二氧化碳(CO₂)过量排放而引起的全球变暖是目前全球面临的重大环境问题. 生物固碳是CO₂吸收与资源化的重要手段.

生物固定CO₂主要依靠植物和自养微生物^[1]，但植物生长对环境要求较为严格，地球上有很多环境并不适合植物生长，此时，自养微生物固定CO₂的优势便显现出来了. 固碳微生物主要包括光合自养微生物^[2]和化能自养微生物. 目前很多研究利用藻类固定CO₂，但是藻类培养中需要光照，且不耐高浓度CO₂. 因此，探索无需光照的高效固碳微生物对于更广泛环境条件下的微生物固碳具有重要意义. 化能自养微生物主要通过氧化无机化合物获得能量，能量的有效获得对于自养微生物的固碳效率具有举足轻重的作用. 自养微生物能够利用的无机化合物主要有一些还原性化合物，包括H₂、 H₂S、 S以及含S₂O^2-₃、 NH⁺₄、 NO^2-、 Fe²⁺的化合物等^[3]. 其中H₂是最好的能源物质(自由能最大).

至今已发现的微生物固定CO₂途径有6条，即卡尔文循环、 还原柠檬酸循环、 还原乙酰-CoA途径、 羟基丙酸循环、 三羟基丙酸/四羟基丁酸酯循环以及二羧酸/四羟基丁酸酯循环^[4]. 其中，卡尔文循环是光能自养生物和化能自养生物固定CO₂的主要途径^[5,6]. 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)是卡尔文循环中碳同化的限速酶. 目前自然界存在的不同类型RubisCO已被鉴定出来，按照其结构、 催化性能和O₂的敏感性可分为Ⅰ~Ⅳ^[7]. 其中有关Ⅲ和Ⅳ的研究较少，大部分自养微生物主要以Ⅰ和Ⅱ型为主^[8]. 固碳功能基因cbbL和cbbM分别表达关键酶RubisCO的Ⅰ、 Ⅱ构型.

海洋是全球最大的碳库，溶解的无机碳储量约为37 400 Gt^[9]. 同时，海洋也是最大的微生物库，据估计，海洋微生物种类可能多达1 000万种. 迄今为止，人类发现的微生物大约有150万种，除了7.2万种存在于陆地外，其余都存在于海洋之中^[10]. 由于许多自养微生物都为古菌，而生物起源于海洋，因此从生物进化角度来看，海洋中可能含有丰富的自养微生物资源^[11]. 胡佳俊^[12]已从全球各大海域表层海水筛选富集出非光合固碳微生物菌群，并通过电子供体的优化，发现以H₂、 Na₂S₂O₃、 NaNO₂这3种还原性无机物作为电子供体能够较显著提高其固碳效率^[13]. 但是由于海水不同深度的自然环境差异很大，如温度、 压力、 溶解氧、 CO₂浓度等，因此不同深度的海水的微生物群落结构以及优势固碳菌(基因)可能不同，其固碳潜能以及对不同电子供体的响应也可能有异. 然而目前尚未有不同深度海洋非光合微生物固碳潜能以

及对不同电子供体响应的相关研究.

本文以2013国家自然科学基金南海西部开放航次(航次编号： NORC2013-07)从南海各海域不同深度所采集来的海水为研究对象，以H₂、 Na₂S₂O₃、 NaNO₂这3种还原性无机物作为电子供体，研究南海不同深度海水中非光合微生物在特定培养条件下的固碳能力及其对不同电子供体的响应，并将其定义为相应电子供体条件下的海水非光合微生物的固碳潜能. 通过分析不同深度海水样品中固碳途径关键酶基因的丰度以及海水理化因素，讨论了不同深度海洋微生物固碳潜能差异的可能原因，以期为今后在普通培养条件下从海洋中筛选和驯化得到更有效的非光合固碳微生物菌群提供理论指导.

1 材料与方法 1.1 采样区域概况及采样点分布

图 1为南海水域采样点分布，后期实验过程中将海水样品按地理位置区域混合，分为A、 B、 C、 D、 E、 F共6个区. 各区域采样深度见表 1. 用温深盐测量仪(SBE911PlusCTD)采集水样，并现场获取深度、 温度、 压强、 盐度相关理化数据，样品采集后以4℃保存带回实验室做后期实验.

