2015, Vol. 36
2. 淮海工学院海洋学院, 连云港 222005;
3. 中国科学院北京生命科学研究院, 北京 100101;
4. 连云港恒隆水务有限公司, 连云港 222002
2. College of Marine Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;
3. Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
4. Lianyungang Henglong Water Co., Ltd., Lianyungang 222002, China
据估算地球上存在106~108种微生物，而且其中绝大多数无法通过常规方法获得纯培养[1]. 传统的宏基因组学研究策略，一般先采用PCR等方法扩增目的基因(譬如16S rRNA)片段，然后构建文库进行测序[2,3]. 然而，这种研究策略存在的问题是： 不存在针对所有生物类群(细菌、 古菌、 动物、 植物和真菌)的“通用引物”，因此，最优化的PCR也只能得到部分生物类群信息，从而造成群落信息的残缺. 近年来，高通量测序(high-throughput sequencing)技术得到快速发展，如Illumina、 454焦磷酸测序和SOLiD等[4, 5, 6]. 高通量测序技术是对传统测序的一次革命性改变，可以同时对几十万到几百万条(甚至更多)DNA(或RNA)分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next-generation sequencing)，足见其划时代的价值和影响，突出特点是测序通量高、 测序成本和时间显著下降. 新一代测序技术问世之后，在重要物种基因组解析、 模式物种重测序、 生物医学、 古基因组学和生物进化等领域得到广泛应用，为相关的学科领域带来革命性的影响. 最近，高通量测序作为新兴的方法被应用到研究不同生境的生物群落及其功能，如人的肠道[7, 8, 9, 10]、 海洋[11, 12, 13]、 土壤[14,15]和动物肠道[16, 17, 18]等.
百乐克(BIOLAK)处理工艺是一种生物脱氮除磷的多级活性污泥工艺. 百乐克工艺具有以下优点： 高效的生物脱氮除磷性能、 对污染物浓度变化的缓冲能力强、 工艺稳定性高，以及能源消耗、 人力成本、 空间需求和剩余污泥量较低(www.biolak.de/). 百乐克工艺基于多级A/O(Anoxic/Oxic，缺氧/好氧)工艺和非稳态理论，可以重复缺氧和好氧过程，从而有效提高了活性污泥的处理性能. 自1972年建立第一个工厂以来，目前在全球已经建立超过750座不同规模的污废水处理厂，服务人口的范围从最少仅有300人，到多达300万人. 在我国城市污废水处理中，百乐克工艺已得到成功推广，广泛应用于处理居民生活污水，以及石化、 制药、 造纸、 纺织和食品等各种行业的工业废水[19,20]. 然而，到目前为止，对于百乐克工艺的核心元件——活性污泥的生物组成及其功能尚鲜见报道. 本研究借助于新一代高通量测序技术，首次获得百乐克活性污泥中大规模的宏基因组数据，结合现有的其它活性污泥(包括美国和澳大利亚等地废水处理厂中采集的活性污泥)宏基因组的信息，进行比较宏基因组学研究，旨在系统探讨百乐克活性污泥这一典型的脱氮除磷生物反应器中生物的群落组成及其功能特征.
1 材料与方法 1.1 百乐克活性污泥样本采集
活性污泥样本采自江苏省连云港市经济技术开发区大浦工业区废水处理厂的曝气池(34.650 038°N，119.177 463°E). 本处理厂为外商(新加坡)独资企业(连云港恒隆水务有限公司)，总投资约2 000万美元，占地面积80 000 m2. 建设总规模日处理废水10万t，处理工艺采用的是百乐克污废水处理工艺，稳定运行数年. 主要处理生活污水和企业预处理后的工业废水，采集活性污泥样本当月的进、 出水水质均值为： 进水(COD=177 mg ·L-1，BOD5=58.5 mg ·L-1，SS=108 mg ·L-1，TN=32.8 mg ·L-1，NH+4-N=21.67 mg ·L-1，TP=4.12 mg ·L-1，pH=7.35)与出水(COD=58.7 mg ·L-1，BOD5=3.6 mg ·L-1，SS=13 mg ·L-1，TN=3.49 mg ·L-1，NH+4-N=1.72 mg ·L-1，TP=1.43 mg ·L-1，pH=7.2). 采集的新鲜污泥样本置于冰桶中保鲜，即刻运回实验室. 对悬浮物进行离心(15 min，12 000 r ·min-1)，收集备用.
