环境科学  2015, Vol. 36 Issue (4): 1461-1467   PDF    
引用本文
王菲, 袁婷, 谷守宽, 王正银. 有机无机缓释复合肥对不同土壤微生物群落结构的影响[J]. 环境科学, 2015, 36(4): 1461-1467.
WANG Fei, YUAN Ting, GU Shou-kuan, WANG Zheng-yin. Effects of Organic and Inorganic Slow-Release Compound Fertilizer on Different Soils Microbial Community Structure[J]. Environmental Science, 2015, 36(4): 1461-1467.
有机无机缓释复合肥对不同土壤微生物群落结构的影响
王菲, 袁婷, 谷守宽, 王正银     
西南大学资源环境学院, 重庆 400716
收稿日期: 2014-08-19; 修订日期: 2014-11-20.
基金项目： 科技部农业科技成果转化资金项目(2007GB2F100266); 国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07104-003)
作者简介：王菲(1986~),女,博士研究生,主要研究方向为植物营养与品质,E-mail:scyhed@126.com
* 通讯联系人, E-mail:wang_zhengyin@163.com
摘要：缓控释肥料作为一类新型肥料已成为近年来的研究热点,但对土壤微生物群落多样性影响规律的研究甚少. 研究采用磷脂脂肪酸法分析缓释复合肥(SRF)、化肥(CF)和普通复合肥(CCF)分别施入酸性土和微碱性土恒温培养10、30、60和90 d后的微生物群落结构多样性. 结果表明,缓释复合肥等肥料施入2种土壤恒温培养(10~90 d)后检测到多种细菌(13:0,i14:0,14:0,i15:0,a15:0,i16:0,16:12OH,16:1w5c,16:0,i17:0,a17:0,cy17:0,17:02OH, i18:0,18:0,cy19:0w8c),2种放线菌(10Me17:0和10Me18:0)和1种真菌(18:1w9c). SRF在酸性土壤培养前期(10 d和30 d)较CF显著增加真菌PLFA含量8.3%和6.8%,在培养后期(60 d和90 d)较CCF显著增加真菌PLFA含量22.7%和17.1%; SRF较CF和CCF显著增加微碱性土壤在整个恒温培养期(30 d除外)土壤细菌、真菌和革兰氏阳性菌PLFA含量. 酸性土壤培养30 d和90 d时一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸PLFA值以SRF显著高于不施肥(CK)、CF和CCF,而在微碱性土壤上SRF仅在恒温培养60d时显著高于CK、CF和CCF; SRF较CCF显著降低酸性土壤(30~90 d)和微碱性土壤(10~60 d)异构PLFA/反异构PLFA值. 从2种土壤PLFA种类、含量以及相对丰度等可知缓释复合肥较化肥和普通复合肥提高了土壤微生物PLFA种类和含量以及减弱对微生物生存环境的胁迫,缓释复合肥在2种土壤中尤其对酸性土的作用明显. 通过研究缓释复合肥对土壤微生物群落结构多样性的影响,以期为农业生产上广泛施用缓释复合肥提供科学依据.
关键词： 缓释复合肥     磷脂脂肪酸     微生物群落结构     酸性土壤     微碱性土壤    
Effects of Organic and Inorganic Slow-Release Compound Fertilizer on Different Soils Microbial Community Structure
WANG Fei, YUAN Ting, GU Shou-kuan, WANG Zheng-yin     
College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: As a new style fertilizer, slow-control release fertilizer had been an important subject in recent years, but few researches were about soil microbial community structure diversity. Phospholipid fatty acid method was used to determined the microbial community structure diversity of acid soil and slight alkaline soil applied with slow-release compound fertilizer(SRF), chemical fertilizer (CF) and common compound fertilizer (CCF) at the 10th, 30th, 60th and 90th day under the constant temperature incubation condition. Results indicated that various bacteria (i.e 13:0,i14:0,14:0,i15:0,a15:0,i16:0,16:12OH, 16:1w5c,16:0,i17:0,a17:0,cy17:0,17:02OH, i18:0,18:0 and cy19:0w8c), two actinomycetes (10Me17:0 and 10Me18:0) and only one fungus (18:1w9c) were detected in two soils after applying slow-release compound fertilizer and other fertilizers during the whole incubation period. SRF could significantly increase the fungi PLFA content by 8.3% and 6.8% at the early stage (the 10th day and 30th day) compared with CF, as well as significantly increase by 22.7% and 17.1% at the late stage (the 60th day and 90th day) compared with CCF in acid soil. SRF significantly increased bacteria, fungi and gram positive bacteria compared with CF and CCF in incubation period (except at the 30th day) in slight alkaline soil. SRF could significantly improve the ratio of normal saturated fatty acid and monounsaturated fatty acid at the 30th day and 90th days in acid soil compared with no fertilizer(CK), CF and CCF, while as to slight alkaline soil, SRF was significantly greater than that of CK, CF and CCF only at the 60th day. SRF could significantly decrease the ratio of iso PLFA and anteiso PLFA in acid soil (in 30-90 days) and slight alkaline soil (in 10-60 days). For two soils PLFA varieties, contents and ratios of microbial community, slow-release compound fertilizer increased soil microbial PLFA varieties and contents, and decreased the influence to microbial survival environment, especially for the acid soil. Through the research of slow-release compound fertilizer on soil microbial community structure diversity, it could provide a scientific basis for widely application of slow-release compound fertilizer in agricultural production.
Key words: slow-release compound fertilizer(SRF)     phospholipid fatty acid(PLFA)     microbial community structure     acid soil     slight alkaline soil    

