长久以来，甲烷被认为只有在好氧条件下才能被微生物氧化. 缺氧的海洋环境中，甲烷氧化耦合硫酸盐还原生物过程的发现打破了这一传统认识^{[1, 2]}. 研究发现，与硫酸盐还原耦合的甲烷厌氧氧化过程在控制海洋温室气体甲烷排放中起着极其重要的作用，据推断，海洋沉积层产生的90%以上的甲烷由此生物过程消耗^[3]. 然而，从热力学角度分析发现，以亚硝酸盐为电子受体的甲烷厌氧氧化反应是完全可能发生的，该反应在标准状况下的吉布斯自由能为-928 kJ ·mol^-1，而甲烷氧化耦合硫酸盐还原反应的吉布斯自由能仅为-16.6 kJ ·mol^-1. 尽管在自然界中可检测到甲烷和亚硝酸盐或硝酸盐的共存，但在相当长的时期内科学家都未能在自然界中找到该反应，为此，催化此类反应的微生物曾一度被认为在自然界中是“失踪”的^[4].

2006年，Raghoebarsing等^[5]在实验室条件下获得了能够利用亚硝酸盐为电子受体的甲烷氧化微生物富集培养物，证实了甲烷氧化可耦合亚硝酸盐的还原. 该生物过程被称之为亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,N-DAMO). N-DAMO反应的发现对完善全球碳氮循环具有重要贡献，且作为温室气体甲烷潜在的汇，其在缓解全球温室效应中可能起着重要作用^[6]. 此外，N-DAMO反应实现了甲烷和亚硝氮的同步去除，为研发新型生物脱氮除碳工艺提供了契机^{[6, 7, 8]}. 参与N-DAMO反应的微生物是一类新的微生物，隶属于一新发现的细菌门——NC10门，该门的细菌迄今都是不可培养的，且与其它门细菌的亲缘关系较远(16S rRNA基因相似度小于85%). Ettwig等^[9]将此类新发现的微生物命名为Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M. oxyfera). 近年来，研究者对M. oxyfera的生物学方面进行了深入研究，取得了许多突破性的进展. 本文系统地综述了M. oxyfera各方面的微生物特性，以期更好地认识此类微生物在碳氮生物地球化学循环、 温室气体甲烷减排和新型生物脱氮除碳工艺研发中的重要意义.

1 个体形态特征

M. oxyfera是一种革兰氏阴性菌(G^-)，细胞直径约0.2～0.5 μm，细胞长度约0.8～1.1 μm^{[9, 10]}. 透射电镜观察结果显示，M. oxyfera具有非常独特的多边形(星状)细胞形态(图 1)，此类多边形细胞形态至今未在其它种类微生物中发现，为此可作为鉴定M. oxyfera的一个重要形态学特征^[11]. 随后的研究也证实了M. oxyfera富集培养物中存在此类特殊的多边形细胞形态^{[12, 13]}. 研究表明，M. oxyfera基因组中含有编码类骨骼成分的基因(如mreB和ftsZ)，其对于细胞的形态具有重要影响^{[14, 15]}，为此，这些基因的存在被认为是导致其具有特殊星形细胞形态的重要原因^[11]. 细胞表面蛋白(S-layer protein)则被认为是维持此类微生物特殊细胞形态稳定性的重要蛋白^[11]. 透射电镜结果还显示，与其它已知的甲烷氧化菌细胞形态不一致，M. oxyfera细胞中不具备提供颗粒性甲烷单加氧酶(particulate methane mono-oxygenase,pMMO)结合位点的细胞质内膜(intracytoplasmic membranes,ICMs)^[11]. 由于ICMs的合成需要耗费大量的能量，而M. oxyfera代谢速率低，推测其没有更多的能量来合成ICMs^[11].