1.2 宏基因组DNA的提取和Illumina高通量测序对获取的新鲜污泥样本，在24 h内进行DNA的提取. 采用QIAamp DNA试剂盒(Qiagen)，按照试剂盒说明书的要求，进行活性污泥宏基因组DNA的分离和纯化. 使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳(Bio-Rad)和Nano Drop分光光度计(Thermo)，对分离纯化后的DNA进行检测和评价.
将大约5 μg纯化后的宏基因组DNA，破碎回收，按照试剂盒说明书中的实验流程，利用Paired-end DNA Sample Prep Kit构建末端配对的DNA文库，其插入片段大小约为180 bp. 制备过程包括在补平的基因组DNA片段的反向平行链上引入两个独特的测序引物结合位点和接头序列，然后进行凝胶法大小选择和纯化，从而成功构建配对末端文库. 随后，按照Illumina公司提供的标准实验流程，通过HiSeq 2000高通量DNA测序平台(Illumina)进行测序. 利用自编的脚本程序，对高通量测序平台获得的原始序列进行筛查，进而获得四十多万条高质量的宏基因组DNA序列.
1.3 生物多样性和功能分析将获得的大规模的宏基因组数据，使用MEGAN 5[21]和 MG-RAST 宏基因组平台 (http：//metagenomics.anl.gov/)[22]进行分析. 首先将GenBank非冗余(nr)数据库下载到本地服务器，进行格式化后，利用自编的脚本程序，将新完成的宏基因组序列与非冗余数据库，进行批量的BLAST序列比对，将序列比对结果加载到MEGAN 5软件包中，进行数据分析，以统计各个生物类群的丰度. 通过MG-RAST宏基因组学研究平台，获得多个宏基因组数据集(包括美国和澳大利亚等地废水处理厂中采集的活性污泥宏基因组数据)[23]，进行比较宏基因组学分析. 在域(domain)、 门(phylum)、 属(genus)和种(species)等多个层级上，全面分析其生物的组成与数量.
同时，还利用MEGAN 5中SEED子系统分析宏基因组序列的基因功能[24]. 在第一层级，注释后的序列被分27个SEED子系统，揭示了宏基因组中生物功能的整体轮廓. 针对百乐克活性污泥在脱氮除磷，以及硫和化合物代谢方面具有优异性能，因此，采用MEGAN 5的二级SEED子系统，对参与氮、 磷、 硫和芳香化合物代谢的功能基因进一步分析. 此外，为了探讨百乐克活性污泥中，参与氮代谢的功能基因及代谢通路，使用MEGAN 5提取出与氮循环相关的基因序列，提交到GenBank非冗余数据库中，使用BLASTX进行序列比对，比对结果利用KEGG(Kyoto Encyclopedia for Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)[24]进行分析.
2 结果与讨论 2.1 百乐克活性污泥生物群落概述
共获得的428 588条高质量的宏基因组DNA序列，随后使用MEGAN5进行生物群落分析. 在百乐克活性污泥生态系统中共检测到47个门类、 872个属、 1 351个物种，这远远超出先前一些活性污泥中所报道的生物多样性[2,25]. 在4个生物域中(292 455条序列)，大多数序列归属于细菌域(289 933条序列，99.14%)，其余的序列被分配到真核域(1 055条序列，0.36%)、 古细菌域(1 019条序列，0.35%)和病毒(448条序列，0.15%)(图 1). 值得注意的是，宏基因组中存在大量的高质量序列(136 133条序列，占总数据量的31.76%)并未匹配到以上任何生物域中(图 1). 这些序列没有与任何生物类群匹配，意味着与当前生物信息数据库中任何已知生物的序列没有相关性或者与它们的亲缘关系非常远. 因此，百乐克活性污泥中蕴藏着惊人的生物多样性.