土壤微生物是土壤中物质循环的主要动力，在土壤肥力、 植物营养和可持续性农业生产中具有重要作用. 土壤微生物对施入土壤中的肥料经过一系列分解、 转变过程后，一部分作为自身的营养物质外，大部分会被留在土壤中供植物吸收利用. 但是大量肥料长期进入土壤后形成的微环境是否会短暂地使微生物不适应生存甚者导致中毒现象，或者怎样改变土壤微生物的种类和分布情况等，这不得不使较多研究者研究土壤微生物的重要功能. 目前，有关土壤微生物的研究报道较多[1,2]，尤其是研究施肥制度如不同肥料类型、 化学肥料与有机肥料以及长期施肥等对土壤微生物数量、 活性和群落多样性的影响[3, 4, 5, 6]. 缓控释肥料作为一类新型肥料已成为近年来的研究热点，然而迄今的研究集中在养分释放、 作物和环境效应等方面[7, 8, 9]，缺少对这类肥料的土壤肥力质量综合效应评价，特别是当前大量施肥现象严重，肥料种类和施用量等对土壤微生物的影响较大，缓控释肥料缓慢释放养分，在不同释放期对土壤微生物群落多样性影响规律的研究较薄弱，以致在农田推广应用缓控释肥料尚缺乏强有力的理论支撑. 因此，为了弄清不同肥料类型尤其是养分释放期较长的缓控释复合肥料在不同时间对不同酸碱度条件土壤微生物群落分布和多样性的影响规律，本文采用室内恒温培养和磷脂脂肪酸法(phospholipid fatty acid,PLFA)，研究化学肥料、 普通复合肥和缓释复合肥在重庆地区酸性和微碱性土壤不同培养时段(10~90 d)对土壤微生物群落结构多样性分布的影响规律，以期为该地区农业生产中合理施用缓释复合肥提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试土壤： 酸性土采自重庆市北碚区柳荫镇蔬菜基地，基本理化性质为pH 5.0，有机质15.3g ·kg-1，碱解氮130mg ·kg-1，有效磷21.6mg ·kg-1，速效钾109mg ·kg-1； 微碱性土采自重庆市铜梁区土桥镇蔬菜基地，基本理化性质为pH 7.9，有机质21.8g ·kg-1，碱解氮93.1mg ·kg-1，有效磷19.1mg ·kg-1，速效钾97.7mg ·kg-1. 供试肥料： 化肥为尿素(N,46%)，磷酸二氢铵(N,11%； P2O5,44%)，硫酸钾(K2O,50%)； 普通复合肥(氮磷钾质量分数为14%，8%和8%)由尿素、 磷酸二氢铵和硫酸钾复合造粒而成； 缓释复合肥系西南大学研制的一种以快速有效化处理的优质有机肥为基础，与经缓释技术处理的化学肥料复合而制得的养分结构型非包膜缓释复合肥(氮磷钾质量分数为14%、 8%和8%)，该肥料含有机质为15.7%[10].