图 1

Fig. 1

(a)类似星状细胞形态; (b)和(c)：细胞纵截面; (d)：细胞横截面; om为外膜; p为细胞周质; cm为细胞质膜; c为细胞质; s为S层蛋白; 标尺为200 nm图 1 M. oxyfera透射电镜照片 [11] Fig. 1 Transmission electron micrograph of M. oxyfera

M. oxyfera被证实由特殊的脂肪酸组成. Kool等^[16]研究了几种M. oxyfera富集培养物中的脂质组成，发现脂肪酸10-甲基十六烷酸(10MeC_16:0)是优势脂肪酸，其含量占富集培养物脂肪酸总量的46%. 研究还发现，M. oxyfera富集培养物中存在一种特殊的脂肪酸——10MeC_{16 ∶1Δ7}，该脂肪酸迄今未在其它种类微生物中发现，其含量占了富集培养物脂肪酸总量的10%，是M. oxyfera细胞特有的脂肪酸组分^[16]. 由于该脂肪酸的特殊性，Kool等^[16]认为其可作为M. oxyfera的生物标记物. Zhu等^[17]和Kool等^[16]分别利用qPCR和脂质分析技术对受含氮地下水污染泥炭地M. oxyfera的水平进行定量分析，结果表明M. oxyfera的细胞数量与10MeC_16∶1Δ7的含量呈显著正相关，证实了脂肪酸10MeC_{16 ∶1Δ7}可作为M. oxyfera的生物标记物. 3 富集培养特征

M. oxyfera的富集培养通常选用环境样品(如河道沉积物、 活性污泥和水稻土等，M. oxyfera富集培养物见表 1. 由于M. oxyfera为厌氧微生物，故在此类微生物富集培养过程中要保证严格的厌氧环境. 亚硝酸盐是M. oxyfera生长所需的基质之一，因此通常采用含有适量亚硝酸盐和营养元素的培养液(表 2)^[18]在生物反应器内对此微生物进行富集培养. 甲烷亦是M. oxyfera生长所需的基质之一，它的存在对于富集M. oxyfera也是必需的，因而研究者通常向生物反应器内持续曝甲烷气体或通过增加甲烷分压的方法，提高液相中溶解性甲烷浓度，以此为M. oxyfera提供充足的基质甲烷^{[5, 10, 13, 17, 18, 19, 20, 21]}. 根据Ettwig等^[18]的研究发现，M. oxyfera富集培养物中的NC10门细菌主要分为两大类群，即group A和group B. 后期研究发现，富集培养初期，group A和group B往往共存于培养物中，而随着时间的推移，group B被逐渐淘汰，通常仅剩group A存在于培养物中(表 1)，表明group A的NC10门细菌是N-DAMO反应的主要功能微生物^{[13, 17, 18, 19, 20, 21]}. 目前，有关group B的NC10门细菌能否执行N-DAMO反应有待进一步探明.

表 1(Table 1)

表 1 目前已报道的M. oxyfera富集培养物 Table 1 Reported enrichment cultures of M. oxyfera 接种物 NC10门细菌组成 亚硝酸还原速率/nmol ·(mg ·min)-1 文献 河道沉积物 group A 6.2 [5] 河道沉积物 group A 3.7 [10] 河道沉积物 group A 3.4~5.6 [18] 河道沉积物(以NO3--N计) group A 36~37.8 mg ·(L ·d)-1 [21, 22] 泥炭土 group A 4.3 [17] 混合接种(以NO3--N计)1) group A和group B 2.4 mmol ·(g ·d)-1 [19] 废水污泥 group A 0.9 [20] 产甲烷污泥(以CH4计) group A 0.8 μmol ·(g ·h)-1 [13] 淡水沉积物(以CH4计) group A 1.0 μmol ·(g ·h)-1 [13] 水稻土(以CH4计) group A 1.4 μmol ·(g ·h)-1 [13] 1)混合接种：湖泊沉积物、 厌氧消化污泥和活性污泥

