环境科学  2015, Vol. 36 Issue (4): 1379-1384   PDF    
引用本文
马念念, 罗国芝, 谭洪新, 姚妙兰, 王晓用. 枯草芽孢杆菌对土臭素和2-甲基异冰片的降解动力学特性[J]. 环境科学, 2015, 36(4): 1379-1384.
MA Nian-nian, LUO Guo-zhi, TAN Hong-xin, YAO Miao-lan, WANG Xiao-yong. Kinetic Characteristics of Degradation of Geosmin and 2-Methylisoborneol by Bacillus subtilis[J]. Environmental Science, 2015, 36(4): 1379-1384.
枯草芽孢杆菌对土臭素和2-甲基异冰片的降解动力学特性
马念念1, 罗国芝1,2,3 , 谭洪新1,2,3, 姚妙兰1, 王晓用1    
1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306;
2. 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学水产动物育种中心上海高校知识服务平台, 上海 201306
收稿日期: 2014-09-05; 修订日期: 2014-11-19.
基金项目： 上海工程技术中心能力提升项目(13DZ2280500)
作者简介：马念念(1988~),女,硕士,主要研究方向为循环水养殖水处理,E-mail:mnn2011@126.com
通讯联系人,罗国芝,gzhluo@shou.edu.cn
摘要：土臭素(geosmin, GSM)和2-甲基异冰片(2-methylisoborneol, 2-MIB)是2种普遍存在于养殖水体中的土腥异味化合物,微生物降解是去除这两种物质的有效途径. 本文研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)降解GSM和2-MIB的动力学特性. 结果表明,枯草芽孢杆菌对GSM(1000~2000 ng ·L-1)和2-MIB(1000~2000 ng ·L-1)具有较好的降解性能,降解率均达90%以上; 枯草芽孢杆菌对这些异味化合物的降解符合伪一级反应动力学,其生物降解速率常数(K)范围为0.14~0.41,降解速率不随GSM和MIB初始浓度的变化而变化; 枯草芽孢杆菌对GSM降解的最大比生长速率umax为0.311,Monod常数KS为1.73,而在降解MIB过程中枯草芽孢杆菌的生长不符合Monod方程(R2=0.781).
关键词： 枯草芽孢杆菌     土臭素     2-甲基异冰片     土腥异味化合物     降解     动力学    
Kinetic Characteristics of Degradation of Geosmin and 2-Methylisoborneol by Bacillus subtilis
MA Nian-nian1, LUO Guo-zhi1,2,3 , TAN Hong-xin1,2,3, YAO Miao-lan1, WANG Xiao-yong1    
1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Shanghai Aquaculture Engineering Technology Research Center, Shanghai 201306, China;
3. Shanghai Universities Knowledge Service Platform (ZF1206), Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: The earthy and musty odor problem in aquaculture systems has been a worldwide problem, especially in freshwater aquaculture systems. Geosmin (GSM) and 2-methylisoborneol (2-MIB), the most common causative agents of the off-flavor in fish, are lipophilic secondary metabolites of cyanobacteria, actinomycetes, and other microorganisms. The odor threshold concentrations for 2-MIB and GSM are approximately 9-42 ng ·L-1 and 4-10 ng ·L-1, and 600 ng ·kg-1 and 900 ng ·kg-1 in the aquaculture water and fish, respectively. With such a low odor threshold concentration, the off-flavor compounds greatly reduce the quality and economic value of aquatic products. This renders the fish, especially some valuable fish produced in recirculating aquaculture systems (RAS), unmarketable.The study reported the kinetic characteristics of degradation of GSM and 2-MIB by Bacillus subtilis and discussed the impacts of the initial concentration of GSM and 2-MIB (T1,T2) and inoculation amount (T1,T3) on the biodegradation rate. The result demonstrated that these two compounds could be degraded by B. subtilis effectively and the biodegradation rate reached more than 90% in T1,T2 and T3 treatments. The biodegradation of these two compounds behaved as a pseudo-first-order kinetics with rate constants (K) in the range of 0.14-0.41. K values indicated that the degradation rate was dependent on the inoculation amount but the start concentration of GSM and MIB. The degradation kinetics showed the maximum specific rate value (umax) and the Monod constant (KS) were 0.311 and 1.73, however, 2-MIB degradation process did not meet the Monod microbial growth equation (R2=0.781).
Key words: Bacillus subtilis     geosmin(GSM)     2-methylisoborneol(2-MIB)     off-flavor compounds     degradation     kinetics    

