我国水环境中氮的污染十分严重，传统的生物脱氮技术，以硝化(自养菌)和反硝化(异养菌)为基础，硝化菌以O₂为最终电子受体将NH₄⁺-N氧化为硝酸盐，反硝化菌以有机物为电子供体将硝酸盐还原为N₂，从而最终实现污水中NH₄⁺-N的脱除^[1]. 传统生物脱氮工艺，存在供氧动力消耗大，需投加有机碳源，产生大量剩余污泥和温室气体(CO₂)等先天性不足. 近年来开发了大量新型工艺，以CANON工艺为代表的短程硝化-反硝化工艺^[2]，是在生物膜或单个反应器内通过控制较低DO浓度来实现短程硝化和ANAMMOX，从而达到脱氮的目的^[3,4]，其主要缺点是单级反应器所能达到的全程自养脱氮效率较低； 工艺运行的稳定性差^[5,6]. 新工艺都力求缩短“氮”的转化途径和过程，即将亚硝酸盐氧化菌NOB从反应器中淘洗掉，同时将AOB有效保留在反应器中^[7,8]，把氨氮氧化为亚硝酸盐，而不再继续被氧化为硝酸盐^[9,10].

亚硝酸盐(NO^-₂-N)是ANAMMOX工艺运行的必需基质之一^[11,12]，ANAMMOX反应是一个以NO^-₂-N为电子受体和以NH₄⁺-N为电子供体的生物反应，该反应不但需要氨，还需亚硝酸盐^[13,14]. 若单独添加亚硝酸盐，将会使运行成本成倍增加^[15,16]，因此，氨的亚硝化(半短程硝化)工艺就成为了ANAMMOX过程的合适前处理工艺^[17,18]. 半短程硝化理论上比全程硝化要减少60%硝化需氧量、 50%污泥产量和反应器容积、 40%反硝化碳源^[19]. 然而大部分研究都局限于高NH₄⁺-N废水水质条件，通过对单一因素或者多个因素(温度pH值等)协同的控制，可以较容易地实现亚硝态氮累积^[20,21]. 但对于低NH₄⁺-N废水，在常温连续流中实现亚硝态氮累积并稳定维持的报道较少，而考察该反应中微生物群落的结构变化和AOB与NOB动态变化研究更鲜有报导.

为了促进半亚硝化短程反应的顺利进行，对系统中硝化细菌的分析和研究是重要的^[22,23]. 过去通过传统的技术对AOB和NOB研究是非常困难的，而且容易对环境中的微生物造成错误的估算，近年来发展起来的不依靠培养的分子生物学和生态学技术为精确研究环境样品中微生物的变化提供了可能. 为了获得半亚硝化短程工艺的稳定运行，深入研究脱氮菌群是非常必要的，以期为城市污水处理提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 实验装置和样品

半短程亚硝化反应器有效容积为24 L，由有机玻璃做成被等分为6个格室(如图 1)，每个隔室装有套筒，套筒内曝气是好氧环境，外部是厌氧环境. 反应器接种20 L高氨氮氮废水的短程硝化污泥，接种后反应器内悬浮固体浓度(MLSS)约为4000 mg ·L^-1左右. 半亚硝化反应器实验原水采用城市污水A/O除磷工艺的出水，具体水质指标如表 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 半短程亚硝化工艺流程示意 Fig. 1 Schematic drawing of partial nitritation process

表 1(Table 1)

表 1 原水水质 Table 1 Characteristics of raw wastewater 指标 pH COD /mg·L-1 TN/mg·L-1 NH4+-N/mg·L-1 NO-2-N/mg·L-1 NO3--N/mg·L-1 TP/mg·L-1 范围 7.5~8.0 23.4~92.8 45.6~60.7 43.0~54.7 0~0.1 0.1~1.4 0.12~0.82

表 1 原水水质 Table 1 Characteristics of raw wastewater

1.2 样品收集

半亚硝化反应器在室温下运行，控制反应器各格室中曝气筒外DO<0.2 mg ·L^-1，不排泥. 实验稳定运行历时4个月，每月考察一个回流比，共分为4个不同回流比，回流比从25%依次增加50%，75%最后至100%. 实验中采集了不同回流比稳定运行状态下的活性污泥. 1.3 实验方法 1.3.1 DNA提取与聚合酶链式反应(PCR)

