌的平均氨氧化速率7.0 mg ·(g ·h)^-1[14]相比在同一数量级. 另外，反应过程无亚硝氮积累且总氮去除完全，这不同于同等条件时菌株筛选所用SBR中的硝化污泥，即脱氮时出现明显亚硝氮积累(最高浓度为28.5 mg ·L^-1)，总氮去除率仅为56.4%. 故菌株YL可以用于处理高氨废水或作为生物添加的候选菌株.

由图 4(b)和4(c)可见，在初始亚硝氮浓度和硝氮浓度均为200 mg ·L^-1时，菌株YL均生长良好，内源氮和D600值同时在48 h时达到最大，pH由7.0分别上升至8.7和8.6，TOC去除率分别为80.3%和81.0%，说明YL能够利用亚硝酸盐和硝酸盐生长及代谢. 这与已报道的一些异养硝化菌一致，如Pseudomonas stutzeri F1^[15]、 P. mendocina TN-05^[16]、 P. stutzeri YZN-001^[17]等. 以亚硝酸盐为唯一氮源时，反应9 h内亚硝氮浓度没有明显变化，9 h后才显著下降，说明高浓度亚硝酸盐虽对微生物活性有抑制作用，但菌株YL对其有适应性. 最大比生长速率在24~30 h时，为0.09 h^-1. 最大亚硝氮降解速率在30~36 h，为6.46 mg ·(L ·h)^-1 [5.87 mg ·(g ·h)^-1],平均降解速率为3.86 mg ·(L ·h)^-1 [3.51 mg ·(g ·h)^-1]，与Klebsiella pneumoniae CF-S9^[18]、 Acinetobacter sp.TN-14^[19]等相当. 反应中有痕量氨氮和硝氮的产生，最终亚硝氮去除率及总氮去除率分别为92.7%和 91.9%. 相比于Bacillus sp.YX-6在亚硝氮浓度超过20 mg ·L^-1时反硝化活性便受到抑制^[20]，以及Acinetobacter sp. HA2在起始亚硝氮浓度为80 mg ·L^-1时的去除率仅为83.6%^[21]，菌株YL更能高效利用较高浓度的亚硝氮. 以硝酸盐为唯一氮源时，菌株YL最大比生长速率在18~24 h时，为0.10 h^-1. 最大硝氮降解速率在15~18 h时，为7.20 mg ·(L ·h)^-1 [6.55 mg ·(g ·h)^-1]. 平均降解速率为3.90 mg ·(L ·h)^-1 [3.55 mg ·(g ·h)^-1]，最终硝氮去除率为93.6%，对硝氮的去除率高于利用亚硝氮. 去除硝氮过程中亚硝氮逐渐累积，在48 h时积累量为59.9 mg ·L^-1，总氮去除率为63.4%. 说明硝氮只是快速地转化为亚硝氮，没有达到完全的氮去除，这是因为硝氮初始浓度高达200 mg ·L^-1，高浓度硝氮大量转化为亚硝氮、 而亚硝氮反硝化不及时所致.

在以羟胺为唯一氮源时，如图 4(d)，D600值在48 h可达到0.341，最大比生长速率在9~12 h时，为0.07 h^-1. 羟胺去除率达到94.8%，平均降解速率为1.0 mg ·(L ·h)^-1 [0.91 mg ·(g ·h)^-1]，TOC去除率为78.1%. pH从7.0增至8.3. 通过氮平衡分析，内源氮占消耗羟胺的45.2%，其余54.8%用于反硝化. 反应15 h内亚硝氮和硝氮浓度逐步增加，15 h后逐渐降低. 可见菌株YL能够利用羟胺生长，这与一些已报道的菌株不同，如Acinetobacter calcoaceticus HNR^[22]既不能利用亚硝酸盐、 硝酸盐，也不能利用羟胺生长； Thiosphaera pantotropha^[23]能利用亚硝酸盐和硝酸盐生长，却不能利用羟胺生长.

综上，菌株YL能够利用氨氮、 亚硝氮、 硝氮和羟胺这4种氮源，但以氨氮为增殖底物时菌株YL的最大比生长速率最快，其次分别为硝氮、 亚硝氮和羟胺.

