磷是水生生物进行物质合成及能量传输所必需的营养元素，也是湖泊初级生产力的主要限制性因子^[1]. 水体中磷存在的主要形式是溶解态有机磷(dissolved organic phosphorus，DOP)和颗粒态磷(particulate phosphorus,PP)^[2]. 浮游生物可直接利用的是以正磷酸盐为主要形态的反应活性磷(soluble reactive phosphorus，SRP)，仅占总磷(total phosphorus，TP)的5%-8%^[3]. 尽管DOP和PP一般不能被直接利用，但是在一定条件下可转化成SRP并为生物吸收和利用^[4]. 碱性磷酸酶是水体中广泛存在的一种磷酸酯水解酶. 当水体中SRP含量较低时，浮游植物和细菌等诱导产生大量碱性磷酸酶，对有机磷进行酶促水解，释放正磷酸盐，这是水中生物可利用磷来源的一种重要补偿机制^[3]. 因此，碱性磷酸酶在有机磷的酶促水解和无机磷的释放过程中扮演重要角色，其活性(alkaline phosphatase activity，APA)与浮游动植物的组成分布、活性磷浓度和藻类生物量等因素有着密切联系^{[5, 6]}. 氮磷对藻类生长的调控作用一直是人们研究的热点问题^{[7, 8]}，常用的生态调查方法由于影响因素复杂，难以真实地反映营养盐与浮游植物生长之间的关系，因此营养盐添加试验越来越成为研究相关问题的有效手段^[9]. 当前，通过向自然水体中添加系列氮磷负荷，研究磷营养盐的吸收、储存、利用和释放等一系列过程，以及碱性磷酸酶在此过程中的调控作用，并与藻类生长情况相联系鲜见报道，尤其是氮对APA的影响尚未引起重视. 梅梁湾是太湖北部水质污染最严重的湖湾之一，直湖港、梁溪河和武进港^[10]等入湖河流常年向太湖输入了大量污水^{[11, 12]}. 因此，本研究通过向梅梁湾水体中添加系列氮磷负荷，试验模拟外源营养盐汇入时，水体中磷形态转化和APA的变化规律，从而研究SRP对APA的诱导-抑制机制，以及浮游藻类的生长响应，以期为深入认识湖泊水体中磷的循环过程和藻类暴发机制提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 样品采集

于2014年春季在太湖梅梁湾(31°29.575′N，120°12.442′E)进行水样采集，用有机玻璃采水器采集水样后，低温避光保存于25 L聚乙烯采样桶中，立即带回实验室. 24 h内测定初始水体中各形态氮磷的质量浓度和叶绿素a(Chl-a)等水质指标. 剩余水样经200 μm筛网过滤，去除大颗粒悬浮物和大型浮游动物后，用于营养盐添加试验. 1.2 试验方法

将采集的原水均匀分配到10个2 L玻璃烧杯中，每个烧杯中初始水样体积为2000 mL，以质量浓度(以N和P计)为1000 mg ·L^-1的KNO₃和50 mg ·L^-1的K₂HPO₄作为母液分别进行氮磷添加. 水样分为3种处理： A处理添加PO₄^3--P，B处理添加NO₃^--N，对照不进行营养盐添加，各组添加营养盐后的氮磷含量如表 1所示. 试验在室内常温下进行，每天用洗净的玻璃棒轻轻搅拌水体，尽量使水体混合均匀. 第1、3、5、8、11、14、17 d的09：00用50 mL注射器采集水样，同时记录水温和pH. 取样后立即测定水体中Chl-a浓度、各形态磷(TP、TDP、SRP、DOP、PP)的质量浓度和碱性磷酸酶活性.