图 1

Fig. 1

图 1 南海海域采样点分布及区域混合Fig. 1 Distribution of sampling sites and mixing areas in the South China Sea

由于200 m左右深度以内阳光可以透射，500 m以下的深度区域不可见光^[14]，故将每个区域的水样，按照表层(5 m深度)，次表层(25~200 m深度)，次深层(500~1 000 m深度)和深层(1 100~1 500 m深度)共4个深度梯度进行分类归纳. 各区域的表层样品为5 m深度采得的样品，次表层为25~200 m深度范围采得的样品，次深层为500~1 000 m深度范围采得的样品，深层为1 100~1 500 m深度范围采得的样品.

表 1(Table 1)

表 1 各区域采样海水深度1)Table 1 Sampling seawater depth of each area 深度/m 区域 A B C D E F 5 √ √ √ √ √ √ 25 √ √ — — — — 50 √ √ √ √ √ √ 75 √ √ — — — — 100 √ √ √ √ √ √ 150 √ √ √ — — — 200 √ √ √ √ √ √ 500 √ √ √ √ √ √ 700 √ — — — — — 800 — — √ — √ — 1 000 — √ √ √ √ √ 1 200 — — — — √ — 1 500 — — √ — √ √ 1) “√”表示相应的深度有样品，“—”表示没有样品

表 1 各区域采样海水深度1)Table 1 Sampling seawater depth of each area

将1.1节中采集自所有样点的样品按划分的地理位置区域及深度梯度等比例混合得到各区域4个不同深度的混合海水样品，每个样品设置为3个平行样，各按10%的比例转入装有90 mL海水基本培养基^[15]的血清瓶中，用硅胶塞密封. 以H₂为电子供体条件培养，按混合气比例H₂ ∶O₂ ∶CO₂为8.5 ∶0.5 ∶1的比例注入气体，用封口膜封口. 其余电子供体条件按2‰电子供体浓度^[12]加入培养基，按混合气比例空气 ∶CO₂为9 ∶1. 置于摇床避光振荡培养(28℃，120r ·min^-1)，4 d后重新充入混合气. 8 d为一个周期^[16]，8 d后测定培养液中有机碳含量.

由于海水微生物的不完全可培养性，常规培养不能完全反映原位条件下的非光合微生物的固碳能力，因此将等量海水在等体积量的培养体系中经过一定时间特定培养条件培养后固定CO₂的量，定义为固碳潜能，以此反映其相对固碳能力. 由于培养基中除了接种的海水并不存在有机碳源，所以在培养后总有机碳的增加量即为CO₂的固定量. 在分析中采用Shimadzu TOC-VCPH 有机碳分析仪 (Shimadzu Seisakusho Co. Ltd.,Kyoto,Japan)测定总有机碳含量(total organic carbon,TOC)，并以此为测量指标，衡量微生物的CO₂固定潜能. 测量时统计3个平行样的平均值及标准差，以此计算每个实验样品的固碳潜能.

将所有地理位置点采集的海水样品按1.1节中的4个深度梯度等比例混合得到各深度范围的总混合海水样品，取3 L该混合海水样品过0.22 μm微孔滤膜采集海水微生物.

用DNA提取试剂盒(UltraClean DNA Isolation Kit,MoBio USA)根据其使用说明书^[17]对过滤过海水的微孔滤膜提取总细菌DNA. 通过NanoDrop ND-2000(Thermo,USA)测定DNA样品的浓度和纯度，之后将样品在-20℃保藏以用于分析.

由于卡尔文循环是主要的固碳途径，本研究主要分析卡尔文循环的关键酶基因cbbL、 cbbM的丰度. 表达基因cbbL和cbbM用1.4节中提取的总DNA样品通过ABI 7500定量PCR仪(Life Technologies,USA)通过绝对定量的方法测定关键酶基因的数量. 基因cbbL的定量引物为K2F(5′-ACCAYCAAGCCSAAGCTSGG-3′)和V2F(5′-GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC-3′)^[18]，cbbM 定量引物为 cbbM-F(5′-TTCTGGCTGGGBGGHGAYTTYATY AARAAYGACGA-3′)和cbbM-R(5′-CCGTGRCCR GCVCGRTGGTARTG-3′)^[19].

定量分析步骤： 取2 μL 1.4节中提取得到的DNA样品混入18μL SYBR Premix Ex Taq^TM system (Takara,Japan). 循环条件如下： 95℃ 预变性3 min； 95℃延伸30 s，62℃(cbbL基因)/55℃(cbbM基因)退火60 s，进行40个循环； 72℃延伸10 min.

