玉米作为我国重要的粮食作物，种植面积广，具有生长速率快，生物量大的特点，无论在安全土壤还是污染性土壤都能较好地生长. 目前，利用筛选重金属低积累作物在污染耕地上种植，以充分利用受污染耕地，同时保障粮食安全已成为当前研究的热点问题^[1]. 这一“边生产、 边修复”办法也适合我国国情，对于保证国家粮食安全具有重要意义.

据2014年4月环境保护部、 国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤污染超标率达16.1%，耕地点位超标率达19.4%，铅的点位超标率达1.5%^[2]. 铅污染已成为威胁人们生存环境与健康的主要原因之一^{[3, 4, 5, 6]}. 铅污染耕地直接危害到植物生长的环境如土壤微生物、 土壤酶活性^[7,8]等. 植物吸收大量的铅会抑制其光合作用、 呼吸作用^[9,10]，对叶绿体、 线粒体都有一定程度的破坏^[11]，同时影响植物的生长，导致作物产量、 质量下降^[12]. 因此，研究Pb胁迫下不同玉米品种的响应异同可为作物耐性初步筛选提供参考和依据.

玉米对Pb胁迫响应通常与金属Pb在植株体内的化学形态密切相关，探明这一问题对于解析玉米耐Pb机制具有十分重要的意义. 目前玉米低积累品种的筛选研究主要集中在吸收^[13]、 生理生化研究^[14]、 螯合剂诱导技术^[15]等方面. 玉米体内Pb积累是否与重金属形态变化有关，玉米如何通过改变体内重金属形态来应对外界胁迫，是亟待解决的科学问题. 有鉴于此，本研究通过砂培试验，分析了不同浓度Pb胁迫下玉米品种间根、 茎叶中Pb化学形态的变化，探讨玉米耐Pb机制，以期为玉米低积累品种筛选提供理论依据.

供试品种为： 郑单958、 漯玉336、 联创5号、 圣瑞568、 隆平206. 选择饱满均一玉米种子，播于装有洗净石英砂的花盆(长10 cm，宽10 cm，高12 cm，盆底有孔)中，每盆3颗. 萌发后，每天浇灌1/2 Hoagland营养液，3 d后用完全营养液进行浇灌，一心一叶时选取长势均一的幼苗，每盆定苗1株. 四叶期选用Pb(NO₃)₂作为Pb源进行胁迫处理，Pb的质量浓度分别为0(对照)、 100、 200、 400和800 mg ·L^-1，共5个处理水平，每个处理设置3次重复，每天浇灌胁迫营养液至盆底有大量营养液流出，每3 d用去离子水冲洗后再用Pb胁迫营养液浇灌，以防止盐分累积. 胁迫时间为4周.

叶绿素含量： 选取玉米最上部完全展开叶的中部，利用叶绿素仪(SPAD-502，日本)进行测定，重复3次，记录SPAD值读数.

根际活力： 称取新鲜根样品0.50 g，放入试管中，加入0.40%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液和0.067 mol ·L^-1 pH 7.0磷酸缓冲液各5 mL，将根充分浸没在溶液中，在37℃下暗处保温1 h，此后加入1 mol ·L^-1硫酸2 mL，以终止反应. 将根取出，吸干水分，与3~4 mL的乙酸乙酯和少量石英砂一起研磨，以提出三苯基甲腙(TTF). 把红色提出液(含TTF)移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL，分光光度计485 nm下比色，计算根际活力.

Pb化学形态： 分别称取新鲜玉米根和茎叶样品各2.00 g，剪碎，放置于100 mL离心管中，加37.50 mL提取剂，在30℃恒温箱中放置过夜(17~18 h)，次日回收提取液于250 mL烧杯中，再加入同体积提取剂，恒温箱中放置2 h后，将回收提取液并入烧杯中，24 h内连续提取4次. 提取液在电热板上蒸至近干，用硝酸-高氯酸混合酸(GR)消解至无色，定容后用原子吸收分光光度计(ZEEnit700，德国耶拿分析仪器股份公司)测定Pb质量分数. 分级提取顺序为： 80%乙醇、 去离子水、 1 mol ·L^-1NaCl、 2%(体积比)醋酸、 0.60 mol ·L^-1盐酸^[16]. 其中80%乙醇主要提取硝酸盐、 氯化物及氨基酸态Pb等； 去离子水提取水溶性的有机酸盐； 1 mol ·L^-1 NaCl主要提取果胶酸盐和与蛋白质呈结合态或吸着态的盐等； 2%醋酸主要提取Pb的磷酸盐等； 0.60 mol ·L^-1盐酸主要提取Pb的草酸盐等^[17]； 最后残渣部分可能以硅酸盐为主^[18,19].