1.2 试验设计

室内恒温培养试验设置4个处理： ①不施肥(no fertilization,CK)； ②化肥(chemical fertilizer,CF)； ③普通复合肥(common compound fertilizer,CCF)； ④缓释复合肥(slow-release compound fertilizer,SRF). 除CK外，各施肥处理N、 P2O5、 K2O用量均为200、 120、 120mg ·kg-1，各处理均重复3次. 试验时称取过1 mm筛的风干土壤100 g和相应用量的供试肥料，逐次加入去离子水，使土壤和肥料充分混匀，将土壤装入玻璃培养管(长度150 mm，直径35 mm)内，然后用滴管加入剩余的水量使之达到土壤田间持水量的80%左右，最后用保鲜膜封住管口，并在保鲜膜上均匀扎20个0.1 mm的小孔保证其通气条件，于恒温培养箱中25℃培养10、 30、 60和90 d. 为保证整个培养过程中作用条件(水分、 通气等)的一致性，每隔4 d采用重量法加水. 到达预定培养时间后，每处理取3次重复的培养管，将其土壤全部取出充分混匀. 取一部分土壤过2 mm筛，用无菌塑料袋装入，冷冻干燥后-70℃保存，用于PLFA分析； 另一部分土壤风干保存用于其他指标的测定.

1.3 测定项目及方法

土壤基本理化性质包括土壤pH和有机质采用常规分析法测定[11]. 土壤微生物PLFA按照Bligh等[12]方法提取后，用Agilent 6850气相色谱仪(FID检测器)分析PLFA的成分. 色谱条件为： HP-5柱(25.0 m×200 μm×0.33 μm)，进样量1 μL，分流比10 ∶1，载气： H2，尾吹气高纯N2，助燃气是空气，流速0.8mL ·min-1. 汽化室温度250℃，检测器温度300℃，柱前压10.0psi. 升高柱温： 170℃起始，5℃ ·min-1升到260℃，而后40℃ ·min-1升至310℃，保持1.5 min. 各成分脂肪酸通过MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version 6.1,MIDI,Inc.,Newark,DE)进行，标准品购于美国MIDI公司的C9-C20的脂肪酸甲酯，PLFA用C19：0做内标，换算PLFA的绝对含量.

细菌标记性脂肪酸有12：0，13：0，14：0，i14：0，15：0，i15：0，a15：0，16：0，i16：0，16：12OH，16：1w5c，i17：0，a17：0，cy17：0，18：0，cy19：0w8c等，其中i14：0，i15：0，a15：0，i16：0，i17：0，a17：0等代表革兰氏阳性细菌，16：1w5c，cy17：0，cy19：0w8c等代表革兰氏阴性细菌； 真菌标记性脂肪酸有18：1w9c； 放线菌标记性脂肪酸有10Me17：0和10Me18：0. 一般饱和脂肪酸以12：0，13：0，14：0，16：0，18：0等之和计； 单烯不饱和脂肪酸以16：12OH，16：1w5c，cy17：0等之和计. 异构PLFA以i14：0，i15：0，i16：0，i17：0等之和计； 反异构PLFA以a15：0，a17：0等之和计[13, 14, 15].