统计各区域不同深度海水样品3个平行样的固碳能力的平均值及标准差，将其作为各区域不同深度海水样品的固碳潜力. 将所有区域各深度梯度的固碳潜力值按深度梯度统计，除在深层梯度(1 100~1 500 m)只有3个区域的平均值外，其余梯度排除1个最大区域值和1个最小区域值后取剩余区域的平均值，统计标准差，进行南海水域非光合微生物不同电子供体条件的固碳潜力深度差异分析.

采用SPSS 13.0统计软件对所测数据进行单因素方差分析(ANOVA)，LSD多重比较(P为0.05或0.01)分析不同深度间指标的差异显著性.

2 结果与讨论 2.1 不同深度海洋非光合微生物的固碳潜力及其对不同电子供体的响应

对南海水域6个采样区域的水样分别按4个深度梯度混合，并以H₂、 Na₂S₂O₃、 NaNO₂分别作为电子供体，按照1. 2节的方法进行培养，经过一个培养周期测定净固碳量. 所得的结果见表 2. 在一个培养周期内，各区域及深度以NaNO₂为电子供体的响应值普遍较低，且没有显著差异，这可能是由于NaNO₂氧化时所产生的能量较低而且以其为电子供体的硝化菌世代时间长，生长缓慢，这与文献^{[12, 13]}结果相符，故不对该电子供体的响应情况进行进一步的分析. 将所有区域的结果按照深度梯度整合统计得到不同深度海洋微生物固碳潜力对H₂和Na₂S₂O₃的响应的关系，见图 2.

表 2(Table 2)

表 2 各区域海水非光合微生物固碳潜力对不同电子供体响应情况 Table 2 Response of potential carbon fixation capability of non-photosynthetic microbial community in each area seawater to different electron donors 培养条件 深度/m 固碳量/μg ·L-1 A区 B区 C区 D区 E区 F区 5 975.5±107.0 2 638.2±104.1 395.7±37.5 1 309.9±53.2 1 221.7±18.1 639.9±156.8 H2为电子供体 25~200 1 202.8±114.7 2 782.4±284.8 1 088.9±55.0 1 090.2±67.0 869.9±155.7 1 056.9±102.4 500~1 000 194.7±102.7 623.8±97.7 534.6±77.3 664.5±132.9 490.7±65.5 1 052.7±127.5 1 100~1 500 — — 412.4±25.6 — 458.9±37.5 440.6±40.5 5 1 163.3±41.5 1 148.9±252.4 959.6±235.0 2 143.35±169.8 594.6±158.5 114.1±36.5 Na2S2O3为电子供体 25~200 1 658.2±231.1 723.2±165.8 406.5±6.5 771.2±103.9 394.2±122.9 923.5±149.2 500~1 000 1 555.3±243.5 398.2±94.2 883.5±108.5 2 533.5±106.3 1 821.8±190.4 2 103.1±145.1 1 100~1 500 — — 1 035.7±213.7 — 1 976.2±256.9 1 576.6±106.8 5 519.5±78.6 458.4±65.3 367.8±45.6 434.8±54.7 345.6±69.3 420.8±42.3 NaNO2为电子供体 25~200 429.5±53.2 450±62.4 364.4±50.2 301.2±49.6 420.8±58.6 426.3±47.2 500~1 000 514.8±53.1 547±65.4 475.7±72.3 494.8±74.7 357.3±56.0 358.4±43.6 1 100~1 500 — — 472.1±50.7 — 359.5±61.1 330.7±42.6

表 2 各区域海水非光合微生物固碳潜力对不同电子供体响应情况Table 2 Response of potential carbon fixation capability of non-photosynthetic microbial community in each area seawater to different electron donors

图 2

Fig. 2

将表 2中所有区域的净固碳量按各深度梯度平均，除1 100~1 500 m深度梯度外，其余排除1个最低区域值和1个最高区域值，将余下的区域值统计平均值和标准差图 2 不同电子供体条件下海水非光合微生物固碳能力随深度变化Fig. 2 Variation of carbon fixation capability of non-photosynthetic microbial community in seawater with the depth under different cultivation conditions using H2/Na2S2O3 as electron donors

从图 2可知，以H₂为电子供体的培养条件下，200 m以内的表层海水的非光合微生物的固碳能力要显著高于500 m以下深层海水. 数据偏差分析表明，5 m深度的表层水的各区域的非光合微生物的固碳量差异要明显大于其他深度梯度各区域间的差异(标准差是其他深度区域2倍以上)，这可能是由于外部环境条件(光照，温度，生物)变化对表层水的理化性质和微生物结构的影响较显著，因此表层海水相较于其他深度海水微生物固碳量的区域差异性较大.