试验数据利用Excel 2003、 DPS 7.05数据分析软件进行统计分析.

Pb胁迫下地上部生物量的变化，反映了植物对Pb的耐受性. 由图 1可知，在各浓度Pb胁迫下，郑单958地上部生物量明显高于其他品种. 从100~800 mg ·L^-1Pb胁迫，隆平206地上部鲜重减少量最低. 不同品种在不同浓度Pb胁迫下其地上部鲜重的变化不尽相同，随着Pb胁迫浓度的逐渐增加，郑单958、 漯玉336、 圣瑞568地上部鲜重呈现先增加后降低的趋势，而联创5号、 隆平206则逐渐降低. 100 mg ·L^-1 Pb胁迫下圣瑞568、 郑单958和漯玉336地上部鲜重较对照处理有小幅增加. Pb胁迫浓度增加到200 mg ·L^-1时所有品种地上部鲜重开始低于对照组，即200 mg ·L^-1Pb胁迫下玉米受到伤害，生物量开始减少，但仍与对照和100 mg ·L^-1Pb胁迫下差异不显著. 800 mg ·L^-1 Pb胁迫，地上部鲜重下降最为明显的为联创5号和圣瑞568，与对照处理相比分别下降28.53%和23.92%.

图 1

Fig. 1

不同字母表示它们之间达到显著性差异(P<0.05)，下同 图 1 Pb对玉米植株地上部鲜重的影响 Fig. 1 Effects of lead on shoot fresh weight of maize

根冠比是植物根部鲜重与地上部鲜重的比值. Pb胁迫下，根冠比可反映植物对Pb的耐受能力. 随Pb胁迫浓度的增加，各品种根冠比均逐渐增大，但增幅各异(图 2). 对照条件下郑单958的根冠比最低. 100 mg ·L^-1Pb胁迫，圣瑞568根冠比与对照相比略有减少. 800 mg ·L^-1Pb胁迫，联创5号和隆平206的根冠比增幅最大，相比于对照分别增加了26.37%和21.00%，郑单958根冠比增幅最少，仅增加了17.84%.

图 2

Fig. 2

图 2 Pb对玉米根冠比的影响 Fig. 2 Effects of lead on root-shoot ratio of maize

耐性指标指各处理根干重与对照组根干重的比值. 由图 3可知，随Pb胁迫浓度增加，各品种的耐性指标逐渐降低. 100 mg ·L^-1Pb胁迫下，郑单958、 漯玉336和圣瑞568的耐性指标均大于1，而隆平206的耐性指标略低于1，圣瑞568的耐性指标小于1. 郑单958的耐性指标最高，为1.17. 100 mg ·L^-1Pb胁迫时促进了郑单958、 漯玉336和圣瑞568的根系生长，这可能是作物在低浓度Pb胁迫下通过根系的生长，增加自身体积，以稀释体内重金属浓度，提高自身对Pb的耐受性. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下各个品种的根系干重均显著低于对照组，其生长均受到抑制. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下郑单958和漯玉336的耐性指标大于其它品种，说明在高浓度Pb处理下郑单958和漯玉336对Pb的耐受性要高于其它品种.

图 3

Fig. 3

图 3 Pb对玉米耐性指标的影响 Fig. 3 Effects of lead on index of tolerance of maize

SPAD值反映植物叶片叶绿素相对含量. 由图 4可知，随着Pb胁迫浓度的增加SPAD值呈现先增加后逐渐减少的趋势，说明在低浓度Pb胁迫下，刺激了植物的生长，而在高浓度时，Pb对植物生长产生毒害作用. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下，相比对照郑单958下降的最少，为4.30%，其次为漯玉336、 隆平206、 圣瑞568，下降百分比分别为7.02%、 8.38%和8.52%. 联创5号叶绿素含量变化最明显，相比对照下降17.20%.