土腥异味物质普遍存在于养殖水体，特别是淡水养殖水体，以土臭素(geosmin,GSM)和二甲基异冰片(2-methylisoborneol,2-MIB)最为常见[1]. GSM和2-MIB具挥发性，是放线菌(Actinomyces)和蓝绿藻(Cyanobacteria)等微生物的亲脂性次级代谢产物，易在脂质丰富的鱼组织中累积[2]，已报道的养殖品种有鲈鱼、 虹鳟、 大西洋鲑、 鲶鱼、 罗非鱼、 鲤鱼[3, 4, 5, 6]. GSM和2-MIB的存在降低了水产品品质，影响养殖业的经济效益. 美国养殖者仅因鲶鱼土腥异味问题损失收入0.04~0.26美元 ·(kg ·a)-1[2]. 因此，如何有效控制并消除养殖水体中土腥异味物质已成为研究的热点之一.

常见的土腥异味化合物的去除方法有物理吸附、 化学氧化法[7, 8]和微生物降解法，其中微生物降解被认为是具前景的方法之一[9, 10, 11]. 研究表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)有效降解土腥异味化合物[9, 10]. Narayan等[12]研究证明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能有效降解GSM； Silvey等[13]证明81%的GSM能被B. cereus降解，接种芽孢杆菌的生物膜反应器在连续流的条件下对浓度为600 ng ·L-1的2-MIB 的降解率达90%[14].

枯草芽孢杆菌作为水产养殖中的一种益生菌，除了能降解GSM和2-MIB等异味化合物，还具易培养、 繁殖快、 易保存、 对环境适应性强、 无毒无污染等特点，其胞外酶能分解水体和底泥中的有机质从而改善水质[15]. 本实验研究了枯草芽孢杆菌对GSM和2-MIB降解能力和降解动力学特性，以底物浓度(GSM和2-MIB)和降解时间t的关系进行反应动力学的描述，并采用合适的反应动力学方程进行拟合求出其动力学反应方程； 进一步讨论了GSM和2-MIB初始浓度及菌种接种量对GSM和2-MIB降解速率的影响，以期为养殖水体中土腥异味化合物的有效控制提供理论参考.

1 材料与方法 1.1 菌种来源

枯草芽孢杆菌取自上海海洋大学实验教学示范中心，在无菌条件下接种于1 L牛肉膏-蛋白胨液体培养基中，37℃摇床内培养24 h，pH、 溶解氧(dissolved oxygen,DO)控制在7.0和 4~6 mg ·L-1. 枯草芽孢杆菌的接种浓度为1.0×108 cells ·mL-1和1.0×105 cells ·mL-1. 实验中所有的实验材料、 试剂(除GSM和2-MIB)全部用高压蒸气灭菌器在 121℃ 下灭菌 20 min[16].

1.2 菌的纯化分离

细菌的纯化分离采用平板涂布和平板划线法. 从3个富集烧杯中取细菌悬液0.1 mL，用无菌水稀释103~105倍. 再从3个梯度浓度的稀释液中取0.1 mL细菌悬液用涂布刮均匀涂布在培养基上. 将培养皿放在生化培养箱中，37℃恒温培养24 h至菌体形态正常. 之后，取3个梯度中菌落密度适当的培养基，用无菌接种环从培养基中挑取单菌落后在新的培养基上划线. 然后再将新的培养基在37℃下恒温培养24 h，再重复挑取单菌落划线直至培养基表面的所有菌落外形一致，有清晰的单菌落，无杂菌. 之后，将菌种用斜面保存法保存在 4℃冰箱中. 每2~3周转接种至新的牛肉膏-蛋白胨培养基上，以保持细菌的活性[17].