表 1 目前已报道的M. oxyfera富集培养物 Table 1 Reported enrichment cultures of M. oxyfera

迄今获得的M. oxyfera富集培养物的代谢活性均较低(表 1)，其亚硝酸还原速率明显低于传统的反硝化速率. 研究还发现，富集培养后期，N-DAMO活性往往无法进一步提升，甚至出现降低趋势^{[10, 17, 18, 21, 22, 23]}. 最近，Kampman等^[22]通过降低水力停留时间和增加进水铜(pMMO酶所需的关键元素)离子浓度成功使得降低的N-DAMO活性得到了不同程度的恢复. 由此，Kampman等^[22]认为M. oxyfera富集培养中可能存在某些抑制性的中间代谢产物或缺少了某些未知的生长因子，导致了富集培养后期N-DAMO活性受到抑制. 目前M. oxyfera的富集大多采用的是人工培养基(表 2)，但Zhu等^[17]采用泥炭地的原位地表水作为培养基成功获得了一种新的M. oxyfera富集培养物，暗示了原位环境水体中可能含有某些特殊的同时又是M. oxyfera所必需的生长因子. 但是，原位环境水体中的某些营养成分含量往往较低，这也可能会限制N-DAMO活性. 为此，在未来的研究中可以结合人工培养基和天然培养基进行M. oxyfera的富集，以期快速获得高活性的M. oxyfera富集培养物，为研发经济环保的新型生物脱氮除碳工艺奠定基础.

表 2(Table 2)

表 2 富集M. oxyfera的营养液成分 Table 2 Nutrients used for M. oxyfera enrichment 营养液 质量浓度/g ·L-1 KHCO3 0.5~1.0 KH2PO4 0.05 CaCl2 ·2H2O 0.3 MgSO4 ·7H2O 0.2 NaNO3 0.425 NaNO2 0.0345~1.38 酸性微量元素(100 mmol ·L-1 HCl) 0.5 mL ·L-1 FeSO4 ·7H2O 2.085 ZnSO4 ·7H2O 0.068 CoCl2 ·6H2O 0.12 MnCl2 ·4H2O 0.5 CuSO4 0.32 NiCl2 ·6H2O 0.095 H3BO3 0.014 碱性微量元素(10 mmol ·L-1 NaOH) 0.2 mL ·L-1 SeO2 0.067 Na2WO4 ·2H2O 0.050 Na2MoO4 0.242

表 2 富集M. oxyfera的营养液成分 Table 2 Nutrients used for M. oxyfera enrichment

M. oxyfera是自养型细菌，CH₄为其唯一能源，通过卡尔文循环固定CO₂，将CH₄氧化成CO₂获取能量^{[9, 24]}. M. oxyfera生长缓慢，倍增时间需约1～2周^[18]，甚至长达一个月以上^{[17, 21, 22, 25]}，但对基质CH₄的亲和力非常强(Ks<5 μmol ·L^-1)^[10]，远强于以硫酸盐为电子受体的甲烷厌氧氧化菌对CH₄的亲和力(Ks一般为mmol ·L^-1级别)^[26]. 此外，当外界环境中的甲烷浓度低至0.6 μmol ·L^-1 时，M. oxyfera仍可利用甲烷完成N-DAMO反应^[5]，暗示在自然环境中M. oxyfera对甲烷的亲和力可能更强(Ks<0.6 μmol ·L^-1). M. oxyfera富集培养物动力学研究表明，M. oxyfera对基质NO₂^-的亲和力较差，Ks为0.9 mmol ·L^-1[25]. 自然生境中由于NO₂^-极不稳定，且含量通常较低，为此推测自然生境中M. oxyfera对NO₂^-的Ks值应远小于富集培养物中获得的Ks值. 研究表明，M. oxyfera对氧敏感，当外界氧浓度超过2%时，M. oxyfera的活性受到明显抑制^[27]，但对于微量溶解氧或间歇性供氧对M. oxyfera的影响还有待探明.