表 1(Table 1)

表 1 培养试验添加氮、磷浓度 Table 1 Nitrogen and phosphorus concentrations for nutrient enrichment bioassays 处理 对照 加磷 加氮 A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 氮含量DIN/mg·L-1 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 2.0 3.0 5.0 8.0 磷含量SRP /mg·L-1 0.009 0.015 0.030 0.050 0.100 0.300 0.009 0.009 0.009 0.009 氮磷质量比DIN∶SRP 373∶1 224∶1 112∶1 67∶1 34∶1 11∶1 492∶1 738∶1 1230∶1 1968∶1

表 1 培养试验添加氮、磷浓度 Table 1 Nitrogen and phosphorus concentrations for nutrient enrichment bioassays

通过过硫酸钾消解-钼酸铵分光光度法对水体中TP和TDP的质量浓度进行测定，SRP的质量浓度采用钼酸铵分光光度法测定. TDP与SRP的差值即为水体中DOP的质量浓度，PP则由TP减去TDP获得. 水样经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，滤膜用于Chl-a浓度的测定^[13]. 利用AA3型连续流动分析仪(Continuous Flow Analyzer，德国Seal公司)对滤后水样中的氨氮(NH⁺₄-N)、硝态氮(NO₃^--N)和亚硝氮(NO^-₂-N)进行测定. 1.3.2 水体中碱性磷酸酶活性的测定

以对硝基苯磷酸二钠盐(p-NPP)作底物，反应产物对硝基苯酚(PNP)的产生速率作为APA的指标. 根据文献^[14]选择的试验反应条件为： pH 8.4(Tris缓冲液调节)、温度30℃、反应物体积5 mL，在恒温培养箱中反应6 h，用TU-1901系列紫外可见分光光度计在410 nm波长下测定. 1.3.3 碱性磷酸酶活性的最大反应速率(Vmax)和米氏常数(K_m)的计算^[15]

在0.01-3.0 mmol ·L^-1的浓度范围内，取8个不同的底物浓度，分别测定APA. 根据Michaelis-Menten方程：

V=V_max·[S]/(K_m+[S])

生长速率计算公式：

μ=ln(X₂/X₁)/(T₂-T₁)

由表 2可见，春季太湖梅梁湾水体中TP和TN的质量浓度分别为0.112 mg ·L^-1和2.302 mg ·L^-1. 不同形态的磷中，SRP和DOP的质量浓度较低，分别为0.009 mg ·L^-1和0.004 mg ·L^-1，PP最高(0.099 mg ·L^-1)，占TP的88.4%. 无机氮中NO₃^--N为主要组分，占TN的64.3%. 揣小明^[17]确定太湖TP的基准和控制标准参考值分别为0.03 mg ·L^-1和0.06 mg ·L^-1，可见梅梁湾上覆水中TP含量均已超过该基准值和控制标准参考值. Rosenberg等^[18]提出，当NH⁺₄-N和NO₃^--N同时出现在介质中时，浮游植物优先吸收氨氮. 但相对于NH⁺₄-N，NO₃^--N才是太湖水体中氮的主要存在形态，其影响不容忽视^[19]. 从营养比例结构来看，春季TN ∶TP(46 ∶1)和DIN ∶TP(30 ∶1)均大于王玉珏等^[20]和Smith^[21]提出的磷限制标准(16 ∶1和5 ∶1).

表 2(Table 2)

表 2 水体中初始氮、磷浓度及比例结构特征 Table 2 Initial concentrations of nitrogen and phosphorus and their ratios in water 氮形态 浓度/mg·L-1 磷形态 浓度/mg·L-1 氮磷比 比值 TN 2.302 TP 0.112 TN∶TP 46 DIN 1.516 SRP 0.009 DIN∶TP 30 NH+4-N 0.015 DOP 0.004 DIN∶SRP 373 NO3--N 1.480 PP 0.099 NO-2-N 0.021

表 2 水体中初始氮、磷浓度及比例结构特征 Table 2 Initial concentrations of nitrogen and phosphorus and their ratios in water