以Na₂S₂O₃为电子供体的培养条件下，500 m以下深层海水的非光合微生物的固碳能力要显著高于200 m以内表层海水，深层海水的非光合微生物固碳量是表层海水的1.5倍左右.

数据偏差分析表明，以Na₂S₂O₃为电子供体的培养条件下的各深度梯度的非光合微生物固碳潜力的区域差异性要明显大于以H₂为电子供体培养条件下的区域差异性(以Na₂S₂O₃为电子供体的标准差基本上是以H₂为电子供体的3倍以上). 说明南海水域能够利用以S₂O^2-₃为电子供体的化能自养菌丰度的区域间差异性要高于能以H₂为电子供体的化能自养菌的区间差异性.

从南海水域不同深度海洋微生物固碳潜力对H₂和Na₂S₂O₃两种电子供体的响应效果看，表层水以H₂为电子供体的响应效果要略好于以Na₂S₂O₃为电子供体的响应效果，而深层水以Na₂S₂O₃为电子供体的响应效果要明显好于以H₂为电子供体的响应效果，固碳潜力是后者的近3倍. 由于深层海水特殊的环境条件，大量的深海微生物多为嗜压、 嗜冷微生物，在常温、 常压下难以生存^[20]. 使得大量深海环境生存的细菌在采集以及后期实验室培养的过程中，由于环境条件较大的变化，已经失活或死亡. 所以如果在原位生长环境，深海区域能利用S₂O^2-₃为电子供体固碳的微生物数量可能远高于表层海水，其固碳能力可能更大.

固碳潜力的差异肯定与不同深度海洋中的优势固碳微生物数量有关，但是由于采集过程中环境条件的变化，一些深海微生物已失活或死亡，因此传统的培养方法难以确定不同海洋深度各种固碳微生物的数量. 固碳途径的关键酶基因的丰度可以间接反映固碳微生物的数量. 为了阐明不同深度海洋微生物固碳潜力差异的深层原因，进一步研究了2个关键的固碳酶基因随海水深度变化的丰度差异.

对南海水域采集的样品按照深度梯度混合，按照1.4和1.5节的方法测定不同深度梯度海水中cbbL、 cbbM基因的丰度，结果见图 3. 固碳基因cbbL的丰度，随着海水深度的增加逐渐递减，在5 m深度的表层水中，其数量显著高于其他的深度梯度(高于其他深度梯度数量1个数量级). 固碳基因cbbM的丰度随着海水深度增加逐渐递增，在500~1 000 m的深度范围内，基因含量达到最高值，而且深层水cbbM基因丰度都高于表层水的10倍以上，5 m深度表层水最低.

图 3

Fig. 3

图 3 海水主要固碳基因随深度变化差异Fig. 3 Differences of main CO2 fixation gene abundance in sea water with the change of the depth

由基因cbbL表达的RubisCO Ⅰ广泛存在于植物和一些原核生物中，其有4种类型： IA~ID^[21]，其中IA和IC多发现于变形菌门中，而变形菌门中有一部分菌属和N，H₂代谢有密切联系^[22]，IB 和ID在蓝藻和真核生物中占优势^{[21, 23, 24]}. 由基因cbbM表达的RubisCO Ⅱ广泛分布于厌氧的α-变形菌门以及硫杆菌的一些种中，它们大多和硫代谢有关^[25]. 南海不同深度非光合微生物的固碳潜力与两种主要固碳功能基因随海水深度上的分布趋势是大致相符的，即表层水的cbbL基因丰度以及以H₂为电子供体的固碳能力均高于深层水，同时，深层水的cbbM基因丰度以及以Na₂S₂O₃为电子供体的固碳能力均大于表层水. 因此表层水可能多以cbbL为固碳功能基因的光合微生物、 氢-氧化细菌为主，深层水可能多以cbbM为固碳功能基因的α-变形菌、 硫细菌为主，从而使得不同深度海洋非光合固碳微生物的固碳潜力对不同电子供体的响应有显著差异. 然而，从图 2 和图 3结果可见，次表层的cbbL显著低于表层，但以H₂为电子供体的固碳潜力却无显著差异(甚至略高于表层)，这可能是由于表层中大量的cbbL来源于光合细菌，因此在避光培养中未发挥出其固碳能力，导致无光条件下的固碳能力较低.