CK代表不施肥，CF代表化肥，CCF代表普通复合肥，SRF代表缓释复合肥 图 1 酸性土和微碱性土壤微生物PLFA含量及组成 Fig. 1 Contents and compositions of microbial PLFA in acid soil and slight alkaline soil
1.4 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0软件处理和分析； 多重比较采用Duncan法计算检验差异显著性(3次重复).

2 结果与分析 2.1 缓释复合肥对土壤微生物PLFA含量及组成的影响

缓释复合肥等肥料施入酸性土壤在室内恒温培养(10~90 d)后供检测出18种PLFA[图 1(a)]，其中有15种细菌，2种放线菌(10Me17：0和10Me18：0)，仅检测到1种真菌(18：1w9c)，没有检测到原生动物等其他生物. 室内恒温培养10、 30、 60和90 d，CK(不施肥)处理检测出的PLFA种类分别为10种、 17种、 12种和14种，CF(化肥)是10种、 16种、 13种和17种，CCF(普通复合肥)有9种、 16种、 15种和17种，SRF(缓释复合肥)检出10种、 17种、 17种和17种. 可见缓释复合肥可能因逐步释放养分使得土壤微生物群落在不同时期的种类较稳定. 从柱形图[图 1(a)]的堆积高度中还可看出，SRF在酸性土壤培养10 d时总PLFA含量较CK、 CF和CCF高，此后随着培养时间的增加，CK、 CF和CCF处理总PLFA含量持续降低，而SRF因养分逐步释放总PLFA含量相对较均衡.

微碱性土壤在整个培养期尤其是培养10 d较酸碱性土壤恢复能力强，检测到的PLFA种类数几乎一样. 这是因为土壤微生物适宜生活在微酸性至微碱性的土壤环境，酸性较强不利于土壤微生物的生存. 在整个培养期，含量相对较高的PLFA有i15：0，a15：0，i16：0，16：1w5c，16：0，i17：0，a17：0，cy17：0，18：0，cy19：0w8c，10Me18：0，18：1w9c. SRF较CF显著增加培养30 d的微碱性土壤饱和脂肪酸13：0和14：0，增幅分别为26.1%和5.7%，较CCF增加9.0%和22.5%[图 1(b)]，同时微碱性土壤在培养90 d时饱和脂肪酸(14：0、 16：0和18：0)也以SRF最高. 从PLFA堆积高度[图 1(b)]可知，培养10 d时，SRF较CF和CCF高，低于CK，随着培养时间的增加，施肥和不施肥均影响微碱性土壤的各种PLFA含量，但以缓释复合肥随着培养时间的增加总PLFA含量有增加趋势. 微碱性土壤适宜微生物的生存，当加入肥料后会扰乱土壤微生物的平衡系统使得降低，但缓释复合肥缓慢释放养分对土壤微生物的影响较小，且缓释复合肥中的有机质带入了大量可被微生物分解利用的碳源和氮源，为微生物的繁殖提供了物质基础[16,17].

2.2 缓释复合肥对土壤微生物各群落的影响

SRF较CF和CCF显著增加酸性土壤恒温培养10 d时的细菌、 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌. SRF较CCF显著增加培养60 d时放线菌PLFA含量41.7%(表 1). 对于酸性土壤真菌PLFA含量，SRF在培养前期(10 d和30 d)较CF显著增加8.3%和6.8%； 较CCF显著增加培养后期(60 d和90 d)的真菌PLFA含量，增幅分别为22.7%和17.1%. 相对酸性土壤，微碱性土壤在整个恒温培养期(30 d除外)土壤细菌、 真菌和革兰氏阳性菌以SRF显著高于CF和CCF，放线菌也以SRF最高.