图 4

Fig. 4

图 4 Pb对玉米叶绿素含量的影响 Fig. 4 Effects of lead on chlorophyll content of maize

玉米根系是直接受重金属Pb伤害的部位，根系活力在一定程度上反映了植株受Pb胁迫时应急生长及代谢情况. 由图 5可知，在不同Pb胁迫条件下品种间根活力的变化趋势不同. 隆平206、 漯玉336、 圣瑞568根活力随Pb胁迫浓度的增加而递减，其中隆平206在400 mg ·L^-1Pb时降低明显，而漯玉336和圣瑞568在100 mg ·L^-1Pb时就明显受到胁迫影响. 郑单958和联创5号则在100 mg ·L^-1Pb胁迫时根活力有所增加，之后则减少. 郑单958在400 mg ·L^-1Pb胁迫时根活力开始低于对照组. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下，相比对照隆平206根活力减小最为明显，为71.79%，其次是漯玉336，为60.40%，郑单958下降的最少，为25.30%.

图 5

Fig. 5

图 5 Pb对玉米根活力的影响 Fig. 5 Effects of lead on root activity of maize

不同玉米品种对Pb的吸收存在差异. 由表 1可知，同一浓度Pb胁迫下，不同玉米品种不同部位的Pb化学形态含量存在着显著差异. 由图 6、 图 7可知，所有品种在不同浓度Pb胁迫下茎叶和根部各形态Pb所占比例以醋酸提取态和盐酸提取态含量最高，两者合计值均大于50%. 100 mg ·L^-1Pb胁迫下郑单958和圣瑞568根部Pb醋酸提取态和盐酸提取态两者合计值高达87.27%和83.12%. Pb胁迫下，玉米通过将体内Pb转化为活性相对较低的磷酸盐和草酸盐等形式存在，以降低Pb对玉米的伤害. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下玉米体内Pb的NaCl提取态含量仅次于醋酸提取态和盐酸提取态含量. 800 mg ·L^-1 Pb胁迫下玉米茎叶内Pb的水提取态含量均比乙醇提取态含量高，所有玉米品种茎叶和根内Pb的水提取态含量和乙醇提取态含量均高于残渣态. 总体来说，800 mg ·kg^-1 Pb胁迫下玉米体内Pb各提取态含量依次为醋酸、 盐酸提取态＞NaCl提取态＞水提取态＞乙醇提取态＞残渣态. 但在100 mg ·L^-1Pb胁迫下玉米体内Pb各提取态含量则随品种的不同而有所差异.

由表 1可知，100 mg ·L^-1Pb胁迫下联创5号根部Pb乙醇提取态和水提取态合计值较其它品种高，为6.45 mg ·kg^-1，说明联创5号根内含较多迁移活性强的无机盐形态Pb，因此Pb容易从根部向地上部运输. 联创5号茎叶中Pb乙醇提取态和水提取态合计值最高，为2.78 mg ·kg^-1，占总量的25.41%(图 6)； 最低的是隆平206，为0.52 mg ·kg^-1，占总量的5.76%，其次是郑单958. 表明联创5号茎叶中活性Pb向低活性态Pb转换能力较差，抵抗Pb毒害能力较弱. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下郑单958茎叶中Pb乙醇提取态和水提取态合计值最低，为 2.41 mg ·kg^-1，其次是隆平206，为2.72 mg ·kg^-1，联创5号Pb乙醇提取态和水提取态合计值最高，为3.59 mg ·kg^-1. 各品种茎叶中Pb乙醇提取态和水提取态合计值占总量比例在10.10%~19.78%之间.

不同玉米品种体内Pb存在的共同特征为： 800 mg ·L^-1Pb胁迫下根中各形态Pb含量均高于茎叶中对应形态Pb的含量，100 mg ·L^-1Pb胁迫下根中各形态Pb含量大部分高于茎叶中相应形态的含量，表明Pb在根中蓄积能力较强.

表 1(Table 1)