藻类生物量(以Chl-a表示)在不同处理中呈现出了不同的变化规律(图 1)，A处理中的Chl-a浓度呈先上升后下降的趋势，对照和B处理则在波动中下降. A处理的Chl-a浓度从第1 d起就迅速上升，第3 d左右达到峰值，然后藻类生长进入衰退状态，Chl-a浓度下降，直至维持在较低的浓度水平[图 1(a)]. 对照和B处理的Chl-a浓度只在试验开始时略微上升，然后便在波动中下降，一直处于较低状态[图 1(b)]. 加磷后藻类的生长速率(μ)明显提高，但添加不同浓度的氮对其影响不大，B处理的藻类最大生长速率(μmax)均在0.06-0.08 d^-1之间，与对照相比，加氮没有明显加快藻类的生长(表 3). 试验结果显示了磷限制的特点，即藻类生长对单独加氮的响应相对较弱，加磷对藻类生长有明显促进作用. 这可能是因为水体中的初始DIN已经很高(1.516 mg ·L^-1)，SRP的质量浓度仅为0.009 mg ·L^-1，水体中的磷处于匮乏状态.

图 1

Fig. 1

图 1 不同处理中的藻类生长状况 Fig. 1 Responses of phytoplankton biomass (Chl-a) to nutrient enrichment in incubation

在前11 d，A1的Chl-a浓度一直保持最高，最大生长速率(μmax)也高于其他各组(表 3). 到试验后期，随着水体中磷营养盐的不断消耗，A4和A5的Chl-a浓度又有所上升，最终各处理的Chl-a浓度为： A4>A3>A2>A1>A5>对照，这表明并非水体中磷浓度越高对藻类生长越有利，磷浓度过高有时也会对浮游植物的生长产生抑制. 陈永根等^[22]系发现，在梅梁湾水体中，当TP浓度较低时，Chl-a浓度与TP浓度呈正相关； 当TP浓度较高时(超过0.31 mg ·L^-1)，Chl-a浓度与TP浓度呈负相关，与本研究结果相近. 王小冬等^[23]通过氮磷加富试验也认为，氮磷营养盐的添加在一定程度上能够促进浮游植物的生长，但并非营养盐添加越高浮游植物生物量就越高. 3 d后各处理中的Chl-a浓度缓慢降低，说明仅通过添加氮磷营养盐，藻类的生物量不能获得持续增长，与王玉珏等^[20]和王婷婷等^[24]的研究结果一致. 这主要是因为随着室内培养的进行，水中的氮磷虽然充足，但铁、锌、铜、锰等微量元素以及钙、镁、钠、钾等常量元素是有限的. 另外，3-4月藻类生长正处于复苏期，生理、生化活性缓慢恢复，还未进入生物量增加的生理阶段^[25]. 因此，在今后研究中还需进一步扩展至不同季节，以探究不同生长阶段的藻类对氮磷添加的响应.

表 3(Table 3)

表 3 试验前后Chl-a含量以及藻类最大生长速率 Table 3 Initial and final Chl-a and μmax in incubation 处理 编号 含氮量DIN/mg·L-1 含磷量SRP/mg·L-1 初始Chl-a/μg·L-1 Chl-a峰值/μg·L-1 结束Chl-a/μg·L-1 最大生长速率μmax/d-1 对照 1.5 0.009 9.83 10.95 8.07 0.05 A1 1.5 0.015 9.65 15.08 9.46 0.22 A2 1.5 0.030 9.98 14.56 9.79 0.19 加磷 A3 1.5 0.065 9.84 14.83 10.01 0.21 A4 1.5 0.125 9.74 14.82 10.92 0.21 A5 1.5 0.400 9.84 11.64 8.69 0.08 B1 2.0 0.009 9.71 11.28 7.42 0.07 加氮 B2 3.0 0.009 9.89 11.40 7.50 0.07 B3 5.0 0.009 9.86 11.48 8.00 0.08 B4 8.0 0.009 9.88 11.25 7.72 0.06

表 3 试验前后Chl-a含量以及藻类最大生长速率 Table 3 Initial and final Chl-a and μmax in incubation

添加不同浓度的磷酸盐后，水体中各形态磷占TP的百分比如图 2所示. SRP的百分比在试验前期不断下降，DOP和PP则逐渐升高. 随着SRP不断消耗，有机磷库的部分可酶解磷又水解成活性磷，使生物可利用磷得到补充，SRP的比例上升. 添加的无机磷越多，SRP由下降转为上升的拐点出现得越晚. A1、A2和A3分别在第5 d、第11 d和第17 d，A4和A5由于有充分的可直接利用的无机磷，SRP一直处于下降状态，试验过程中从未上升，有机磷则不断增加.

