近年来一些对映体纯或对映体富集的农药制剂得到发展和应用，如S-异丙甲草胺(S-metolachlor)已实现商品化生产，许多国家包括我国已用S-异丙甲草胺取代外消旋异丙甲草胺的生产使用，其生态毒性也随之受到关注^[1]，研究发现异丙甲草胺对微藻细胞的急性毒性存在立体选择性差异且S-异丙甲草胺的毒性更大^[2]. 镉作为毒性最强的重金属元素之一，可与酶活性中心或蛋白质中的疏水基结合，还可取代金属硫蛋白中的必须元素(Ca²⁺、 Fe²⁺、 Mg²⁺、 Zn²⁺)，导致生物大分子构相改变，必须元素缺乏，干扰细胞正常代谢过程^[3]，还会抑制斜生栅藻和栅列藻的生长，影响光合作用等^[4].

随着工业的发展，进入环境的污染物种类和数量明显增多，国内外学者在污染物复合污染方面进行了广泛研究并取得了重要成果^{[5, 6, 7, 8, 9]}，然而在有机-无机复合污染中手性农药和重金属复合污染研究方面亟待深入. 斜生栅藻是单细胞生物，具有生长周期短、 易获得、 对毒物敏感、 培养方便等特点，是水生毒理研究中较理想的测试生物^[10]. 本文以斜生栅藻为指示生物，研究了Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻的急性毒性、 蛋白含量、 超氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞通透性的影响，以期为全面合理评价Cd²⁺与S-异丙甲草胺的生态毒性提供理论依据.

斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学院水生生物研究所，培养基采用水生4号(HB-4)人工培养液，恒温光照培养^[11].

S-异丙甲草胺购自先正达(瑞士)公司，纯度为96%; 氯化镉(CdCl₂)购自国药集团化学试剂有限公司，为分析纯; 其他试剂、 药品均为分析纯. 水为二次亚沸蒸馏水.

根据有毒化学品对藻类毒性测试的标准实验方法^[12]，结合预实验结果，设置Cd²⁺和S-异丙甲草胺浓度均分别为0、 0.02、 0.05、 0.10、 0.15、 0.20和0.50 mg ·L^-1，进行单独及联合培养，每组设置3个平行; 分别于24、 48、 72、 96 h用可见光分光光度计测定藻液在680 nm处的吸光值，由藻细胞密度和光密度之间的线性关系得到藻细胞密度，计算生长抑制率，通过Logistic 模型进行拟合得到EC₅₀值. 采用毒性单位法^[13]和相加指数法^[14]对Cd²⁺与S-异丙甲草胺的联合毒性进行分析.

设置Cd²⁺与S-异丙甲草胺浓度分别为0、 0.02、 0.1和0.2 mg ·L^-1，每组3个平行. 取暴露96 h后的斜生栅藻，在4℃下6 000 r ·min^-1离心10 min，弃去上清液，加入10 mL预冷的0.05 mol ·L^-1 磷酸缓冲液混匀，超声破碎仪破碎15 min后在4℃下15 000r ·min^-1离心10 min，上清液为酶液. 采用Brandford法测定总可溶性蛋白含量^[15]. SOD活性的测定采用氮蓝四唑法(NBT法)^[16].

设置Cd²⁺与S-异丙甲草胺浓度分别为0、 0.02、 0.1和0.2 mg ·L^-1，每组3个平行. 采用荧光素二乙酸酯(FDA)荧光色素染色法^[17]进行测定.

实验数据使用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0进行处理，用SPSS 15.0进行单因素方差分析(ANOVA)并用Duncan法进行显著性检验，结果以平均值±SD表示.

不同浓度Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用下，斜生栅藻细胞密度均明显低于空白组(P<0.05)，说明两者单独及联合作用均对斜生栅藻细胞的生长有显著的抑制作用. 由表 1可知，Cd²⁺与S-异丙甲草胺对斜生栅藻单独及联合作用的EC₅₀值均表现为随着处理时间的延长而减小，Cd²⁺、 S-异丙甲草胺、 0.02 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺+Cd²⁺、 0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺+Cd²⁺的EC_50-24h分别为0.27、 0.24、 0.27和0.16 mg ·L^-1，EC_50-96h分别为0.16、 0.13、 0.12和0.20 mg ·L^-1，表明Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻的急性毒性随着处理时间的延长而增大. 同一处理时间内，Cd²⁺单独作用对斜生栅藻的EC₅₀值均大于S-异丙甲草胺单独作用的EC₅₀值，说明Cd²⁺对斜生栅藻的急性毒性小于S-异丙甲草胺.