 | 图 1 百乐克(BIOLAK)活性污泥宏基因组中生物(门的层级)的组成与数量Fig. 1 Biological composition and abundance (phylum level) in the BIOLAK sludge metagenome |
美国和澳大利亚废水处理厂活性污泥宏基因组中共获得42个门[23]，除了古菌域的初古菌门Korarchaeota(在两个样本中分别检测到3条与4条序列)和真核域的眼虫门Euglenida(在两个样本中分别检测到3条与13条序列)外，其余40个门在本活性污泥宏基因组样本中均检测到. 同时，有7个类群在本活性污泥样本中检测获得，并未在美国和澳大利亚样本中报道. 包括： Ignavibacteriae(1859条序列)、 病毒Viruses(448条序列)、 Candidatus Saccharibacteria(227条序列)、 Cloacimonetes(40条序列)、 热脱硫杆菌门Thermodesulfobacteria(36条序列)、 嗜热丝菌门Caldiserica(9条序列)和Latescibacteria(6条序列). 其中，Ignavibacteriae在百乐克污泥宏基因组中为常见类群，在47个门类中排在第11位.
2.2 细菌域的生物组成与数量细菌域由33个不同门组成，包括变形菌门Proteobacteria、 拟杆菌门Bacteroidetes、 硝化螺旋菌门Nitrospirae、 浮霉菌门Planctomycetes、 绿弯菌门Chloroflexi、 放线菌门Actinobacteria、 芽单胞菌门Gemmatimonadetes、 酸杆菌门Acidobacteria、 疣微菌门Verrucomicrobia、 厚壁菌门Firmicutes、 蓝菌门Cyanobacteria、 Ignavibacteriae、 衣原体门Chlamydiae、 螺旋体门Spirochaetes、 异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus、 绿菌门Chlorobi、 Candidatus Saccharibacteria、 互养菌门Synergistetes、 海绵杆菌门Poribacteria、 产水菌门Aquificae、 热袍菌门Thermotogae、 黏胶球形菌门Lentisphaerae、 梭杆菌门Fusobacteria、 Cloacimonetes门、 热脱硫杆菌门Thermodesulfobacteria、 脱铁杆菌门Deferribacteres、 产金菌门Chrysiogenetes、 网团菌门Dictyoglomi、 纤维杆菌门Fibrobacteres、 迷踪菌门Elusimicrobia、 软壁菌门Tenericutes、 嗜热丝菌门Caldiserica和Latescibacteria(图 1). 其中，变形菌门是最丰富的门(181 316条序列，62.54%)，其次是拟杆菌门(32 728条序列，11.29%)、 硝化螺旋菌门(16 379条序列，5.65%)和浮霉菌门(13 886条序列，4.79%)，研究显示它们是百乐克活性污泥中的主要细菌类群，因此表明，这些菌群在生物降解过程中发挥着重要作用. 细菌域中其它一些丰富的门类包括： 绿弯菌门(2.80%)、 放线菌门(2.62%)、 芽单胞菌(2.48%)、 酸杆菌门(1.99%)、 疣微菌门(1.78%)和厚壁菌门(1.51%)(图 1).