样品总RNA提取采用活性污泥提取试剂盒，依照说明进行RNA的提取(Omega,USA). 取 0.5 g 活性污泥样品，提取RNA的浓度为90 ng ·μL^-1. 提取到的RNA使用细菌16S rRNA通用引物，上游引物27f，下游引物1492r进行PCR扩增^[24]. PCR扩增总体系为50 μL： 引物27f/1492r(浓度为10 mmol ·L^-1)各 1 μL，dNTPs(2.5 mmol ·L^-1)4 μL，10×buffer 5 μL， Taq酶(2.5 u)0.5 μL，RNA模板0.5 μL，灭菌的超纯水补足至 50 μL. 反应条件为，预变性94℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环； 72℃延伸10 min； 最后4℃保存. 1.3.2 荧光定量分析

实验采用SYBR Green染料法，采用AOB (Eub338/Nso1225)^[25]与NOB特异性引物 (NSR1113/FNSR 1264R)^[29]扩增16S rRNA基因片段，构建标准质粒，抽提，经测量计算样品浓度的数值，结果AOB的拷贝数为5.9×10¹¹，NOB的拷贝数为3.61×10¹⁰. 把两种质粒DNA作为定量的标准品，将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板用Real Master Mix (SYBR Green,TIANGENN) 体系进行PCR反应,仪器为Mx3000P荧光定量PCR仪(Genetimes公司). 25 μL反应体系中含2 μL待测样品和质粒标准品DNA，正向引物和反向引物各0.5 μL (10μmol ·L^-1)，9 μL 2.5×Master Mix，每个样品3个平行实验. 以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的C_t值为纵坐标，绘制标准曲线. 对系统中的AOB与NOB进行定量. 1.3.3 克隆文库的构建

使用Omega琼脂糖胶RNA回收试剂盒将PCR产物切胶纯化，根据载体说明书将纯化后的PCR产物与pGEM-T easy vector(Promega,USA)进行连接. 连接体系为 pGEM-T easy vector(50 ng ·μL^-1)1 μL，2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，PCR产物4 μL混匀，4℃冰箱中过夜. 转入大肠杆菌DH5α(Tiangen)，放入摇床37℃培养3 h，取培养后的菌液150 μL涂布在含青霉素(AMP)抗生素以及表面涂布有IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培养12 h后，挑取一定数量的带有插入片段的白色克隆构建克隆文库. 挑选250个鉴定为阳性克隆的克隆子再用T7/SP6进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶Hhal(Promega,USA)和Rsal(Promega,USA)进行分型，以获得OTU分型，将酶切图谱一致的克隆子分为一个OTU，每个酶切类型挑取1~2个代表菌株进行测序(北京博迈德生物技术有限公司). 同时按照上述步骤，上述样品进行氨单加氧酶基因克隆文库分析，上游引物为AmoA-1F： 5′-GGGG TTT CTAC TGG TGGT-3′PCR，下游引物为Amia-2R： 5′-CCCC TCK GS AAA GCC TTC TTC，产物经连接、 转化后挑取102个克隆子全部进行测序. 用Bioedit对所有测序结果进行编辑，序列在GenBank中同源性检索后下载同源性序列构建系统发育树，采用clustalx1.83进行比对，用Bootstrap N-J tree 重复1000次构建系统进化树，系统发育树的绘制使用MEGA 4.1的软件完成. 2 分析与讨论 2.1 实时定量PCR 结果

从图 2可看出，AOB和NOB的量在回流比25%和75%时，它们的量相差不多，而在回流比50%时AOB和NOB的量相差一个数量级，但在回流比75%时，AOB和NOB的量相差3个数量级，而在100%时和25%时结果相似. 因此本研究选择回流比75%的样品构建克隆文库，以进一步研究微生物群落和脱氮菌群的变化.