1.3 细菌的形态鉴定 1.3.1 菌落形态鉴定

将长有单菌落的培养皿放在自然光下拍照，得到细菌的菌落照片.

1.3.2 菌株形态鉴定

采用革兰氏染色法对细菌进行染色[17]. 然后将染色后的细菌放在生物显微镜下观察、 拍照，得到放大400倍后的革兰氏染色细菌照片.

1.4 细菌的分子生物学鉴定方法

细菌基因组DNA的提取与16S rRNA基因扩增、 16S rRNA 基因序列测定由上海迈浦生物科技有限公司进行检测. 16S rRNA 基因序列比对： 利用GenBank 数据库(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt)进行，初步确定其所属的细菌种类[18].

1.5 实验设计和条件

在1 L锥形瓶中设置5组(T1~T5)，每组3个平行. 各组的土腥味初始浓度和枯草芽胞杆菌接种量见表 1. 10 d后，在T1，T2组中再次添加2 000 ng ·L-1和1 000 ng ·L-1的GSM和MIB，以确定初始浓度对枯草芽胞杆菌降解这两种异味化合物的影响，共计17 d.

表 1 各实验组初始GSM和2-MIB浓度和菌添加量Table 1 Initial operating parameters of GSM and 2-MIB biodegradation

每天09：00点从烧瓶中取水样进行温度、 DO、 pH、 总有机碳(total organic carbon,TOC)测定，13：00进行GSM和2-MIB浓度检测，当浓度降到最低时分析其降解产物，18：00进行降解菌浓度测定及菌计数. 实验结束时进行GSM和2-MIB降解产物的分析和确定. 1.6 分析方法 1.6.1 水质参数

水温、 pH、 DO用YSI(YSI556MPS，美国维赛公司，美国)测定仪直接测定. 总有机碳(total organic carbon,TOC) 用TOC分析仪测定(TOC-V.CPH，日本岛津制作所，日本).

1.6.2 细菌浓度

菌体浓度采用光电比浊法测定，测定波长600 nm 处的浊度(D600)，利用公式DCW (mg ·L-1)=314.5×D600，将 D 值转化成干细胞的质量[19].

1.6.3 GSM和2-MIB的分析

采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrum，SPME-GC-MS)法测定. 将一个微型磁转子放入15 mL萃取瓶中，再取12 mL水样于萃取瓶中，向萃取瓶中加入30%的NaCl，立即用20 mL带PTFE涂层硅橡胶垫的瓶盖密封； 将瓶放入已恒定在设定温度60℃的水浴中，将SPME手柄的不锈钢针管轻轻刺穿硅橡胶垫，插入瓶内顶空中，推出萃取头(萃取头PDMS/DVB)使其暴露于顶空中； 调节好微型磁转子的转速为650 r ·min-1，于60℃下顶空萃取40 min； 解吸： 萃取完成后将萃取头取出迅速插入到GS-MS进样口，在250℃下解吸3 min. GC-MS： HP-5MS弹性毛细管柱； 载气： 高纯He,恒压120 kPa； 进样方式： 无分流进样； 载气流速1.0 mL ·min-1； 解析时间3 min，进样口温度： 250℃； 程序升温： 初始温度60℃(保持3 min)，以5℃ ·min-1上升到150℃(保持2 min)，再以15℃ ·min-1速率上升到250℃(保持3 min)； 2-MIB、 GSM的保留时间分别为13.721 min和19.858 min[20, 21]. GSM和2-MIB的平均日去除效率用公式(1)和公式(2)计算. cinitial为起始浓度 (ng ·L-1)，cfinal为结束时浓度(ng ·L-1)，t为持续的时间(d).



2 结果与讨论 2.1 实验菌鉴定

实验用细菌菌落呈椭圆形，表面粗糙，不透明，乳白色； 革兰氏染色阳性，与枯草芽孢杆菌的特征相符[17].

测序结果表明菌的16S rRNA全长序列为1.081 kb，将所测菌的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt)中. 比对结果显示该菌与Bacillus subtilis subsp.(NCBI Reference Sequence： NC014479.1)有 99％的相似性，进一步说明该菌为枯草芽孢杆菌.