图 2

Fig. 2

图 2 不同加磷处理中磷形态的转化规律 Fig. 2 Changes of phosphorus forms under different P treatments

A1、A2、A3和A4的DOP百分比都在试验过程中有明显下降，A5的DOP却比试验开始时增加. 这是因为当水体中SRP含量不足时，DOP可被细菌和藻类产生的碱性磷酸酶水解后利用^[26]，少量DOP组分还可被生物直接吸收利用，如ATP和6-磷酸葡萄糖等，最终都转变成细胞中的有机成分： 磷脂、脂酸及核酸等. A5中的SRP含量充足，因此DOP主要被合成而不需消耗.

藻类生物量呈先上升后下降的变化趋势 (图 1)，而PP总体呈上升趋势，表明试验过程中水生生物对水体中的磷进行了吸收、富集和利用^[2]. 藻类吸收磷后，有利用和储存两种途径. 在试验前期，藻类吸收并利用水中的磷用于自身生长； 到了后期，即使藻类生长不再需要大量的磷，藻体也会继续吸收，储存在体内的磷库中^[27]，在体内积累后慢慢利用，即藻类对营养盐有“奢侈消费”的能力^[24]. 2.3.2 氮添加对磷形态转化的影响

从图 3可以看出，加氮处理后，水体中的SRP质量浓度(c_SRP)随时间呈下降-上升-下降的波动变化. 并且，与对照相比，添加不同浓度的硝态氮后，SRP的变化规律存在明显差异. 初始水体中SRP的质量浓度为0.009 mg ·L^-1左右，添加NO₃^--N后所有水样中的SRP均显著下降，第3 d加氮处理中的c_SRP都低于对照，大小顺序为： c_SRP (B4)< c_SRP (B3)< c_SRP (B2)< c_SRP (B1)< c_SRP (对照). 可见，在最初3 d，NO₃^--N输入越多，SRP下降得越快. 但从第5 d起，各处理中的SRP又先后出现上升趋势，B4中的最先出现. 第8 d所有处理的SRP都上升至峰值，对照则降至最低，即c_SRP(B4)>c_SRP(B3)>c_SRP(B2)>c_SRP(B1)>c_SRP(对照)，此后各处理的SRP呈下降趋势至试验结束. 另外，与加磷处理类似，加氮试验结束时各处理中的PP百分比也有所增加(图 4). 从磷形态的循环转化来看，对照中的磷形态转化稳定而缓慢，加氮处理中的则相对迅速.

图 3

Fig. 3

图 3 不同氮浓度下SRP浓度随时间的变化 Fig. 3 Time course incubation results of SRP concentrations under different N treatments

图 4

Fig. 4

图 4 不同加氮处理中磷形态的转化规律 Fig. 4 Changes of phosphorus forms under different N treatments

以上结果表明，添加一定浓度的氮营养盐，确实能提高水生生物对磷的吸收利用能力，加快磷循环的速率. 水生生物的生长需要分别摄取一定比例的氮和磷，近年来许多学者进行过不同配比营养盐对藻类生长影响的研究^{[28, 29, 30]}. 添加一定量的硝态氮后，水生生物大量生长时缺乏磷，增加了藻类和细菌对磷的需求，从而使细胞吸收和利用更多的磷，导致水体中的生物可利用磷迅速减少. 因此，以碱性磷酸酶水解有机磷为主导的磷转化活动就更加迅速和剧烈. 这与Xu等^[19]的研究结果相符，该研究认为，氮源输入的增加，同样会引起生物对磷利用的增加，利于藻类暴发. 2.4 碱性磷酸酶的动力学参数变化特征