图 2

Fig. 2

图 2 内循环反应器中AOB和NOB的16S rRNA基因在每毫升废水中拷贝数的对数 Fig. 2 AOB and NOB log numbers of 16S rRNA gene copies per milliliter wastewater

克隆文库中每个OUT所含的克隆子数，去嵌合体后，共得到31个OTU，通过稀有度曲线检测，检测结果如图 3.

图 3

Fig. 3

用 Rarefactwin Version 1.3.软件绘制，代表了99%的置信度 图 3 16S rRNA基因克隆子稀有度曲线 Fig. 3 Rarefaction analysis of 16S rRNA gene clones

从图 3可以看出，稀有度曲线趋向饱和，说明克隆文库中250个克隆子能很好地反映系统中16S rRNA基因的变化，序列分析显示，文库中38.7%的克隆子有很低的相似性(<97%)，说明系统中存在很多新的菌群. GenBank登录号： HQ01463~HQ014661.

内循环半短程亚硝化系统中硝化细菌系统发育分析显示，共计 250个克隆子，31个OTUs. 从图 4可以看出，所有OTU分别属于细菌域的5个主要类群，主要是变性菌门(Proteobacteria)、 拟杆菌门(Bacteroidetes)、 绿弯菌门(Chloroflexi)、 厚壁菌门(Firmicutes)、 浮霉菌门(Planctomycetes). Proteobacteria类群又可分为β-变形菌纲、 δ-变形菌纲. β变性菌门(β-Proteobacteria)是主要的脱氮菌群，而AOB是这个菌群中最主要的菌群，在好氧氨氧化过程中起着主要的作用，OTUs z47、 z50、 z69、 z177被发现属于这个菌群，研究认为，在脱氮废水处理中Nitrosomonas是主要的氨氧化菌群. 在本研究中AOB与Nitrosomonas也有很高的相似率，同时系统中出现了浮霉菌属(Planctomycetes),包括 OTUs z23、 z134、 z189、 z86、 z182,因此可以看出浮霉菌门在内循环脱氮系统中也占相当的比例. 厌氧氨氧化菌(anaerobic-ammonium oxidation bacteria)属于浮霉菌门，其可以利用亚硝态氮(NO^-₂-N)氧化氨态氮(NH₄⁺-N)生成氮气(N₂)，在氧化过程中获得能量，厌氧氨氧化菌在低溶解氧和长的水力停留时间状态下可以和氨氧化菌共存. NOB是氧化亚硝态到硝态氮的主要菌群，它的活性通过降低氧的浓度可以受到抑制，在本系统中未被检测到. 熟悉了每种菌群的工作机制，能更加提高半亚硝化短程反应器的运行效果. 各个OUT的系统发育位置如图 4.

图 4

Fig. 4

基于1000个重复计算 图 4 半短程硝化系统中细菌16S rRNA基因系统发育树 Fig. 4 Neighbour-joining analysis showing phylogenic relationships of 16S rRNA gene sequences from the partial nitritation system clone library to sequences in other related organisms

测序结果经软件分型进行限制性片段长度多态性分析，获得4个OTUs分型. OTUs Z1 (67 clones)、 Z2 (25 clones)、 Z3 (7 clones)、 Z4 (3 clones) 的所有分型都属于Nitrosomonas，其中Z1与Nitrosomonas sp. (DQ304515) 菌群氨单加氧酶的相似度达到99%). 这些结果也进一步证明Nitrosomonas是把氨氮氧化为亚硝态氮的主要菌群. 这些amoA基因序列号为： HQ142894、 HQ142893、 HQ142885、 HQ142891，每个OUT的系统发育位置如图 5所示.