2.2 枯草芽孢杆菌对GSM和2-MIB的降解性能

枯草芽胞杆菌对GSM和MIB的降解效果如图 1所示. T1、 T2和T3中GSM和MIB的浓度均随时间的变化而降低，GSM的平均去除速率分别为95.60%±1.37%、 93.63%±1.57%、 90.53%±2.65%[图 1(a)]，差异不显著(P>0.05). MIB的平均去除速率分别为94.60%±1.57%，90.88%±0.01%，88.92%±4.86%[图 1(b)]，差异不显著(P>0.05). 实验结果与Yagi等研究相符[22]. T4组GSM和MIB浓度没有明显变化，T5组没有检测出这两种异味化合物. 实验期间各处理组温度保持在35.16~38.19℃； pH保持在5.62~7.93.

T1、 T2、 T3、 T4、 T5分别代表不同的处理组图 1 不同组GSM和MIB浓度变化Fig. 1 Changes of GSM and MIB concentration in different treatments
2.3 枯草芽孢杆菌对GSM和2-MIB降解反应动力学

通过对2.2节中的数据进行ln函数转化，再以lnS-t作一元线性回归方程得到如表 2中的相关速率常数和相关系数. 各处理组的决定系数(R2)都在0.92以上，证明lnS-t的线性相关显著，根据反应动力学中积分法确定枯草芽胞杆菌对GSM和MIB的降解反应属于伪一级反应[23]. 由表 2可知，T1和T2组高低浓度的GSM和MIB的生物降解速率相似，证明GSM和MIB的初始浓度并没有影响GSM和MIB的生物降解效率. 此外，与MIB相比，GSM的生物降解速率常数更高. Ho等[10]在研究砂滤和生物反应器中GSM和MIB生物降解速率时也证明了Pseudomonas sp.等菌对GSM的降解速率高于MIB，对这两种异味化合物的降解也属于伪一级反应. 这可能与其结构相关，GSM分子结构相比MIB更加平面化、 挥发性更高、 溶解性更低[1].

表 2 处理组GSM和MIB生物降解的伪一级反应速率常数1)Table 2 Pseudo-first-order rate constants (K) of GSM and MIB biodegradation in different treatments
2.4 枯草芽孢杆菌降解GSM和2-MIB的生物动力学

在降解异味化合物的反应体系中其动力学行为表现为细菌的生长和底物基质的消耗，因此分析了GSM和2-MIB降解与菌体生长量之间的关系. 根据韦朝海等报道得出基质消耗速率公式(3)，将公式(3)做相应的处理得到公式(4)[24]. 现以cX/rX和cS-1作图(图 2)，图 2表明枯草芽孢杆菌降解 GSM过程中微生物的生长符合Monod方程(R2=0.95)，其动力学参数KS为1.73，umax为0.311. 将其动力学参数代入公式(1)可得T1组GSM降解动力学模型为： r=0.536 ·cS/(1.73+cS) ·cX. 但结果表明枯草芽孢杆菌在降解MIB过程中微生物生长并不符合Monod方程(R2=0.781)(文中未给出). 

图 2 cX /rX 与cS-1的关系曲线Fig. 2 Relationship figure of cX /rX and cS-1
式中，rX和rS分别代表细菌生长速率和异味物质消耗速率； cX和cS分别代表细菌浓度和异味物质浓度； KS代表Monod常数； umax代表细菌的比生长速率； YX/S ： 单位基质细菌得率系数，mg ·mg-1.

表 3 T1组GSM动力学参数Table 3 GSM kinetic experiment quality in treatment T1
2.5 反应器对GSM和2-MIB降解反应动力学

通过对反应器中GSM和MIB浓度随时间变化的相关数据进行ln函数转化，再以lnS-t作一元线性回归方程得到如表 4中的相关生物降解速率常数(K)和决定系数(R2). 由表 4可知，接种枯草芽孢杆菌的反应器对GSM和MIB均具有较好的降解效率，其生物降解速率常数范围为0.36~0.53，均高于对照组(0.07~0.29). 接种相同浓度枯草芽孢杆菌的不同初始浓度的异味化合物的反应器中，其生物降解速率常数相近，证明枯草芽孢杆菌反应器中这两种异味化合物的降解也属伪一级反应.