本宏基因组中共检测得到748个细菌属，其中，硝化螺菌属Nitrospira(5.60%)为百乐克活性污泥宏基因组的第一大菌属. 实际上，硝化螺菌属是活性污泥氮循环过程中至关重要的菌群[26, 27, 28, 29, 30, 31]. 第二大菌属是芽单胞菌属Gemmatimonas(2.45%)，其是生物除磷过程中的重要菌属[32,33]. 随后是丝杆菌属Niastella(1.35%)、 堆囊菌属Sorangium(1.22%)和生丝微菌属Hyphomicrobium(1.05%)(图 2)，它们是丰度最高的5个菌属，在细菌域所占的比例均超过1%. 具有亚硝酸氧化功能的硝化螺菌属、 具有氨氧化功能的亚硝化单胞菌属Nitrosomonas和聚磷菌属Candidatus Accumulibacter为A2O(Anaerobic/Anoxic/Oxic，厌氧/缺氧/好氧)活性污泥中的常见菌属[2]，这些菌属也大量出现在BIOLAK活性污泥中(硝化螺菌属： 16 238条序列，亚硝化单胞菌属： 1 817条序列，聚磷菌属： 730条序列)(图 2). 在以前的研究中，参与反硝化作用的副球菌属Paracoccus和产碱杆菌属Alcaligenes并未检测到[2]. 然而，在本研究中副球菌属和产碱杆菌属均被检出(序列数分别为64和23). 另外，亚硝化螺菌属Nitrosospira是一个常见的氨氧化细菌[34, 35, 36]，在本宏基因组中检出164条序列，然而，在近期完成的活性污泥宏基因组中并未检测到[2].
 | 图 2 百乐克(BIOLAK)活性污泥宏基因组中最丰富的100个属Fig. 2 Top 100 most abundant genera in the BIOLAK sludge metagenome |
对于古菌域(1 019条序列)，在百乐克活性污泥宏基因组中检测到3个门、 39个属. 广古菌门Euryarchaeota是最丰富的门(916条序列，占比89.89%)，其次为奇古菌门Thaumarchaeota(52条序列，5.10%)和泉古菌门Crenarchaeota(51条序列，5.00%)(图 1). 此外，对于真核域(1 055序列)，共检测到10个门、 60个属. 其中，纤毛虫门Ciliophora是最大的门(257条序列)，其次是链形植物门Streptophyta(192条序列)和子囊菌门Ascomycota(111条序列).
在百乐克活性污泥宏基因组中，共检测到448条病毒序列，与先前报道的废水病毒组[37]类似，检测到的病毒也是以噬菌体为主. 大多数病毒属于有尾噬菌体目Caudovirales，分属于肌尾噬菌体科Myoviridae、 短尾噬菌体科Podoviridae和长尾噬菌体科Siphoviridae等科. 除了有尾噬菌体外，检测到的其它病毒类群包括： 拟菌病毒科Mimiviridae、 藻类去氧核糖核酸病毒科Phycodnaviridae和虹彩病毒科Iridoviridae等. 利用PCR扩增的方法，在先前常规的活性污泥宏基因组研究中均未检测到这些病毒[2]，这可能是PCR方法的局限性所致. 活性污泥中存在的噬菌体是维持生态系统平衡的重要组成，并可能会对废水处理效果以及受纳水体产生潜在影响，因此，活性污泥中的病毒类群值得今后深入研究.
2.4 百乐克活性污泥的功能分析利用MEGAN5中的SEED注释活性污泥中的功能基因(图 3)，在第一层级的27个子系统中，碳水化合物相关的功能基因最为丰富(26 865条基因序列，13.51%)，其次是毒力相关的基因(20549条基因序列，10.33%). 其它高丰度的子系统包括氨基酸及其衍生物(19 076条基因序列，9.59%)、 蛋白质代谢(16 629条基因序列，8.36%)、 呼吸(12 754条基因序列，6.41%)和DNA代谢(12 694条基因序列，6.38%)等(图 3). 这些与碳水化合物、 氨基酸和蛋白质代谢相关的功能基因，与活性污泥中各个生物类群的生长与存活密不可分. 参与磷、 硫和芳香化合物等代谢相关的功能基因是实现活性污泥高性能的保证[38](图 3)，同时，采用二级SEED子系统进一步分析参与磷、 硫和芳香化合物代谢的功能基因(图 4).