由于缺乏足够的富集培养物，N-DAMO的机制研究较为滞后. 起初的研究结果认为，N-DAMO反应由细菌和古菌共同催化完成. Raghoebarsing等^[5]认为甲烷在甲烷厌氧氧化古菌(ANME-2)的作用下经逆向产甲烷途径转化为CO₂，生成的中间代谢产物(如甲酸和乙酸等)和释放的电子提供给M. oxyfera完成NO₂^-/NO₃^-的还原. 然而，随后的研究表明，N-DAMO反应并不需要古菌的参与. Ettwig等^[10]通过专一性抑制实验发现，向M. oxyfera富集培养物中添加溴乙烷磺酸(逆向产甲烷途径的专一性抑制剂)并不影响甲烷氧化活性，为此，N-DAMO反应的完成并不依赖于古菌的逆向产甲烷途径. 研究还发现，在大多数M. oxyfera富集培养后期，古菌的比例逐渐减少，直至完全消失，但富集培养物甲烷氧化速率仍保持较为稳定的状态^{[10, 13, 17, 18, 20, 21]}. 最近，Haroon等^[28]证实了M. oxyfera富集培养物中的古菌具有甲烷氧化耦合硝酸盐还原的能力，这也解释了古菌通常仅存在于添加NO₃^-的富集培养初期.

Ettwig等^[9]在N-DAMO的机制研究方面取得了突破性进展，发现了地球上第4种生物产氧途径. M. oxyfera富集培养物的宏基因组分析发现，M. oxyfera并不具备催化完整反硝化途径必备的所有基因，其缺少编码氧化亚氮(N₂ O)还原酶基因. 然而，M. oxyfera能够产生N₂，因而其必然存在一种未知酶能催化某种中间产物生成N₂. 研究还发现，M. oxyfera拥有完整的编码甲烷好氧氧化酶的所有基因，并且能够转录、 翻译和表达，据此推测M. oxyfera拥有完整的甲烷好氧氧化途径. 富集培养物的同位素示踪实验表明M. oxyfera能够自产氧，其产生的氧气用于甲烷的氧化，获取能量. 在此基础上，Ettwig 等^[9]提出了M. oxyfera的理论代谢模型(图 2)，该模型认为M. oxyfera首先将NO₂^-还原为NO，然后在某种未知的NO歧化酶作用下将产生的2分子NO歧化生成O₂，最后用生成的O₂完成甲烷的好氧氧化. 尽管同位素实验中O₂的浓度一直低于检出限，Wu等^[29]发现M. oxyfera基因组中存在4组终端呼吸氧化酶(2 种细胞色素c氧化酶、 泛醌氧化酶和抗氰化物交替氧化酶)基因并都进行了转录，其中一组氧化酶(泛醌氧化酶)基因进行了翻译^[29]，进一步佐证了M. oxyfera具有内产氧功能. Wu等^[12]还通过免疫金标记实验证实了催化甲烷氧化和亚硝酸还原的两种关键酶pMMO和亚硝酸盐还原酶(Nir)共存于M. oxyfera细胞内. M. oxyfera内产氧功能的发现，表明在植物出现之前细菌就可能已在地球上制造氧气，

从而弥补了地球演化过程中“缺失的一环”^[9].

图 2

Fig. 2

nirSJFD/GH/L为亚硝酸还原酶编码基因; pmoCAB为颗粒性甲烷单加氧酶编码基因图 2 M. oxyfera的代谢模型 [9] Fig. 2 Metabolic pathways of M. oxyfera