表 4 反应器中GSM和2-MIB的生物降解速率常数1)Table 4 Biodegradation rate constants of GSM and 2-MIB in all reactors

2.6 降解产物的初步确定

通过GC-MS分析得到GSM的降解产物为2H-Benzocyclohepten-2-one,1,4a,5,6,7,8,9,9a-octahydro-4a-methyl-,trans-(8CI)，分子式C12H18O，其CAS登录号为17429-26-4 [图 3(a)]，2-MIB的降解产物为1.1,5-Dimethyl-6-oxabicyclo[3.2.1]octan-7-one，CAS登录号为13747-98-3，分子式C9H14O2[图 3(b)].

图 3 GSM和2-MIB的降解产物Fig. 3 Degradation products of GSM and 2-MIB

细菌对GSM和2-MIB的降解产物的性质受环境条件和细菌种类的影响. Saito等[25]的研究表明，相同的微生物对活性污泥和生物过滤器反冲水GSM的降解产物不同，这可能是因为不同的环境条件下，不同的降解菌的降解产物会有差别. Tanaka等[26]研究报道Pseudomonas sp. 和Enterobacter sp.对2-MIB的降解产物分别为2-methylcamphene 和 2-methyl-2-bornane； Yuan等[27]研究表明Micrococcus spp.,Flavobacterium spp.,Brevibacterium spp.及Pseudomonas spp.对2-MIB的降解产物为2-methylenebornane和2-methyl-2-bornane. 3 结论

(1)枯草芽孢杆菌对GSM和2-MIB具有较好的降解性能，对GSM和MIB的降解效率均达90%以上.

(2)枯草芽孢杆菌对这些异味化合物的降解符合伪一级反应动力学，相关系数r均大于0.964，且对GSM的生物降解速率常数高于MIB.

(3)降解动力学表明枯草芽孢杆菌对GSM降解的最大比生长速率umax为0.311，Monod常数KS为1.73，生长的Monod公式为r=0.536·cS/(1.73+cS)·cX，而在降解MIB降解过程中枯草芽孢杆菌的生长不符合Monod方程(R2=0.781).