图 5

Fig. 5

图 5 半亚硝化短程系统中细菌amoA基因的系统发育树 Fig. 5 Neighbour-joining analysis showing phylogenic relationships of clone library amoA in the partial nitritation system sequences to other related organisms 1000个重复计算

在半亚硝化短程系统中，一半的氨氮被AOB转化到亚硝态氮，使得氨态氮与亚硝态氮的比值大致为1，然后进入下一级的厌氧氨氧化反应器，研究中通过控制恰当的回流比和溶解氧来控制微生物群落结构. 16S rRNA位于核糖体小亚基上，大约1500 bp即包括可变区也包括恒定区，所以具有高度保守性，也具有可变性，携带信息量大，用于种属的定量更加准确. 定量结果表明随着回流比增加，AOB的量逐渐增加； 但是，当回流比达到100%时，AOB的量反而降低. 通过这个结果可以假设，在回流比达到100%反应器出现了其它反应时(可能出现了一些厌氧反硝化菌，该菌不利于半亚硝化短程反应的进行)，在回流比为75%时，NOB的量达到最低. 可能由于在半亚硝化短程系统中，溶解氧的浓度非常低，AOB的溶解氧的半饱和系数(溶解氧的半饱和系数代表了和氧的亲和程度)是16 μmol ·L^-1，而NOB的溶解氧的半饱和系数是62 μmol ·L^-1，因此导致NOB的量变化更加明显. 通过上面分析可以得出，在半亚硝化短程系统中把溶解氧控制在0.2 mg ·L^-1以下，该工况AOB的增长比NOB更加有利，另外由于对AOB的有利条件，使得AOB的细胞生长得更大和强壮，在竞争有限能量的条件下比NOB增长速度更加迅速，细胞也更强壮. 因此在该系统中亚硝态氮更加容易积累，而NOB也容易洗出系统.

在先前研究的传统城市污水A/O硝化系统中Nitrobacter 和 Nitrospira都存在^[27]，且所占比例较高. Nitrobacter 和 Nitrospira都是革兰氏阴性菌，主要是把亚硝态氮氧化为硝态氮，可以通过控制溶解氧来限制它们的增长. Nitrobacter 和 Nitrospira是两种不同的NOB，它们分别在不同的条件下快速增长. 在NO^-₂浓度较高的条件下Nitrobacter是主要的NOB，而当NO^-₂浓度较低时Nitrospira是主要的NOB^[28]. 但在一些条件下这两种菌群可以共存，研究还发现Nitrobacter有独特的异养能力，而Nitrospira在异养条件下不能增长^[29]. 在本研究中，在半亚硝化短程系统中没有NOB被发现，可能由于高的NO^-₂累积率和AOB的高增长率，NOB已经从系统中被洗脱出去. 半亚硝化短程系统中出现的浮霉菌属可能在半亚硝化短程系统中发生了厌氧氨氧化反应，这主要是由于较低的溶解氧浓度和系统中亚硝态氮和氨态氮同时共存，这些可以作为厌氧氨氧化菌反应的基质，因此半亚硝化反应器更适合与厌氧氨氧化反应器联用.

16S rRNA 基因 和 amoA 基因的克隆文库对AOB的特征在基因水平上提供了更加细致的研究，而且可以通过amoA基因更加深入地研究AOB的16S rRNA基因，可以做为研究AOB多样性的分子尺. amoA基因系统发育分析表明，半亚硝化系统中主要的AOB是Nitrosomonas菌属. 在本研究中主要的Nitrosomonas是OTUs Z1 (67 clones). 序列分析显示和Nitrosomonas sp.(DQ304515)亲缘关系最近，而另一类亚硝化细菌Nitrosospira sp. 没有被发现(如图 5)，该菌可能已经被逐渐从系统中洗脱出去，同时证明Nitrosomonas在低溶解氧中比Nitrosospira增长迅速，本研究中出现的序列与以前的研究相似性很高. Nitrosococcus oceani 和Nitrosococcus halophilus在AOB的系统发育树中没有被发现. 因此这些发现也证明Nitrosomonas sp.在半亚硝化短程系统中是最主要的AOB菌群. 4 结论

(1)传统的A/O工艺需要较高的溶解氧来完成全程硝化，而新工艺需氧率较低因此节省了需氧量，即节约了曝气所需费用. 当溶解氧小于0.2 mg ·L^-1，回流比为75%时，系统的出水氨态氮和亚硝态氮的比率几乎为 1，更有利于与厌氧氨氧化反应器联用.

(2)在半短程硝化系统中的主要AOB菌群是Nitrosomonas sp.，Nitrosospira sp.没有被发现，NOB已经被从系统中洗脱出去，提高了亚硝态氮的累计效率.