随后，Wu等^[30]进一步细化了M. oxyfera的中心代谢和能量代谢途径(图 3). 在甲烷氧化途径方面：甲烷首先在pMMO酶的催化下转化为甲醛，然后甲醛在亚甲基-四氢甲基蝶呤(H₄MPT)脱氢酶(MtdB)或亚甲基-四氢叶酸(H₄F)脱氢酶(FolD)的作用下转化为甲酸，最后甲酸在甲酸脱氢酶(FDH)的作用下最终转化为二氧化碳，产生的二氧化碳可进入卡尔文循环进行碳的固定^{[24, 30]}. 此外，甲烷氧化途径中产生的甲醛被推测可进入丝氨酸途径进行碳的固定^[30].在亚硝酸还原途径方面：NO₂^-首先在血红素cd1型亚硝酸还原酶(Nir)的作用下转化为NO，然后2分子的NO在一氧化氮歧化酶(NOD)的作用下生成N₂和O₂，最后生成的O₂中有3/4用于甲烷的氧化，剩余的1/4进入正常呼吸链进行产能代谢^[30]. 作为呼吸型的微生物，M. oxyfera可通过化学渗透机制来产能(图 3). NAD(P)H脱氢酶复合体可耦合NADH的氧化和醌的还原，并伴随质子的泵出，实现跨膜质子梯度来合成ATP. 细胞色素bc1复合体则可对还原性醌进行氧化，继而可再次实现质子的跨膜转移. 细胞色素c则作为电子供体将电子传递给cd1型Nir，实现亚硝酸的还原^[30].

图 3

Fig. 3

橙色的表示甲烷氧化途径; 蓝色的表示亚硝酸还原途径; cyt.c表示细胞色素c; FDH表示甲基脱氢酶; FolD表示亚甲基-H4F脱氢酶; MtdB表示亚甲基-H4MPT脱氢酶; NDH,ND(P)H表示脱氢酶复合体; Nir表示亚硝酸还原酶; NOD表示NO歧化酶; pMMO表示颗粒性甲烷单加氧酶; UbqO表示泛醌氧化酶图 3 M. oxyfera的中心代谢和能量代谢 [30] Fig. 3 Central catabolism and energy metabolism of M. oxyfera

总之，内产氧机制能较好地解释N-DAMO反应中甲烷氧化耦合亚硝酸盐还原机制，但遗憾的是N-DAMO反应的关键酶NOD至今仍未被分离和纯化. 为此，N-DAMO反应的内产氧机制还需进一步的研究证实.

5 生态学特征

N-DAMO反应发生的前提条件是甲烷和亚硝酸盐/硝酸盐的共存及缺氧的环境^[31]. 沉积物和湿地土壤等由于长期水淹具有好氧/缺氧界面，同时沉积物和土壤含有丰富的有机质，其分解过程会释放出甲烷，硝化和反硝化等生物过程又可释放出中间代谢产物亚硝氮，是发生N-DAMO反应的合适生境. 迄今已有不少研究者报道了M. oxyfera在不同生境类型中的分布，如湖泊沉积物^{[32, 33, 34]}、 水库水体^[35]、 河流沉积物^[36]、 海洋沉积物^{[37, 38]}和湿地土壤^{[17, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45]}等. 最近，研究者通过¹³C稳定同位素示踪手段证实不同湿地类型(包括下渚湖天然湿地、 城市次生湿地西溪湿地和水稻田湿地)中均存在N-DAMO反应^{[41, 42, 44]}. 基于测得的N-DAMO的稳定同位素活性数据，Hu等^[41]推测全球湿地系统中由N-DAMO反应所致的甲烷氧化量可高达4.1~6.1 Tg，约占当前全球湿地甲烷排放总量的2%~6%，证实了N-DAMO是湿地系统中被忽视的甲烷汇，其对全球温室气体甲烷减排具有潜在的重要意义. 从目前M. oxyfera的分布特征来看，其主要分布于具有稳定环境条件的湖泊深层沉积物^{[32, 33]}和湿地深层土壤^{[17, 39, 40, 41, 42, 43, 44]}. 研究还发现，某些环境因子(如亚硝酸盐/硝酸盐浓度、 甲烷浓度、 有机碳浓度、 温度和盐度等)对自然生境中M. oxyfera的分布和生物活性有重要影响^{[36, 37, 38, 39, 41, 42, 44]}. 目前对M. oxyfera的生态学研究主要依赖分子生物学手段，包括聚合酶链式反应(PCR)、 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和荧光原位杂交(FISH)等. M. oxyfera生态学研究中常用的PCR引物见表 3.