参考文献
[1] Tucker C S. Off-flavor problems in aquaculture[J]. Reviews in Fisheries Science, 2000, 8 (1): 45-88.
[2] Schrader K K, Rimando A M. Off-flavors in aquaculture: an overview[M]. Washington, DC: American Chemical Society, 2003. 1-12.
[3] Schrader K K, Rubio S A, Piedrahita R H, et al. Geosmin and 2-methylisoborneol cause off-flavors in cultured largemouth bass and white sturgeon reared in recirculating-water systems[J]. North American Journal of Aquaculture, 2005, 67 (3): 177-180.
[4] Schrader K K, Summerfelt S T. Distribution of off-flavor compounds and isolation of geosmin-producing bacteria in a series of water recirculating systems for rainbow trout culture[J]. North American Journal of Aquaculture, 2010, 72 (1): 1-9.
[5] Schrader K K, Tucker C S, Hanson T R, et al. Management of musty off-flavor in channel catfish from commercial ponds with weekly applications of copper sulfate[J]. North American Journal of Aquaculture, 2005, 67 (2): 138-147.
[6] Robertson R F, Hammond A, Jauncey K, et al. An investigation into the occurrence of geosmin responsible for earthy-musty taints in UK farmed rainbow trout, Onchorhynchus mykiss[J]. Aquaculture, 2006, 259 (1-4): 153-163.
[7] Matsui Y, Yoshida T, Nakao S, et al. Characteristics of competitive adsorption between 2-methylisoborneol and natural organic matter on superfine and conventionally sized powdered activated carbons[J]. Water Research, 2012, 46 (15): 4741-4749.
[8] Sagehashi M, Shiraishi K, Fujita H, et al. Ozone decomposition of 2-methylisoborneol (MIB) in adsorption phase on high silica zeolites with preventing bromate formation[J]. Water Research, 2005, 39 (13): 2926-2934.
[9] McDowall B, Hoefel D, Newcombe G, et al. Enhancing the biofiltration of geosmin by seeding sand filter columns with a consortium of geosmin-degrading bacteria[J]. Water Research, 2009, 43 (2): 433-440.
[10] Ho L, Hoefel D, Bock F, et al. Biodegradation rates of 2-methylisoborneol (MIB) and geosmin through sand filters and in bioreactors[J]. Chemosphere, 2007, 66 (11): 2210-2218.
[11] Elhadi S L N, Huck P M, Slawson R M. Factors affecting the removal of geosmin and MIB in drinking water biofilters[J]. Journal-American Water Works Association, 2006, 98 (8): 108-119.
[12] Narayan L V, Nunez W J III. Biological control: isolation and bacterial oxidation of the taste-and-odor compound geosmin[J]. Journal-American Water Works Association, 1974, 66 (9): 532-536.
[13] Silvey J K G, Henley D E, Hoehn B, et al. Musty-earthy odors and their biological control[A]. In: Proceedings of the AWWA Conference on water quality control[C]. 1975. 1-17.
[14] Ishida H, Miyaji Y. Biodegradation of 2-methylisoborneol by oligotrophic bacterium isolated from a eutrophied lake[J]. Water Science and Technology, 1992, 25 (2): 269-276.
[15] Wu Y H, Li T L, Yang L Z. Mechanisms of removing pollutants from aqueous solutions by microorganisms and their aggregates: a review[J]. Bioresource Technology, 2012, 107 : 10-18.
[16] Lu L, Tan H X, Luo G Z, et al. The effects of Bacillus subtilis on nitrogen recycling from aquaculture solid waste using heterotrophic nitrogen assimilation in sequencing batch reactors[J]. Bioresource Technology, 2012, 124 : 180-185.
[17] 白延琴, 辛小玲, 来有志, 等. 枯草芽孢杆菌的分离筛选[J]. 畜牧兽医杂志, 2013, 32 (2): 24-27.
[18] Zhou B H, Yuan R F, Shi C H, et al. Biodegradation of geosmin in drinking water by novel bacteria isolated from biologically active carbon[J]. Journal of Environmental Sciences, 2011, 23 (5): 816-823.
[19] Wang S J, Loh K C. Modeling the role of metabolic intermediates in kinetics of phenol biodegradation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 25 (3-5): 177-184.
[20] Lin T F, Liu C L, Yang F C, et al. Effect of residual chlorine on the analysis of geosmin, 2-MIB and MTBE in drinking water using the SPME technique[J]. Water Research, 2003, 37 (1): 21-26.
[21] Watson S B, Brownlee B, Satchwill T, et al. Quantitative analysis of trace levels of geosmin and MIB in source and drinking water using headspace SPME[J]. Water Research, 2000, 34 (10): 2818-2828.
[22] Yagi M, Nakashima S, Muramoto S. Biological degradation of musty odor compounds, 2-methylisoborneol and geosmin, in a bio-activated carbon filter[J]. Water Science and Technology, 1988, 20 (8-9): 255-260.
[23] 许越. 化学反应动力学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005.
[24] 韦朝海, 任源, 吴超飞, 等. 专性好氧菌降解苯胺废水的动力学研究[J]. 环境科学研究, 1999, 12 (4): 15-18.
[25] Saito A, Tokuyama T, Tanaka A, et al. Microbiological degradation of (-)-geosmin[J]. Water Research, 1999, 33 (13): 3033-3036.
[26] Tanaka A, Oritani T, Uehara F, et al. Biodegradation of a musty odour component, 2-methylisoborneol[J]. Water Research, 1996, 30 (3): 759-761.
[27] Yuan R F, Zhou B H, Shi C H, et al. Biodegradation of 2-methylisoborneol by bacteria enriched from biological activated carbon[J]. Environmental Science Engineering, 2012, 6 (5): 701-710.