A处理中碱性磷酸酶活性的Vmax在小幅下降后上升，呈S型增长趋势[图 5(a)]； B处理的Vmax则呈J型增长趋势，一直保持上升趋势直至试验结束[图 5(b)]. 与对照相比，加磷处理中只有A2的Vmax值高于对照； 而所有加氮处理的Vmax值均显著高于对照. A处理中Vmax值在开始时略微下降，是由于磷酸盐的添加抑制了藻类和细菌对碱性磷酸酶的分泌. 随着水中磷酸盐的消耗，酶活性显著增强. 对照和A1由于初始SRP的质量浓度很低，第3 d均已降至0.003 mg ·L^-1，磷酸酶受诱导增加分泌，继而Vmax在第5 d就出现小幅上升. 随着SRP迅速下降，对照、A1、A2和A3的APA从第8 d起都进入快速上升期. 此时，对照和A2的SRP都已降至最低，A1和A3中的SRP也从5 d后就一直保持在较低水平(低于0.025 mg ·L^-1). A4和A5的水体中由于SRP的质量浓度较高，Vmax一直以小幅度平稳下降，处于较低水平，直到第11 d才略有上升[图 2和图 5(a)]. 由此可见，磷含量确实对APA有重要影响，但该影响机制较为复杂，主要包括直接影响和间接影响两方面，所以并非简单地呈负相关关系. 直接影响即SRP浓度对APA的诱导-抑制调控机制： 在SRP缺乏的状态下，浮游生物会诱导产生大量碱性磷酸酶，从而在较大范围内接触并分解有机磷底物(DOP和PP)； 反之，当正磷酸盐浓度较高时，酶的活性则会受到抑制^{[31, 32]}. 间接影响则是通过影响水生生物的生长情况来进行的，由于碱性磷酸酶主要是由浮游植物和细菌产生的，适当提高水中无机磷的浓度，能促进它们的生长，提高其生物量，从而增加碱性磷酸酶的分泌. 因此，在本研究结果中，虽然对照的含磷量最低，但其Vmax值低于A2[图 5(a)].

图 5

Fig. 5

图 5 不同处理中Vmax和SRP随试验时间的变化 Fig. 5 Changes of Vmax and SRP in different treatments during the bioassays

由图 5(b)可以看出，添加硝酸盐对碱性磷酸酶活性有显著促进作用，提高了水体中生物对磷的利用能力，但添加不同浓度的氮之间，对酶活性的促进作用并未发现显著差别. 浮游细菌是水体中碱性磷酸酶的重要来源之一，文献^{[33, 34]}通过研究海洋生态系统中氮营养盐与细菌APA的关系发现，APA不仅受到磷的调控，还受到含氮化合物和有机碳的调控，充足的氮可以增强APA，与本研究结果一致. 微生物在利用水体无机氮的同时，需积极分泌磷酸酶以弥补相应的磷组分或增加的细胞个体数，相应提升了APA.

有学者提出，营养盐添加试验中藻类有3个生长阶段^{[35, 36]}： 第一阶段生物量无明显增加，藻类吸收营养盐储存在体内； 第二阶段水体中营养盐开始减少，生物量开始增加； 最后水体中营养盐不足，藻类利用自身储存的营养盐. 本研究中APA的增长说明藻类生长已进入第三个阶段，不仅吸收和积累了水体中的磷，还对细胞内储存的磷进行了利用，因此才会诱导碱性磷酸酶的增加^[37]. 3 结论

(1) 春季太湖梅梁湾水体中浮游植物的生长主要受到磷限制，加氮对藻类生长没有明显的促进作用. 试验期间叶绿素a呈先上升后下降的变化趋势，藻类在加磷至SRP=0.015 mg ·L^-1的水样中生长最快，叶绿素a的浓度最高，最大生长速率达0.22 d^-1. (2) 磷酸盐浓度对碱性磷酸酶活性有重大影响，当SRP≤0.025 mg ·L^-1时，对APA有显著促进作用. 并非正磷酸盐的含量越低，APA越高，少量磷源汇入有利于水生生物的生长繁殖，从而增加了碱性磷酸酶的分泌，在本试验条件下，加磷至SRP=0.03 mg ·L^-1的处理中酶活性最高. (3) 添加各种浓度的氮营养盐均能显著促进水体中碱性磷酸酶的产生，酶的最大反应速率最高可达0.64 μmol ·(L ·min)^-1，这提高了浮游植物和细菌对磷的吸收利用能力，加快了磷循环过程.