表 1(Table 1)

表 1 Cd2+与S-异丙甲草胺复合污染的EC50值1)Table 1 EC50 values of Cd2+ and S-metolachlor combined pollution 暴露时间/h 浓度/mg ·L-1 A1 A2 EC50 R2 P 24 Cd -1.80 98.4 0.27 0.998 1 3.89 S2) -4.05 75.6 0.24 0.999 7 4.81 0.02S+Cd 8.83 81.8 0.27 0.979 5 1.42 0.1S+Cd 10.4 64.0 0.16 0.989 6 3.00 48 Cd 9.99 85.0 0.17 0.995 3 2.25 S -10.1 92.6 0.16 0.987 6 6.04 0.02S+Cd 38.5 84.2 0.17 0.981 7 2.90 0.1S+Cd 20.2 80.9 0.15 0.999 2 4.01 72 Cd 9.32 95.2 0.16 0.980 6 2.01 S -2.32 97.9 0.14 0.985 9 3.42 0.02S+Cd 30.7 93.3 0.14 0.981 4 1.66 0.1S+Cd 22.1 87.0 0.16 0.999 8 3.62 96 Cd 8.46 97.2 0.16 0.976 4 2.02 S -2.68 97.5 0.13 0.960 8 3.94 0.02S+Cd -4.40 108.5 0.12 0.998 6 1.40 0.1S+Cd 22.0 94.2 0.20 0.998 6 2.65 1)Logistic 模型：y=A2+(A1-A2)/[1+(x/EC50)P]; 式中，y表示有毒物质对斜生栅藻细胞的生长抑制率(%)，x表示有毒物质的浓度，数据由Origin 8.0软件计算所得; 2)S为S-异丙甲草胺，下同

表 1 Cd2+与S-异丙甲草胺复合污染的EC50值1)Table 1 EC50 values of Cd2+ and S-metolachlor combined pollution

分别采用毒性单位法和相加指数法对Cd²⁺与S-异丙甲草胺的联合毒性进行了评价. 由表 2可知，低浓度Cd²⁺与低浓度S-异丙甲草胺的联合毒性表现为协同作用，M <1，同时AI>0; 高浓度Cd²⁺与S-异丙甲草胺的联合毒性表现为拮抗作用，高浓度S-异丙甲草胺与Cd²⁺的联合毒性也表现为拮抗作用，M＞M0，同时AI<0. 在评价0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺与0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺的联合毒性时，两种方法得到的结论出现不一致的现象，毒性单位法得M0＞M＞1，为部分相加作用，而相加指数法AI<0为拮抗作用. 已有研究通过实验和评价结果发现，不同评价方法对同一实验结果的毒性评价可能不同，但多数评价结论是相同的^[18]. 总体而言，低浓度Cd²⁺与低浓度S-异丙甲草胺的联合毒性为协同作用，高浓度Cd²⁺与高浓度S-异丙甲草胺的联合毒性为拮抗作用.

表 2(Table 2)

表 2 Cd2+与S-异丙甲草胺的联合毒性分析1)Table 2 Combined toxicity of Cd2+ and S-metolachlor 混合物 M M0 AI 作用类型 0.02Cd+0.02S 0.279 1.813 2.587 协同 0.10Cd+0.02S 0.779 1.246 0.284 协同 0.20Cd+0.02S 1.404 1.123 -0.404 拮抗 0.02Cd+0.1S 0.894 1.163 0.118 协同 0.10Cd+0.1S 1.394 1.813 -0.394 部分相加(拮抗) 0.20Cd+0.1S 2.019 1.615 -1.019 拮抗 0.02Cd+0.2S 1.664 1.081 -0.664 拮抗 0.10Cd+0.2S 2.164 1.406 -1.164 拮抗 0.20Cd+0.2S 2.789 1.812 -1.789 拮抗 1)毒性单位法(TU法)：M＜1为协同作用，M=1为简单相加作用，M0＞M＞1为部分相加，M= M 0为独立作用，M>M0为拮抗作用; 相加指数法(AI法)：AI>0为协同作用，AI=0为简单相加作用，AI＜0为拮抗作用