表 3(Table 3)

表 3 M. oxyfera生态学研究常用的PCR引物 Table 3 PCR primers usually used in ecological research of M. oxyfera 引物 序列(5′-3′) 特异性 文献 8F GACCAAAGGGGGCGAGCG 细菌16S rRNA [46] 1043R TCTCCACGCTCCCTTGCG M. oxyfera 16S rRNA [18] 202F GACCAAAGGGGGCGAGCG M. oxyfera 16S rRNA [18] 1545R CAKAAAGGAGGTGATCC 细菌16S rRNA [44] NC10-202Fdeg RACCAAAGGRGGCGAGCG M. oxyfera 16S rRNA [32] NC10-1043Rdeg TCTCCRCGYTCCCTTGCG M. oxyfera 16S rRNA [32] qP1F GGGCTTGACATCCCACGAACCTG M. oxyfera 16S rRNA [18] qP1R CGCCTTCCTCCAGCTTGACGC M. oxyfera 16S rRNA [18] qP2F GGGGAACTGCCAGCGTCAAG M. oxyfera 16S rRNA [18] qP2R CGCCTTCCTCCAGCTTGACGC M. oxyfera 16S rRNA [18] A189_b GGNGACTGGGACTTYTGG M. oxyfera pmoA1) [47] cmo682 AAAYCCGGCRAAGAACGA M. oxyfera pmoA [47] cmo182 TCACGTTGACGCCGATCC M. oxyfera pmoA [47] cmo568 GCACATACCCATCCCCATC M. oxyfera pmoA [47] A189 GGNGACTGGGACTTCTGG pmoA [48] 682_NC10 AAATCCGGCGAAGAACGA M. oxyfera pmoA [33] NA638Rdeg RAATGTTCGRAGCGTVCCBC M. oxyfera pmoA [32] NA720R TCCCCATCCACACCCACCAG M. oxyfera pmoA [32] HP3F1 CCCAGTACTTCATGTGGGARAARAT M. oxyfera pmoA [40] HP3R1 GGGGGCCAGCCANRYCCARTT M. oxyfera pmoA [40] 1)pmoA：pMMO酶α编码基因

表 3 M. oxyfera生态学研究常用的PCR引物 Table 3 PCR primers usually used in ecological research of M. oxyfera

(1)N-DAMO反应是微生物碳氮循环的革命性发现，它的发现对于认识碳氮生物地球化学循环，丰富微生物学内容，研发新型生物脱氮除碳工艺均具有重要意义. 近年来对于N-DAMO反应的功能微生物M. oxyfera的研究取得了许多突破性成果，初步探明了M. oxyfera的个体形态特征、 细胞化学组分特征、 富集培养特征、 生理生化特征和生态学特征，并提出了N-DAMO反应的内产氧代谢机制.

(2)由于M. oxyfera生长极其缓慢，至今尚未获得纯培养，为此需要继续对M. oxyfera进行富集培养，以期获得M. oxyfera的纯培养或更多的高纯培养物，并重点开展以下研究：①分离和纯化N-DAMO反应的关键酶(尤其是NOD)，进一步搞清M. oxyfera的生理生化特性和内产氧代谢途径; ②寻找获得高活性M. oxyfera富集培养物的限制因子，缩短M. oxyfera的富集培养时间，研发经济环保的新型生物脱氮除碳工艺; ③建立完善的M. oxyfera分子生态学研究方法，探明其在自然生态系统中的分布特征，确定此类微生物在碳氮生物地球化学循环和温室气体甲烷减排中的贡献.