表 1 土壤微生物群落 1)/nmol ·g-1 Table 1 Soil microbial communities/nmol ·g-1
2.3 缓释复合肥对土壤微生物相对丰度的影响

细菌/真菌和革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌的比值常用来表征土壤中各菌群生物量的变化和两个种群的相对丰富程度及土壤生态系统的稳定性，土壤细菌与真菌比值越低土壤生态系统越稳定[18]. 一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸值和异构PLFA/反异构PLFA值被用作反映环境胁迫或营养限制. 外界胁迫越大，微生物就越能合成更多的单不饱和脂肪酸[19]，而在低碳源和氧浓度，低pH和高温情况下，异构PLFA/反异构PLFA比率会增大[19]. 表 2可知，SRF在酸性土壤(30~90 d)中细菌和真菌的比值显著低于CCF，而在微碱性土壤中仅在培养10 d时以SRF显著低于CF和CCF，其它时期表现无显著差异. 酸性土壤革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌PLFA值在恒温培养30 d和90 d时以SRF显著高于CF和CCF，而微碱性土壤在整个培养期(10~90 d)均以SRF显著高于CCF. SRF在酸性土壤培养10 d(CCF除外)、 30 d和90 d时一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸PLFA值显著高于CK、 CF和CCF，而在微碱性土壤上SRF仅在恒温培养60 d时显著高于CK、 CF和CCF. SRF较CF和CCF显著降低酸性土壤(30~90 d)异构PLFA/反异构PLFA值，较CCF显著降低微碱性土壤(10~60 d)异构PLFA/反异构PLFA值. 从施肥对土壤微生物群落结构的影响情况可知，缓释复合肥对2种土壤尤其对酸性土壤微生物的胁迫较小.

表 2 土壤微生物各类群PLFA比值 /nmol ·g-1 Table 2 Ratios of different microorganism PLFA contents in soil/nmol ·g-1
2.4 缓释复合肥对土壤酸碱性和有机质的影响

表 3可知，缓释复合肥等肥料施入酸性土壤10 d后，SRF较CK土壤pH值变化不大，且随着培养时间的增加，SRF处理土壤pH值较稳定，而CF和CCF较CK降低酸性土壤pH值，且随着培养时间的增加而降低. SRF、 CF和CCF较CK降低微碱性土壤pH值，但SRF比CF和CCF对微碱性土壤pH值的影响较小，且没有随着时间的增加而降低. 从2种土壤中可知，缓释复合肥可能因缓慢释放养分而对土壤酸碱性的影响较小，尤其对酸性土壤的影响作用明显. SRF与CF、 CCF和CK对培养10d的酸性土壤有机质含量的影响无显著差异，且随着培养时间的增加(30~90 d)，SRF较CCF显著增加土壤有机质含量. SRF较CK对微碱性土壤有机质含量的影响无显著差异，甚至在培养90d时，SRF较CK显著降低，缓释复合肥本身含有机质，当施入微碱性土壤后有机质含量并没有显著提高，可能是微碱性土壤较酸性土壤更适合微生物的生存，SRF处理土壤有机质被大量微生物分解.