表 2 Cd2+与S-异丙甲草胺的联合毒性分析1)Table 2 Combined toxicity of Cd2+ and S-metolachlor

从图 1 可知单独作用时，藻细胞总蛋白含量随Cd²⁺浓度的升高而降低，且均低于空白组，分别是对照的80.84%、 69.18%和34.87%，其趋势与其对藻细胞密度的影响一致，说明Cd²⁺抑制了藻的生长从而导致蛋白含量的减少. 不同浓度S-异丙甲草胺单独作用时，藻细胞总蛋白含量分别是对照的104.50%、 55.05%和27.30%，0.02 mg ·L^-1处理组总蛋白含量略高于空白组，这可能是由于低浓度S-异丙甲草胺刺激了藻的生长. 在高浓度处理组S-异丙甲草胺对藻细胞总蛋白含量的影响高于Cd²⁺的影响.

图 1

Fig. 1

图例说明同表 1，下同图 1 Cd2+与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻总蛋白含量的影响Fig. 1 Combined effects of Cd2+ and S-metolachlor on the total protein content of S. obliquus

Cd²⁺与S-异丙甲草胺联合作用时藻细胞的总蛋白含量均明显低于空白组. 由图 1可知，总体而言当Cd²⁺浓度一定时，与S-异丙甲草胺联合作用对藻细胞蛋白含量的影响随着S-异丙甲草胺浓度的升高而降低; 当S-异丙甲草胺浓度一定时，与Cd²⁺联合作用对藻细胞蛋白含量的影响随着Cd²⁺浓度的升高而降低. 0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺处理下，与0.1 mg ·L^-1和0.2 mg ·L^-1 Cd²⁺联合作用时总蛋白含量均高于0.02 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺处理下与Cd²⁺联合作用时的总蛋白含量，总蛋白含量分别为60.85 mg ·L^-1、 38.75 mg ·L^-1以及48.34 mg ·L^-1、 23.07 mg ·L^-1，表现出在0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺处理下与0.1 mg ·L^-1和0.2 mg ·L^-1 Cd²⁺联合作用对藻细胞总蛋白含量的影响产生了拮抗作用，这与联合毒性分析结果一致. 0.2 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺处理藻细胞总蛋白含量均较小，没有明显变化，这可能是由于高浓度S-异丙甲草胺对藻细胞的抑制作用已经较大，添加Cd²⁺对藻细胞总蛋白含量影响所起的联合毒性作用不明显.

逆境胁迫下植物细胞会产生过多的活性氧自由基(ROS)，包括过氧化氢(H₂O₂)、 基态氧(¹O₂)、 超氧阴离子自由基(O^·-₂)和羟自由基( ·OH)等，而生物则会启动自身细胞内的抗氧化系统清除多余的活性氧自由基以防止细胞损伤. 在酶促过程中SOD是清除自由基的重要酶之一，将毒性较强的O^·-₂转化为毒性次级的H₂O₂和基态氧，减少 ·OH的生成，常被作为评价抗氧化水平的有效生物指标^[19].

从图 2可知单独作用时SOD酶活性随Cd²⁺浓度的升高而下降，分别为3.56、 2.51和1.45 U ·mg^-1; SOD酶活性随S-异丙甲草胺浓度的升高呈先增大后减小、 先刺激后抑制的趋势，分别为3.12、 5.69和1.23 U ·mg^-1. 0.02 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺和0.02 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺联合作用对SOD酶活性的刺激作用大于其单独作用，SOD酶活性分别为空白组的2.12倍(0.02 mg ·L^-1 Cd²⁺+0.02 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺)、 2.26倍(0.02 mg ·L^-1 Cd²⁺+0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺)、 1.43倍(0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺+0.02 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺)和1.56倍(0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺+0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺). 根据联合毒性分析，0.02 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺和0.02 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺联合作用属于协同作用或部分相加作用，氧化应激响应使SOD酶活性增加以清除更多的自由基. 0.2 mg ·L^-1 Cd²⁺或0.2 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺联合作用对SOD酶活性抑制作用明显，这可能是由于高浓度作用下藻细胞生长抑制率较大，导致大量自由基生成从而细胞的抗氧化酶活性下降.