 | 图 3 百乐克(BIOLAK)活性污泥宏基因组SEED子系统(层级1)的数量Fig. 3 Abundance of SEED subsystems (Level 1) in the BIOLAK sludge metagenome |
 | 图 4 氮、 磷、 硫和芳香化合物代谢的SEED子系统(层级2)Fig. 4 Nitrogen,phosphorus,sulfur and aromatic compounds metabolism classification analysis based on Level 2 SEED subsystems |
美国和澳大利亚的废水处理厂采取的是EBPR(enhanced biological phosphorus removal，强化生物除磷)工艺，在两个强化生物除磷活性污泥中分别检测到1 115和388条序列，参与磷代谢功能基因的比例均为0.89%[23]. 本研究进出水的水质监测数据显示，TP的去除率为65.2%. 在此宏基因组中共检测到3 104条基因序列涉及磷代谢(占比1.56%)，高于美国和澳大利亚活性污泥宏基因组中磷代谢功能基因的比例. 在磷代谢SEED二级子系统中，参与磷酸盐代谢的功能基因数量最多，达到2 857个(71.69%)，其它还包括高亲和力磷酸盐转运和PHO调节子的控制(22.11%)、 烷基膦酸酯的利用(5.12%)和膦酸盐代谢(1.08%). 活性污泥中的微生物组成和数量决定了废水生物处理工艺中磷去除的性能. 先前研究表明聚磷菌属Candidatus Accumulibacter在活性污泥法的磷去除方面具有至关重要的作用，负责磷的累积和去除，目前该菌属仅包含一种聚磷菌Candidatus Accumulibacter phosphatis，而且并未得到纯培养[23]. 在目前的百乐克活性污泥中，聚磷菌的比例为0.66%(730条序列)(图 2)，这高于Kim等[2]A2O工艺活性污泥中聚磷菌的比例(0.1%~0.5%).
在百乐克活性污泥中，参与硫代谢功能基因的比例为1.29%(2572条基因序列)，与美国和澳大利亚活性污泥中硫代谢功能基因的比例(分别为1.19%和1.32%)相当. 在硫代谢SEED二级子系统中，参与有机硫同化的功能基因所占的比例最高，达到56.22%(1446条基因序列)，其次为硫氧还蛋白二硫键还原酶(16.45%)、 硫氧化(15.94%)、 硫酸盐还原相关的复合物(8.55%)、 半乳糖和硫脂代谢(2.84%).
进出水的水质监测数据显示，COD和BOD5的去除率分别为66.9%和93.8%. 在百乐克活性污泥中共检测到4 531条基因序列参与芳香化合物的代谢，比例达到2.28%，但在美国和澳大利亚活性污泥中只有1.44%和1.56%. 在芳香化合物代谢SEED二级子系统中，芳香族化合物分解代谢途径的外周相关的基因数量最多，达到2 004条(38.96%)，其次为芳香族中间体的代谢(30.46%)、 苯甲酸酯转运和降解(14.54%)和水杨酸和龙胆酸代谢(5.91%)等(图 4).
除了基于SEED的子系统对宏基因组序列进行功能分析外，同时还利用KEGG分析百乐克活性污泥宏基因组的功能分类及丰度(图 5). 共分为6个大类、 36个小类. 在6个大类中，与代谢相关的功能基因最多(114 582条功能基因序列，61.19%)，其次是环境信息处理(28 734条功能基因序列，15.35%)和遗传信息处理(28 347条功能基因序列，15.14%).
 | 图 5 基于KEGG(MEGAN)分析的功能分类及数量Fig. 5 Functional classification and abundance based on KEGG analysis in MEGAN |
进出水的水质监测数据显示，TN和NH+4-N的去除率分别达到89.4%和92.1%. 在百乐克活性污泥中，参与氮代谢的功能基因达到2.50%(4 968条序列)，比美国和澳大利亚废水处理厂活性污泥中氮代谢基因所占的比例要高(分别为1.94%和1.64%)(图 3). 在氮代谢的SEED二级子系统中，绝大部分基因序列均与氮循环的关键通路相关，如硝酸盐、 亚硝酸盐氨化过程脱硝，这是废水处理中去除复杂的含氮化合物最重要的过程之一. 氨同化和硝酸盐/亚硝酸盐氨化相关基因具有最高的基因数(分别为2 237和1 183条基因序列)，其次为反硝化(759条基因序列)、 固氮(230条基因序列)和异化亚硝酸盐还原酶(216条基因序列)，其它还有一氧化氮合成酶(188条基因序列)等，占得比例较少(图 4).