表 3 土壤pH和有机质 Table 3 The pH and organic matter in soil
3 讨论

土壤微生物在土壤生态系统碳和养分循环以及调节植物生产力和多样性中占有重要位置[20]，而土壤微生物的数量、 组成与活性以及群落结构等会受到土壤管理栽培模式、 酸碱性、 有机质、 温度和化学性质等的影响[21]. 土壤酸碱性能显著影响微生物的生长和功能，当土壤pH达到4.5时会限制微生物的恢复能力[22]. 本研究中2种土壤在培养10 d时以酸性土壤(pH 5.0)微生物PLFA种类和含量少于微碱性土壤(pH 7.9)，可见酸性土壤微生物的恢复能力较弱. 随着培养时间增加和肥料养分释放，酸性土壤微生物种类开始增加，与微碱性土壤几乎一致. 缓释复合肥较化肥和普通复合肥对2种土壤微生物的影响较大，尤其是增加了酸性土壤微生物PLFA种类(可能基于酸性土壤pH值的提高)，缓释复合肥对酸性土壤的微生物较化肥和普通复合肥有良好的改善作用，增加了土壤微生物PLFA种类，而化学肥料和普通复合肥降低了酸性土壤的pH值，使得微生物生存环境的酸碱性更加不适宜. 在微碱性土壤中缓释复合肥与化肥和普通复合肥相比，对土壤酸碱性的影响差异较小. 一般认为，土壤微生物生存的适宜酸碱性是在微酸性至微碱性的范围，酸性特别是强酸性土壤是不利于微生物的生存，应该与微碱性土壤微生物PLFA种类和含量相差较大，但总体上看2种土壤随着培养时间的增加微生物种类几乎一致，相比较酸性土壤，微碱性土壤微生物种类应该较多，但2种土壤在室内恒温培养后检测到的PLFA种类不是很多. 可能原因是室内恒温培养的局限性导致微碱性土壤微生物生长受到一定的抑制而不能正常发展. 即便如此，不同肥料处理对土壤微生物的影响是有差异的，缓释复合肥处理不仅提高了酸性土壤的pH值，而且较化肥和普通复合肥向2种土壤中提供了多种形态氮素，对2种土壤微生物PLFA种类和含量，群落分布的影响是有明显差异的.

缓释复合肥较化肥含有多种氮素形态，有可直接被利用的速效氮(铵态氮和硝态氮)，还具有缓释效果的有机氮形态，需要转化才能被植物利用[23]，同时缓释复合肥还采用了缓释技术，氮素养分释放缓慢且时间较长. 有研究指出不同形态的氮肥混合施用提高了土壤微生物活性，改善了土壤微生物区系，也增加了土壤中有益微生物放线菌的数量[24]. 普通复合肥和缓释复合肥均具有缓释效果，但缓释复合肥较普通复合肥还含有机质. 土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化和循环的动力，有利于土壤肥力的提高[25,26]，而有机质分解后会有小部分供给土壤微生物的营养需求，又会影响土壤微生物的活性和多样性等[27]. 有研究指出，氮磷钾与有机肥配合施用能明显提高土壤各养分含量，增加土壤微生物的数量，创造有利于土壤微生物生长繁育的土壤生物化学环境[28]； 在秸秆还田时配施适量氮磷钾肥能更好地刺激微生物生长，原因在于这种有机和无机肥配合方式既为微生物生长和繁殖提供大量的碳源和能源，又为微生物的生长提供较多的氮源[29]. 缓释复合肥不仅含有多种形态的氮素而且富含有机质，其中以优质有机物料菜籽粕等为基础转化的有机质可能对土壤微生物具有选择和富集作用，这种作用有益于淘汰不良种群，促进优良菌株的生长繁殖[30]. 在本研究中，缓释复合肥处理较化肥和普通复合肥提高了酸性土壤PLFA种类和含量以及微碱性土壤各微生物群落的PLFA含量，在土壤微生物的环境胁迫中以缓释复合肥处理的影响较小.

4 结论

缓释复合肥、 化肥和普通复合肥施入2种不同酸碱性土壤恒温培养后检测出的微生物群落包含细菌、 放线菌和真菌，在2种土壤中共检测到18种特征脂肪酸，其中有15种细菌，2种放线菌(10Me17：0和10Me18：0)和1种真菌(18：1w9c). 缓释复合肥较化肥和普通复合肥增加酸性土壤PLFA种类和微碱性土壤各微生物群落的PLFA含量. 从土壤微生物相对丰度可知缓释复合肥减弱了对2种土壤尤其是酸性土壤微生物的胁迫. 化肥和普通复合肥降低2种土壤的pH值，而缓释复合肥的影响较小. 缓释复合肥中的有机质可能为微生物生长和繁殖提供大量的碳源和能源，其缓慢释放养分对土壤微生物生存环境的影响较小.

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