图 2

Fig. 2

图 2 Cd2+与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻SOD酶活性的影响Fig. 2 Combined effects of Cd2+ and S-metolachlor on the SOD activity of S. obliquus

SOD激活说明有毒物质的存在使藻细胞内产生了氧化应激反应，随着有毒物质浓度的升高酶活性被抑制，产生的过量自由基会转化为毒性更强的 ·OH，从而导致细胞大分子或其结构的破坏，被破坏的大分子中可能包括蛋白酶类等，如藻细胞内的总可溶性蛋白和SOD酶蛋白，而这些蛋白含量的减少会造成抗氧化能力的下降. 这与Liu等^[20]研究得到的异丙甲草胺对蛋白核小球藻的CAT酶活性影响结果一致.

由图 3可知，各处理组藻细胞膜通透性均高于对照组，说明Cd²⁺与S-异丙甲草胺的存在破坏了藻细胞膜的完整性. 单独作用下，藻细胞膜通透性随S-异丙甲草胺浓度的增加而逐渐增大，各浓度处理组藻细胞通透性分别是对照组的1.11、 3.73、 29.81倍; Cd²⁺单独作用时呈现相同的趋势，各浓度处理组藻细胞通透性分别是对照组的0.91、 4.0、 10.87倍. 说明Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独作用对斜生栅藻细胞通透性的影响与其各自浓度呈正相关效应，且S-异丙甲草胺对藻细胞膜通透性的影响显著大于Cd²⁺的影响. Cd²⁺浓度一定时，随着S-异丙甲草胺浓度的增加，藻细胞膜通透性增加，与0.02 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺联合作用处理组藻细胞内产生荧光信号的强度与Cd²⁺单独处理组相比增强不明显，与0.2 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺联合作用处理组荧光信号强度明显增强，细胞膜通透性明显增大，分别是对照组的20.78、 23.55和12.60倍; 当S-异丙甲草胺浓度一定时，随着Cd²⁺浓度升高，荧光信号强度增强，细胞膜通透性增大.

Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用下，藻细胞膜通透性随有毒物质浓度的升高呈逐渐增大的趋势，该过程使细胞内各种物质正常的运输过程遭到干扰，增大了污染物透过细胞膜进入细胞内部的可能性. 研究认为污染物等逆境胁迫下生物细胞内过量ROS的产生可能会使细胞膜完整性受损^{[21, 22, 23]}. 有毒物质对藻类的毒害作用是由于对藻细胞膜的破坏导致细胞膜通透性增加，使环境中的有毒物质能顺利进入细胞，并与细胞中有生命活性的物质发生反应，干扰或破坏了细胞正常的代谢^[24,25].

图 3

Fig. 3

图 3 Cd2+与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻的细胞通透性影响Fig. 3 Combined effects of Cd2+ and S-metolachlor on the cellular membrane permeability of S. obliquus

(1) Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独作用对斜生栅藻的EC₅₀均随着暴露时间的延长而减小，且S-异丙甲草胺毒性大于Cd²⁺; Cd²⁺与S-异丙甲草胺联合作用时低浓度表现为协同作用，高浓度表现为拮抗作用.

(2) Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用下，斜生栅藻细胞总可溶性蛋白含量随有毒物质浓度的升高而降低; Cd²⁺单独作用的影响大于S-异丙甲草胺单独作用的影响.

(3) Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用下，斜生栅藻细胞SOD酶活性随有毒物质浓度的升高呈先激活后抑制的趋势; 高浓度Cd²⁺或高浓度S-异丙甲草胺联合作用对SOD酶活性的抑制作用明显.

(4) Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻细胞膜通透性的影响总体呈逐渐增大的趋势; S-异丙甲草胺单独作用的影响大于Cd²⁺单独作用的影响; 在高浓度S-异丙甲草胺条件下，Cd²⁺与S-异丙甲草胺复合作用对藻细胞膜通透性的影响逐渐减弱.