对正交试验结果进行分析，见表 2. 在初始硝氮浓度为100 mg ·L^-1，培养1 d后，有9组条件下硝氮去除率达到50%以上，说明菌株YL环境适应性良好. 分别以硝氮去除率和总氮去除率为指标，通过极差分析法分析各因素对菌株YL好氧反硝化性能的影响顺序.

表 2(Table 2)

表 2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results 试验编号 转速/r ·min-1 C/N 温度/℃ pH 硝氮去除率/% 总氮去除率/% 1 80 5 15 6.0 12.6 9.1 2 80 20 30 9.0 66.4 50.5 3 80 15 20 8.0 57.6 40.3 4 80 10 37 7.0 59.2 42.8 5 120 10 20 6.0 47.4 43.9 6 120 20 15 8.0 33.9 29.6 7 120 15 37 9.0 51.5 44.6 8 120 5 30 7.0 56.1 49.3 9 160 15 30 6.0 67.7 58.8 10 160 10 15 9.0 64.9 59.7 11 160 5 37 8.0 32.3 27.9 12 160 20 20 7.0 65.7 54.7 13 200 20 37 6.0 54.7 48.3 14 200 15 15 7.0 64.6 58.3 15 200 5 20 9.0 52.3 47.8 16 200 10 30 8.0 87.3 67.8 K1 49.0 35.7 38.3 33.5 44.0 39.2 45.6 40.0 K2 47.2 41.9 64.7 53.6 55.8 46.7 61.4 51.3 K3 57.7 50.3 60.4 50.5 69.4 56.6 52.8 41.4 K4 64.7 55.6 55.2 45.8 49.4 40.9 58.8 50.7 极差R 17.5 19.9 26.4 20.0 25.4 17.4 15.8 11.3

表 2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

从表 2看出，以硝氮去除率为指标，各因素影响好氧反硝化性能的主次顺序为C/N>温度>转速>pH，以总氮去除率为指标，各因素影响的主次顺序为C/N>转速>温度>pH，说明好氧反硝化时YL对C/N的敏感度大. 另外，充足的碳源虽能保证好氧反硝化的有效进行，但C/N过高会使有机物嵌入酶结构而影响酶活性，从而抑制反应^[24]. 转速和温度影响次之，pH影响最小. 而且通过这两个指标分析推出的最优条件均为： C/N=10，T=30℃，r=200 r ·min^-1，pH=7.0.

为验证正交试验结果的有效性，在最优水平组合条件下对菌株YL进行硝氮降解试验，结果如图 5所示. 反应24 h内，硝氮浓度持续下降，D600值和pH持续增大，说明菌体生长处于增殖期，菌株生长良好. 24 h后进入内源呼吸期，D600值开始下降，出现少量氨氮累积. 最大硝氮降解速率在12~15 h时，为8.47 mg ·(L ·h)^-1 [7.70 mg ·(g ·h)^-1]，降解速率较之前有所提高. 反应48 h后，硝氮去除率达到94.6%，TOC去除率为83.6%，虽整个反应过程中亚硝氮逐渐积累，但总氮的去除率达到76.3%. 通过氮平衡计算得出，内源氮占去除硝氮的42.6%. 内源呼吸期时硝氮值稳定在5.4 mg ·L^-1左右，无明显降解现象，相比于HN-AD菌Rhodococuus pyridinivorans CPZ24只能将硝氮浓度由初始的50 mg ·L^-1降解到16.6 mg ·L^{-1 [25]，菌株YL对硝氮的利用更具优势.}

图 5

Fig. 5

图 5 优选条件下菌株YL的反硝化特性 Fig. 5 Denitrification characteristics of strain YL under the optimal condition

(2)菌株YL氨氧化最适宜的碳源是琥珀酸钠、 C/N为10、 pH为7.0、 温度为30℃，以及转速160~200 r ·min^-1. 此时氨氧化速率为5.05 mg ·(g ·h)^-1，TOC转化速率为45.95 mg ·(g ·h)^-1. 氨氮和TOC去除率分别为100%和90.8%.

(3)菌株YL不仅能去除氨氮，还能利用亚硝酸盐、 硝酸盐和羟胺生长代谢. 相比于其它氮源，以氨氮为增殖底物时菌株YL的增殖速率最大，且无亚硝氮和硝氮的积累.

(4)影响菌株YL好氧反硝化特性最主要的因素是C/N，优化条件为： C/N=10，T=30℃，r=200 r ·min^-1，pH=7.