表 1 玉米不同部位Pb化学形态分析 1) Table 1 Contents of different chemical Pb forms in different parts of corn Pb处理 /mg·L-1 品种 部位 Pb不同化学形态质量分数/mg·kg-1 总量 /mg·kg-1 提取率 /% 乙醇提取态 水提取态 氯化钠态 醋酸提取态 盐酸提取态 残渣态 100 隆平206 0.21±0.01c 0.31±0.01c 1.83±0.19a 3.35±0.11b 3.18±0.19a 0.27±0.04e 10.40 88 郑单958 0.21±0.01c 0.73±0.03bc 1.20±0.36b 3.17±0.19b 2.89±0.27ab 0.55±0.03c 10.72 82 漯玉336 茎叶 0.43±0.09b 0.75±0.14bc 0.75±0.07c 2.19±0.17c 2.86±0.30ab 0.43±0.04d 8.05 92 联创5号 0.10±0.02d 2.68±0.55a 1.30±0.16b 3.44±0.16b 2.46±0.30b 0.98±0.03b 12.05 91 圣瑞568 0.54±0.05a 0.96±0.26b 1.13±0.12b 4.61±0.50a 3.08±0.41a 1.16±0.11a 12.33 93 隆平206 0.68±0.13c 2.29±0.12b 1.29±0.09c 4.56±0.58bc 10.60±0.75e 2.62±0.09b 24.49 90 郑单958 0.61±0.06c 4.06±1.17a 1.82±0.45bc 21.81±1.22a 33.20±3.03a 1.54±012c 66.36 95 漯玉336 根 1.05±0.12b 0.71±0.12c 2.50±0.36b 3.20±0.38c 15.47±2.12d 1.16±0.08d 28.02 86 联创5号 2.70±0.10a 3.75±0.58a 6.62±0.60a 19.62±4.13a 28.60±2.14b 6.44±0.30a 73.61 92 圣瑞568 0.48±0.02d 2.93±0.62ab 2.53±0.57b 7.76±1.01b 23.43±1.03c 0.40±0.08e 42.15 89 800 隆平206 0.40±0.12d 2.32±0.42a 2.48±0.30c 4.01±0.38d 4.51±0.15d 0.04±0.01d 15.13 91 郑单958 1.09±0.11c 1.32±0.16c 2.84±0.29bc 7.15±0.93b 6.79±0.76c 0.22±0.13c 20.32 95 漯玉336 茎叶 1.34±0.08b 1.87±0.13ab 3.31±0.70b 5.85±1.43bc 4.14±0.19d 0.73±0.17b 20.15 86 联创5号 1.64±0.12a 1.95±0.14ab 2.62±0.03bc 4.70±0.55cd 8.67±0.22a 1.09±0.19a 22.97 90 圣瑞568 1.40±0.11b 1.68±0.35bc 5.33±0.23a 14.07±0.91a 7.71±0.54b 0.26±0.12c 34.46 88 隆平206 2.09±0.23c 3.13±0.43d 13.19±0.69b 28.80±0.39d 11.37± 1.85d 0.19± 0.03c 66.03 89 郑单958 5.68±1.06b 4.72±0.06c 14.35±0.61b 34.27±2.04d 22.49± 0.59c 1.80± 0.10b 90.56 92 漯玉336 根 7.94±0.35a 7.19±0.33b 21.32±3.60a 52.99±2.26b 49.99± 5.78a 2.47±0.42a 145.96 97 联创5号 7.58±0.52ab 7.52±0.39b 19.32±2.80a 44.26±4.31c 35.04± 1.73b 2.45± 0.19a 140.65 83 圣瑞568 8.38±1.17a 11.32±1.05a 21.60±1.79 a 85.73±4.77a 48.90± 4.67a 2.08± 0.40ab 181.40 98 1)同一处理同一部位同一列的英文小写字母不同表示品种间指标差异显著性(P<0.05)

表 1 玉米不同部位Pb化学形态分析 1) Table 1 Contents of different chemical Pb forms in different parts of corn

图 6

Fig. 6

图 6 100 mg ·L-1 Pb胁迫下玉米不同部位不同化学形态Pb所占百分比 Fig. 6 Percentages of different chemical forms of Pb in different parts of maize under 100 mg ·L-1 Pb stress

图 7

Fig. 7

图 7 800 mg ·L-1Pb胁迫下玉米不同部位不同化学形态Pb所占百分比 Fig. 7 Percentages of different chemical forms of Pb in different parts of maize under 800 mg ·L-1 Pb stress

本试验中，不同玉米品种对不同程度Pb胁迫的响应不同. 郑单958在受Pb胁迫时其地上部鲜重、 叶绿素含量、 根活力随Pb胁迫浓度的增加，呈现先增加后减少的趋势，且减少量较其它品种都低. 隆平206地上部生物量和根冠比随Pb胁迫浓度的增加，变化趋势较小. Pb胁迫对植株的地上部生物量、 根冠比、 叶绿素含量、 根活力等都有一定的影响，而植物受Pb胁迫时各项指标的高低直接反映了植物对Pb的耐受性^[20]. 其中，地上部生物量最能反映植物对逆境条件下的适应性，由地上部生物量和根冠比分析，初步得出郑单958和隆平206对Pb的耐受性较强.