氮代谢包括4个过程，即硝化、 反硝化、 氨化和固氮，将与4个过程相关的序列映射到MEGAN的KEGG中. 在4个过程中，反硝化相关基因所占比重最高，达到80.81%(1 385条序列)，其次是氨化(219条序列，12.78%)、 硝化(75条序列，4.38%)和固氮(35条序列，2.04%)(图 6). 这一结果表明，反硝化过程相关的功能基因序列在这4个过程中占据优势地位，与以前的研究类似[39].
 | 图 6 百乐克(BIOLAK)活性污泥氮循环(硝化、 反硝化、 氨化和固氮)中关键酶的数量Fig. 6 Abundance of key enzymes in nitrogen cycle (nitrification,denitrification,ammonification,and nitrogen fixation) in the BIOLAK sludge metagenome |
在反硝化过程中，反硝化酶的编码基因，包括EC1.7.1.1和EC1.7.99.4酶，它们的序列数分别为25和718. 一氧化氮还原酶EC 1.7.99.7拥有361条基因序列. 氮氧化物还原酶(EC1.7.99.6)的编码基因序列(187条序列)具有较高的丰度，同时亚硝酸盐还原酶(NO-forming)(EC1.7.2.1)的编码基因有94条序列. 在氨化过程中，发现存在高丰度的氨化酶基因编码序列，包括亚硝酸盐还原酶(EC1.7.1.4、 EC1.7.2.2和EC1.7.7.1)，其基因序列数分别为109、 29和14. 羟胺还原酶(EC1.7.99.1)基因编码序列为67条. 在硝化过程中，氨单加氧酶(EC 1.13.12.-)和Hao(EC1.7.3.4)的编码基因，分别有49和26条基因序列. 在所有4个过程中，参与固氮(EC1.18.6.1)的编码Nif基因序列最少(35条). 以上结果表明，与氮代谢相关的基因广泛存在于百乐克活性污泥中(图 6)，为废水中氮的去除起到关键作用.
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)是微生物参与的全球氮循环的重要过程[40]. 细菌介导的这一过程在发现之初，引起科学界的极大轰动[41]. 通过厌氧氨氧化过程，亚硝酸盐和铵可以被直接转化成氮气，从而将废水中含有的氨氮去除. 执行厌氧氨氧化过程的细菌均属于浮霉菌门(Planctomycetes). 在所研究的百乐克污泥样本中，浮霉菌门中共确定13 886条序列，属于14个菌属. 其中，Planctomyces是最丰富菌属(2 330条序列，排名7)，其次是Gemmata(1 765条序列，排名13)、 Singulisphaera(1 336条序列，排名20)、 Pirellula(1 291条序列，排名21)、 Blastopirellula(618条序列，排名42)、 Phycisphaera(539条序列，排名43)、 Isosphaera(335条序列，排名60)和Rhodopirellula(263条序列，排名73)，浮霉菌门中上述所有8个属都位列最丰富的前100个属(图 2)，从而揭示厌氧氨氧化过程在百乐克活性污泥的氮代谢中起着非常重要的作用.
3 结论
连云港大浦工业区废水处理厂百乐克活性污泥中蕴藏着丰富的生物多样性，鉴定出47个门类、 872个属与1 351个物种. 细菌域中包括33个门，其中变形菌门是最丰富的门，其次是拟杆菌门、 硝化螺旋菌门和浮霉菌门. 在748个细菌属中，硝化螺菌属为第一大菌属. 其次是芽单胞菌属、 丝杆菌属、 堆囊菌属和生丝微菌属. 在古菌域，鉴定获得3个门、 39个属. 在真核域，鉴定出10个门、 60个属. 同时，检测到448条病毒序列，主要为噬菌体. 在此活性污泥中，参与氮、 磷和芳香化合物代谢功能基因的比例，均高于美国和澳大利亚两个活性污泥中相应功能基因的比例.
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