图 3中深层海水的cbbM固碳基因丰度明显高于表层水，比表层水高了1个数量级，而图 2中，以Na₂S₂O₃为电子供体的固碳量深层水仅是表层水的1.5倍左右. 而且次深层的cbbM丰度明显高于深层，但以Na₂S₂O₃为电子供体的固碳量却大致相当. 这进一步验证了2.1节中的推测，即深层海水的固碳微生物以能利用还原性硫为电子供体并以cbbM为固碳功能基因的硫细菌为主，但是由于特殊的环境条件，在常温、 常压环境中不能生存. 如果能进行原位培养，其固碳能力可能远高于表层海水.

海洋生态系统中，不同的深度海水在各种理化性质及环境条件等方面都存在着显著差异，对于微生物的生长以及菌群结构组成等造成显著影响，表 3为通过CTD对采样现场测定的环境理化数据按照深度区域整合做了统计，可以看出，深层水相比较于表层水，含盐量高，温度低，压强大. RubisCOⅠ多在好氧微生物中被发现，被认为是一种主要存在于光合生物和好氧化能自养微生物中的RubisCO酶^[26]，而Badger等^[27]通过生态学及对酶结构研究指出，RubisCOⅡ在低氧和高二氧化碳浓度下有较高活性，这与早期地球的大气环境极为相似，RubisCOⅡ可能是RubisCO的共同进化祖先.

表 3(Table 3)

表 3 海水各深度区域的物理化学性质特征1) Table 3 Physico-chemical properties of seawater within each range of depth 深度/m TDS/g ·L-1 温度/℃ 压强/kPa 5 24.0±0.2 29.49±0.09 50.1±1.4 25~200 25.9±0.5 21.17±0.11 1 100±800 500~1 000 29.8±0.4 8.88±0.07 8 000±2 000 1 100~1 500 29.1±0.2 4.64±0.06 12 000±1 800 1)TDS(总溶解性固体)，表示海水的含盐量

表 3 海水各深度区域的物理化学性质特征1)Table 3 Physico-chemical properties of seawater within each range of depth

Alfrider等^[28]和Videmek等^[29]的研究表明，高CO₂浓度的环境不利于cbbL为固碳基因的固碳细菌的生长，有利于以cbbM为固碳基因的细菌的生长.

因此可以推测，造成固碳基因cbbL、 cbbM随深度变化的丰度差异原因可能和溶解O₂含量、 溶解CO₂含量有关.

由于生物泵的作用,碳实现了从海洋表层向深层的转移^[30]，并且深层海水低温、 高压强等特殊的环境条件也有利于无机碳的储存. 因此底部的CO₂浓度远高于表层^[31]，但氧气浓度极低，因此有利于以cbbM为固碳基因的微生物的生长. 反之，表层海水含氧量高，CO₂浓度相对较低^[32]，从而有利于以cbbL为固碳基因的微生物的生长

另一方面，许多研究指出^{[33, 34, 35, 36]}，海洋深处可挥发性硫化物(AVS)的浓度较高，也有利于以cbbM为固碳基因的微生物的生长.

结合文献报道的有关cbbL、 cbbM固碳基因存在的微生物类群的生存条件及代谢类型，可以推测海洋中不同深度的O₂、 CO₂、 还原性硫化物的含量差异可能是造成海洋中不同深度优势固碳菌菌群结构差异，乃至主要固碳基因丰度和固碳潜力差异的重要原因.

3 结论

(1)南海水域不同深度海洋非光合固碳微生物对不同电子供体的响应有显著差异. 以H₂为电子供体时，表层海水中的非光合微生物的固碳潜力高于深层海水，反之以Na₂S₂O₃为电子供体时，深层海水微生物的固碳潜力高于表层海水.

(2)两种主要的固碳功能基因cbbL和cbbM丰度随海水深度变化而变化. 表层海水中cbbL基因丰度显著高于深层水，相反，深层海水中cbbM的基因丰度显著高于表层水，表明表层和深层海水中的非光合固碳微生物的优势种有较显著差异. 这可能是表层和深层海水中的非光合固碳微生物对不同电子供体响应有显著差异的重要原因.

(3)导致不同的影响因素很多且复杂. 海洋不同深度溶解O₂/CO₂和还原性硫化物浓度的差异可能是导致其优势非光合固碳微生物差异的重要原因. 深层海水的低O₂、 高CO₂和高还原性硫化物环境适合于以cbbM为固碳基因的微生物生长，反之表层海水的高O₂、 低CO₂和低还原性硫化物环境适合于以cbbL为固碳基因的微生物生长.