本研究结果发现，不同玉米品种体内Pb以醋酸提取态和盐酸提取态较多，不同玉米品种其醋酸提取态和盐酸提取态所占比例不尽相同. 徐劼等^[21]研究认为，同种植物不同品种其体内重金属的主要存在形式不同，茶树品种龙井43根中Pb醋酸提取态含量最高，品种迎霜根中NaCl提取态含量最高. 不同植物体内重金属的主要存在形式亦不同，如金丝草体内的Pb主要以盐酸提取态为主，其次是醋酸提取态和NaCl提取态^[22]，芦苇体内Pb主要以难溶性的醋酸和盐酸提取态为主^[23]. 玉米体内Pb的乙醇和水提取态含量越高毒性也越强. Pb的其它提取态主要是以难溶性的蛋白结合态、 果胶酸盐、 磷酸盐结合态和草酸盐等形式为主，其迁移能力和毒性都比乙醇和水提取态Pb弱的多^[24]. 低浓度Pb胁迫下郑单958根中Pb醋酸提取态和盐酸提取态所占比例均高于其它品种，茎叶也处于较高水平，即郑单958体内Pb主要以难溶性磷酸盐、 草酸盐形态存在，以致自由态Pb所占比例较低. 800 mg ·L^-1Pb胁迫下郑单958茎叶中Pb乙醇提取态和水提取态合计值最低，其次是隆平206，而联创5号Pb乙醇提取态和水提取态合计值最高，郑单958和隆平206茎叶中Pb总量也最低. 由此表明，郑单958受Pb胁迫时，玉米减缓Pb伤害机制，可通过控制体内Pb总量或将体内大部分可溶态Pb转换成活性低的草酸盐态Pb等方式来增加自身对Pb的耐性，这可能是其表现出比其它品种对Pb耐性更强的原因.

隆平206体内醋酸提取态和盐酸提取态含量较其它品种并没有明显增高，说明隆平206耐Pb机制与体内Pb化学形态的转化关系并不密切. 隆平206在低浓度和高浓度Pb胁迫时其体内Pb的总吸收量都远低于其它品种. 隆平206对Pb的吸收总量少，相应的体内活性Pb含量少，Pb对自身的毒害也相对较轻，隆平206地上部生物量、 叶绿素含量等指标反映出较强的耐性. 这种对Pb低吸收的原因，可能与隆平206根系分泌物有关，植物根系可以合成分泌多种氨基酸、 有机酸等有机物，这些分泌物与重金属结合在一定范围内降低了重金属的生物有效性，减少了对植物的毒害^{[25, 26, 27]}. 同时，Pb胁迫会影响植物根水势，导致根系失水，植物通过提高可溶性糖的合成量来增强细胞的保水能力，从而减少因根系细胞失水对根系造成损害. 古红梅等^[28]研究证明随Pb胁迫浓度的增加，玉米体内的脯氨酸、 可溶性蛋白含量呈现逐渐增加的趋势，是作物对逆境条件的适应和抵抗机制. 林琦等^[29]研究表明Pb胁迫下，植物根际分泌物使得介质的pH轻微上升，有利于Pb离子呈羟基Pb化合物而沉淀，使得农作物免于吸收过量的Pb而中毒. 隆平206可以有效地将地上部Pb浓度限制在较低水平，这可能是其耐Pb的主要原因.

联创5号在低浓度和高浓度Pb胁迫下其根、 茎叶中乙醇提取态含量和水提取态含量合计值均比其它品种高，联创5号体内无机形态和有机可溶态Pb含量高，可能是造成其生长较为明显抑制的原因. 试验结果显示，受Pb胁迫时联创5号地上部生物量、 叶绿素含量、 根活力下降较其它品种明显，根冠比增加趋势也较其它品种明显，由此说明联创5号无法将体内的大部分Pb转换成活性较低的Pb，因此导致其受Pb毒害较重，这可能是联创5号对Pb耐性较差的原因之一.

(1)不同玉米品种对铅耐受性不同. 郑单958和隆平206耐性最强，而联创5号耐性最弱.

(2)在Pb胁迫条件下，隆平206可以有效地将地上部铅浓度限制在较低水平，这可能是其耐铅的主要原因.

(3)郑单958可最大程度将地上部乙醇提态和水提取态这两种毒性较高的铅含量降低. 说明通过形态转化降低毒性是郑单958适应铅的重要方式.

(4)漯玉336、 圣瑞568及联创5号对铅的耐性较差，尤其是联创5号. 这是因为它们无法通过减少对铅的吸收来降低铅的毒害，且体内可溶态铅转换成活性低形态铅的能力较弱.